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第2节 微生物的培养技术及应用
01
微生物的基本培养技术
WEISHENGWUDEJIBENPEIYANGJISHU
教学目标
1. 概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求,进行酵母菌的纯培养。
2. 阐明微生物选择培养的原理。
3. 进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
传统发酵技术的缺点
菌种差异、杂菌情况不明、发酵过程的控制缺乏标准等，往往会造成发酵食品的品质不一。
为了缩短发酵时间，确保品质稳定，工业上大规模生产时，通常先通过微生物培养技术获得单一菌种，再将它们接种到物料中进行发酵。
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
本节聚焦
1.什么是培养基？如何配置？
2.什么是无菌技术？
3.怎样进行酵母菌的纯培养？
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。在实验室培养微生物，一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；另一方面要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
（一）微生物
难以用肉眼观察的微小生物的统称。
1.概念
2.微生物的类群
（1）无细胞结构
（2）原核细胞
（3）真核细胞
病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；
放线菌：链霉菌等
真菌：酵母菌、毛霉等；
原生生物：草履虫、变形虫等
3.微生物的结构
（一）微生物
直径在30～200nm之间
直径在0.5～5μm之间
直径3～6μm之间
～
～
~
微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想看某种纯净的微生物。我们该怎么做？若想通过肉眼能看到细菌，我们又该如何？
必须对其进行分离纯化；
对微生物进行大量培养，致使其在培养基表面或内部形成菌落。不同的细菌具有不同的菌落。
分散的微生物在适宜的琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。
沙门氏菌
毛霉
（一）微生物
2.实验室培养微生物条件
（1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件。
——培养基
（2）确保其它微生物无法混入。
——无菌技术
（二）培养基的配制
1.培养基概念
2.培养基作用
2.作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
1. 培养基的概念
培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
固体
培养基
液体
培养基
有无琼脂
长有酵母菌菌落
盛有液体培养基
分离、计数、鉴定等
扩大培养、用于工业生产
（二）培养基的配制
3.培养基的营养构成
3.基本成分
水、碳源、氮源和无机盐
① 碳源
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-等
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
② 氮源
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
③ 无机盐
Ca、K 、Mg等为大量元素
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等为微量元素
*一般情况下，不添加氮源培养基可用来培养_____微生物
固氮
补充说明：
① 含有C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源。
② 自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源。
③ 自养型微生物所需的碳源来自无机碳源，异养型微生物所需的碳源来自有机碳源，因此可以根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。
④ 无机氮源不但能给自养型微生物提供氮源，也能作为能源物质，如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）。
⑤ 无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌）。
旁栏思考题：
为什么培养基需要氮源？
培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
（二）培养基的配制
4.培养基的营养构成
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5 g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10 g 氮源和维生素等
NaCl 5 g 无机盐
H2O 定容至 1 000ml 水
牛肉膏和蛋白胨来源与动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
（二）培养基的配制
5.培养基的特殊需求
在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对___、____________以及___的需求；
pH
特殊营养物质
O2
微生物例子 培养基需要的特殊物质或条件
乳酸杆菌
霉菌
细菌
厌氧微生物
添加维生素
调至酸性
调至中性或弱碱性
提供无氧的条件
现学现用：
下列四种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，正确的是( )
A.硝化细菌 B.乳酸菌
C.酵母菌 D.衣藻
硝化细菌 乳酸菌 酵母菌 衣藻
能源 氧化NH3 分解乳酸 固定N2 利用光能
碳源 CO2 糖类 糖类 CO2
氮源 NH3 N2 N2 NO3-
代谢类型 自养需氧型 异养需氧型 异样需氧型 自养需氧型
A
划分 培养基种类 特点 用途
物理 性质
化学 成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、分类鉴定。
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物。
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
天然培养基
合成培养基
鉴别培养基
（二）培养基的配制
4.培养基的类型
具体处理 原理 目的
选择培养基 加入青霉素 青霉素能抑制细菌生长， 对真菌无作用
不加氮源 固氮微生物能利用空气中的氮气
不加有机碳源 自养型微生物能利用无机碳源
鉴别培养基 加入酚红培养基 尿素被分解产生氨，培养基呈碱性，酚红指示剂变红。
加入刚果红 刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。
拓展练习：
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养微生物
鉴别分解尿素的细菌
鉴别纤维素
分解菌
思考：
是否所有培养基都必须添加碳源、氮源？
不是；
例如分离固氮菌不需要额外添加氮源，其可以直接利用空气中的氮气。
（三）无菌技术
1.获得纯净的微生物培养物的关键：______________
2.无菌技术应围绕________________展开，主要包括消毒和灭菌。
3.无菌技术工作两个方面*
①对操作的____、操作者的____和____进行_____和_____；
②对用于微生物培养的_____、________和______等进行_____；
*做好消毒灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
*为避免周围环境中微生物的污染，许多操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
防止杂菌污染
如何避免杂菌的污染
空间
衣着
手
清洁
消毒
器皿
接种用具
培养基
灭菌
思考：
无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。
2.常用的消毒和灭菌方法
（1）消毒
① 概念
使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。
类型 适用范围 操作方法
消 毒
较为温和理化生方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）。
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s～1min
化学药物
生物活体、水源等
用酒精擦拭双手、
用氯气消毒水源
紫外线照射
紫外线照射30min
接种室、接种箱，
超净工作台。
② 常用的消毒方法
2.常用的消毒和灭菌方法
（2）灭菌
① 概念
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
② 灭菌的方法
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
（2）灭菌
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。
优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。
对象：培养基等
注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。
① 湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121℃下维持15～30min。
高压蒸汽灭菌锅
2.常用的消毒和灭菌方法
（2）灭菌
原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和
原生质干燥等。
对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于
玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器)
金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌。
② 干热灭菌：干热灭菌箱内160～170 ℃下加热2～3h。
2.常用的消毒和灭菌方法
干热灭菌箱
（2）灭菌
③ 灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧
效果：最彻底
原理：使微生物燃烧
对象：接种工具如接种环、
接种针，以及接种过程中的
试管口或瓶口等易被污染部位。
