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(共40张PPT)
专题24　基因工程
新高考生物一轮专题复习
考点　基因工程
知识1　基因工程(重组DNA技术)的基本工具
一、限制性内切核酸酶(限制酶)
来源 主要来自原核生物
种类 目前已分离出数千种
作用 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
结果 当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时,产生的是黏性末端
当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时,产生的是平末端
知识拓展
1.原核生物的限制酶不切割自身DNA,原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经
被修饰。
2.同尾酶
(1)定义:识别DNA分子中不同核苷酸序列,但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
(2)意义:构建载体时,同尾酶使切割位点的选择范围扩大。
二、DNA连接酶
种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只“缝合”黏性末端 “缝合”黏性末端和平末端
作用 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 易混易错 DNA聚合酶、DNA连接酶与DNA酶
1.DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸加到已有的核酸片段的3'端,与3'端的羟基形成磷酸二酯键。
2.DNA连接酶催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。
3.DNA酶催化DNA水解为脱氧核苷酸。
三、载体
条件 ①能在受体细胞中进行自我复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA 同步复制;
②具有一个至多个限制酶切割位点;
③具有标记基因
种类 质粒(最常用)、噬菌体、动植物病毒等
作用 携带外源DNA进入受体细胞
注意 天然的质粒一般不完全具备上述条件,往往需要进行人工改造后才能用作基因工程载
体。
1.(2018北京理综,5)限制性内切核酸酶可识别并酶切单链DNA。 (　 )
答案
2.(2021全国乙,38)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　
　　　　　　　 。
答案　磷酸二酯键
3.(2020江苏,33)EcoRⅠ是一种　　　 酶,它通过识别特定的　　　　 切割特定位点。
答案　限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列
4.(2017全国Ⅰ,38)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用　
　 作为载体,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 。
答案　噬菌体　噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕
5.(2016全国Ⅲ,40)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有　　　　 和　　　 ,
其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是　　　 。
答案 E.coli DNA连接酶　T4 DNA连接酶　T4 DNA连接酶
针对训练
知识2　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增与电泳鉴定
一、DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
(1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精;DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,其能溶于
2 mol·L-1的NaCl溶液。
(2)在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2.操作流程
易混易错
1.过滤时应选用纱布而不是滤纸,如果用滤纸可能会把DNA分子吸附在滤纸上。
2.低温操作能防止DNA酶降解DNA。
3.粗提取的DNA可能含有核蛋白、多糖等杂质。
二、DNA片段的扩增——PCR扩增
1.PCR的原理:DNA半保留复制。
2.PCR所需的基本条件
(1)DNA模板:提供DNA复制的模板。
(2)4种脱氧核苷酸:合成 DNA子链的原料。
(3)耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶):催化合成DNA子链。
(4)引物(2种):一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。DNA聚合酶能够从
引物的 3'端开始连接脱氧核苷酸。
注意
1.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR缓冲溶液中一般要添加Mg2+。
2.PCR过程无需解旋酶,高温可使双链DNA解聚为单链。
3.PCR过程不需要ATP,在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作
为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。
3.PCR反应过程
(1)变性:温度>90 ℃,双链DNA解聚为单链。
(2)复性:50 ℃左右,两种引物与两条单链DNA结合。
(3)延伸:72 ℃左右,合成子链。
过程图为:
　　由图可知,理论上通过三次循环可以得到目的基因。
疑难探究
思考 PCR可以扩增mRNA吗
提示 mRNA不可以直接扩增,需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。

4.PCR的结果
(1)合成DNA的数量:a×2n(a:初始数量;n:循环的次数)。
(2)合成目的基因的数量:a×(2n-2n)。
5.PCR产物的鉴定
(1)方法:琼脂糖凝胶电泳,可观察到目的条带。
(2)异常分析
①未出现扩增条带的可能原因:模板DNA含有杂蛋白或Taq DNA聚合酶的抑制剂;Taq DNA聚合
酶失活;引物出现质量问题;引物浓度不合适;M 浓度过低;变性温度过低;变性时间过短等。
②出现非特异性扩增条带可能的原因:模板DNA出现污染;Taq DNA聚合酶出现质量问题;引物特
异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体;M 浓度过高;复性时的温度过低;PCR
循环次数过多等。
知识拓展　引物的选择原则
1.引物长度适宜、适量的CG含量(保证有较高的复性温度)、引物自身及引物之间不存在互补配对、引物的3‘端必须和DNA模板严格互补配对,5’端不需要与DNA模板严格互补配对,5‘端可以修饰。
5'端修饰方法 作用
加入限制酶酶切位点 可以利用限制酶切割产生末端,方便基因重组
放射性同位素、生物素、荧光素等标记物 方便扩增产物的检测
增添、缺失或替换部分碱基 可以产生定点突变
2.PCR循环一次需要两种引物,分别与两条模板链的3'端互补,可扩增出两个引物之间的片段。
3. 引物位于目的基因两侧。
三、DNA片段的电泳鉴定
1.原理
(1)DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作
用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。
(2)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。一般,DNA分
子越大,迁移速率越慢,距加样孔越近。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外
灯下被检测出来。
2.过程
注:M为指示分子大小的标准参照物。
3.电泳结果
6.(2022山东,13)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。
(　 )
答案　√
7.(2022湖北,5)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。 (　 )
答案
8.(2022辽宁,12)PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。 (　 )
答案
9.(2019江苏,10)用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热。 (　 )
答案　√
针对训练
10.(2022全国乙,38)(1)检测病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先
以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是　　　　　 ,再通过PCR技术扩增相应的
DNA片段。
(2)为了确保病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据病毒RNA中的　　　　　　　
　　 来进行。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步是　　　　　　 。
答案 (1)逆转录酶 (2)特异性核苷酸序列　复性
11.(2020山东,25)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响,科研人员需要检测Wx基因转录产生的
mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经　　　 过程获得总cD-
NA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA,原因是　　　　　　　　
　　　　　　　　 。
答案　逆转录　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或:引物能与Wx基因的cDNA特
异性结合)
12.(2019全国Ⅰ,38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是　　　 。在体外利用PCR技术扩增
目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是　　　　　　　　 。上述两个解链
过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的　　　 。
(2)目前在PCR中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 。
答案 (1)解旋酶　加热至90~95 ℃　氢键 (2)Taq DNA聚合酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合
酶在高温下会失活
13.(2018江苏,32)(1)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的　　　 端加上限制
性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 。
(2)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中　　　 的设定与引物
有关,　　　 的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度　②复性温度　③延伸温度　④变性时间　⑤复性时间　⑥延伸时间
答案 (1)5'　使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连 (2)②　⑥
14.如图,应选择引物　　　 扩增目的基因。
答案　甲和丙
15.如图为RBD基因结构和引物位置示意图,若利用PCR扩增含有限制酶酶切位点的RBD基因时,应
选择的引物为　　　　 。
答案　引物4和引物5
知识3　基因工程的基本操作程序
一、目的基因的筛选与获取
1.目的基因:主要指能编码蛋白质的基因,如Bt抗虫蛋白基因等。
2.筛选:从已知结构、功能清晰的基因中筛选是较为有效的方法之一。
3.获取目的基因
方法 获取目的基因
方法1 通过化学合成法直接人工合成
方法2 可从基因文库中获取
方法3 PCR
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
1.目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并可遗传给下一代;同时使目的基因能够表达和发挥
作用。
2.基因表达载体的构成