2.常用的消毒和灭菌方法
类型 适用范围 操作方法
灭 菌
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）。
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,
160～170℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基、培养皿等，生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,
100kPa，温度121℃,
15～30min。
常用的灭菌方法（小结）
（三）微生物的纯培养
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
1.概念
2.步骤
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养等
酵母菌的纯培养
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
微生物群
分散或稀释
单个细胞
繁殖
单菌落
酵母菌的纯培养
目的要求
1.学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。
2.学会进行无菌操作。
3.尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。
材料用具
酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸(或报纸)、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。
2.步骤
（1）制备培养基
配制
培养基
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15~20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15~30min。将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。
倒平板
待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
倒平板的具体操作步骤
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置
①拔出锥形瓶的棉塞
②将瓶口迅速通过火焰
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10-20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
（2）接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
连续划线法
分区划线法
平板划线的具体操作步骤
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
②在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌的棉塞。
③将试管口通过火焰
④将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液。
⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。
⑥左手在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
平板划线的具体操作步骤
1
2
3
4
5
灼烧接种环
蘸取菌液
第1区接种
灼烧接种环
第2区接种
灼烧接种环
第3区接种
第5区接种
注意：
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次。
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
酵母菌的纯培养
3.培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 28℃ 左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养 24 ~ 48h。
结果分析与评价
1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长 如果有,说明了什么
2.在接种酵母菌的培养基上,你是否观察到了单菌落 这些菌落的颜色、形状和大小是否一致 如果你观察到了不同形态的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的吗
3.你是如何记录实验结果的 请与其他同学交流、互评。
警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
酵母菌的纯培养
结果分析与评价
1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长 如果有,说明了什么
2.在接种酵母菌的培养基上,你是否观察到了单菌落 这些菌落的颜色、形状和大小是否一致 如果你观察到了不同形态的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的吗
3.你是如何记录实验结果的 请与其他同学交流、互评。
提示1：在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。
提示2：如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或无菌操作不规范等原因引起的。
（四）实验注意事项、分析、思考
1.培养基灭菌后为什么要冷却到50℃左右时开始倒平板？
2.为什么倒平板和接种整个过程要在酒精灯火焰旁进行？
3.倒平板时为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
4.在倒平板的过程中，若不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
琼脂是一种多糖，在44℃以下凝固，倒平板时，若低于50℃不及时操作，琼脂会凝固。
避免杂菌污染
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
不能；因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
5.为什么倒平板时，将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不能完全打开？
6.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
7.怎么确定所倒平板未被杂菌（主要是细菌）污染？
8.未接种的培养基直接培养起什么作用？
防止杂菌污染培养基
可避免培养基中的水分过快蒸发；可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
将未接种的空白培养基放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
做空白对照，若培养后培养基表面无菌落，则说明培养基没有污染。
9.若未接种的培养基表面出现菌落，说明了什么？
10.为什么在操作第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
说明培养基被污染，实验组的菌落中可能存在杂菌。
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞。
杀死接种环上原有微生物
11.在灼烧接种环之后，要等其冷却再进行划线，目的是什么？
12.除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？
13.为什么划线时要注意不能划破培养基？
避免温度过高杀死菌种
使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
①一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
②存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落
一、微生物的基本培育技术
评估论点的可信程度
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。
“酵素”是什么？水果“酵素”的制作原理是什么？水果“酵素”中可能含有哪些成分？它是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？水果“酵素”中的所有成分都有益于人体健康吗？
如果要更加有力地支持或反驳水果“酵素”有益健康的论点，应该怎样获取证据？
一、微生物的基本培育技术
评估论点的可信程度
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
练习与应用
一、概念检测
1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。 （ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。 （ ）
×
√
×
练习与应用
一、概念检测
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
二、拓展应用
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
提示（1）：培养皿和培养基。
提示（2）：接种。
练习与应用
二、拓展应用
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（3）从实验结果来看,洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
提示：通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
练习与应用
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同,意味着培养条件有什么不同？
二、拓展应用
提示：意味着培养液中02含量不同。
练习与应用
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
二、拓展应用
提示：培养液中02含量越高,酵母菌种群密度越大。
练习与应用
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
二、拓展应用
提示：这时候已经达到了环境容纳量。
练习与应用
谢谢
让课堂绽放魅力 让教育更加美好

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