知识归纳
1.有时为了满足需要,会在载体中人工构建诱导型启动子,当诱导物存在时,可以激活或抑制目的基
因的表达。
2.构建乳腺生物反应器的表达载体时,重组表达载体中需含有在乳腺中特异性表达的启动子,以便
目的基因在乳腺中特异性表达,从而可在动物的乳汁中获得目的蛋白。
易混易错 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
位置 DNA DNA mRNA mRNA
目的基因上游 目的基因下游 编码序列首端三
个碱基 编码序列尾端三
个碱基
作用 RNA聚合酶识别
和结合的部位,起
始基因的转录 使转录停止 翻译的起始信号
(编码氨基酸:甲硫
氨酸) 翻译的结束信号
(不编码氨基酸)
3.构建过程

知识拓展
思考 构建基因表达载体时,常使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒,该过程不使用同一
种限制酶的原因是什么
提示 防止目的基因自身环化和质粒自身环化,保证目的基因与质粒正确连接。因为同种限制酶酶
切产生的末端相同,会产生正连和反连(反连时,目的基因的转录从下游到上游,导致密码子改变,不
能翻译出正确的蛋白质)的情况,增大筛选正确重组载体的工作量。 正连和反连图示如下:
方法技巧

图甲 图乙
结合图甲、图乙可知:最宜选用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。
注:若用Ti质粒,目的基因必须插入T-DNA序列。
三、将目的基因导入受体细胞
1.植物细胞:农杆菌转化法、花粉管通道法。
2.动物细胞(受精卵):显微注射法。
3.原核细胞:常用Ca2+处理原核细胞,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后将
重组的基因表达载体导入细胞。
疑难突破
　　农杆菌细胞内含有Ti质粒,当农杆菌侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的
细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
注意 导入的目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体
DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。
四、目的基因的检测与鉴定
1.分子水平

2.个体生物学水平:抗性实验。
16.(2022全国乙,38)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异
性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗,可以通过基因工程技术获得大
量蛋白S。基因工程的基本操作流程是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　 。
答案　获得目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
17.(2022湖北,24)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体,其目的是　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　 。
答案　通过农杆菌的转化作用,使目的基因进入植物细胞
针对训练
18.(2021辽宁,24)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使其处于　　　　　　　　　　　　　
的生理状态,以提高转化效率。
答案　一种能吸收周围环境中DNA分子
19.(2020北京,17)C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向为5‘→3’。为了使C1
酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接,克隆C1酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和
BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图中酶切位点1和2所对应的酶分别是
　　　　　　　　　　 。
答案 BamHⅠ、SmaⅠ
20.(2016全国Ⅰ,40)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活
(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,
与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化
大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状
目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。

如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目
的基因的细胞是不能区分的,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
;并且　　　　　　　　　 和　　　　　　　 的细胞也是不能区分的,其原因是　　　
　　　　　　　　　　　　 。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒
的大肠杆菌单菌落,还需使用含有　　　 的固体培养基。
答案　二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了
目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能
生长　四环素
知识4　蛋白质工程
一、蛋白质工程的概念

疑难探究
思考 蛋白质工程中为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造
提示 蛋白质一般具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容易改造;改造后的基因可以遗
传给下一代,而直接改造蛋白质无法遗传。
二、蛋白质工程的基本思路

易混易错 蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质。
21.(2022湖南,22)蛋白质工程流程如图所示,物质a是　　　 ,物质b是　　　 。在生产过程中,
物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　 。
针对训练
答案　多肽链　mRNA　mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性

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