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第1节 植物细胞工程
01
植物细胞工程的基本技术ZHIWUXIBAOGONGCHENGDEJIBENJISHU
教学目标
1. 阐明植物组织培养是在一定的条件下，将离体植物器官、组织和细胞在适宜的培养条件下诱导形成愈伤组织，并重新分化，最终形成完整植株的过程。
2. 概述植物体细胞杂交是将不同来源的植物体细胞在一定的条件下融合成杂种细胞，继而培育新植物体的技术。
3. 科学思维：说明植物组织培养和植物体细胞杂交的原理；以流程简图的形式表示植物组织培养技术和植物体细胞杂交的过程。
4. 科学探究：查阅资料，尝试探究植物生长素和细胞分裂素使用比例对植物组织培养的影响。
植物细胞工程的发展历程
1. 1902年，哈伯兰特（G.Haberlandt,1854-1945)提出了细胞全能性的理论，但相关的实验尝试没有成功。
2. 1958年，斯图尔德（E.C.Steward,1904-1993)等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
3. 1960年，科金（E.C.Cocking,1931-)用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
4. 1971年，卡尔森（P.S.Carlson,1944-2017)诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。1964年，古哈（S.Guha,1938-2007)等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
5. 1974年，土壤农杆菌的Ti质粒被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。
动物细胞工程（含胚胎工程）
1. 1890年，希普（W.Heape,1855-1929) 将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例。
2. 1907年，哈里森（R.G.Harrison,1870-1959)用一滴淋巴液
成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。
3. 1951年，张明觉（1908-1991)等发现了哺乳动物精子的获能现象。
4. 1958年，格登（J.Gurdon,1933-) 用非洲爪蟾进行体细胞核移植实验，成功培育出性成熟个体。同一时期，我国科学家童第周（1902-1979)等开展了鱼类细胞核移植工作。
5. 1959年，试管家兔诞生。之后，多种试管动物相继出生。1975年，米尔斯坦（C.Milstein,1927-2002)和科勒（G.Kohler,1946-1995)等创立了单克隆抗体技术。
动物细胞工程的发展历程
6. 1975年，米尔斯坦（C.Milstein,1927-2002)和科勒（G.Kohler,1946-1995)等创立了单克隆抗体技术。
7. 1978年，小鼠的桑甚胚被成功分割。次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵美羊。
8. 1996年，世界上第一只体细胞克隆羊多莉在英国诞生。随后多种克隆动物相继问世。
9. 1981年，埃文斯（M.J.Evans,1941-)等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞。
10. 2006年，山中伸弥（S.Yamanaka,1962-)等获得了诱导多能干细胞。我国科学家用这种细胞培育出了小鼠。
11. 2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。
12. 2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。
动物细胞工程的发展历程
“其茅葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨（dài）夫花开，凝晴滚露，万态千妍，薰（xūn）风自来，四坐芬郁，岂非入兰室乎！岂非有国香乎！”这是我国历史上第一部兰谱——《金漳（zhānɡ）兰谱》（宋·赵时庚）中对兰花的一段描述。从古至今，我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征，很多人喜欢养兰花。但是，兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？
从社会中来
利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花。
兰花是观赏植物中最常见的一类依靠植物组织培养繁育种苗的植物，其组培苗的数量约占观赏植物组培苗总量的40%。
1.细胞工程的概念
细胞工程（cell engineering)是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞或细胞器的水平上的操作，有目的地获得特定的细胞或组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
（1）原理和方法：细胞生物学和分子生物学
（2）操作水平：细胞或细胞器
（3）目的：按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。
一、细胞工程
2.细胞工程分类
（1）依据操作对象分：植物细胞工程和动物细胞工程
（2）依据操作技术分：植物组织培养技术、细胞融合技术、动物细胞核移植技术等。
3.植物细胞工程类型
一、细胞工程
植物细胞工程
动物细胞工程
一、植物细胞工程的基本技术
1、细胞的全能性：
细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
2、具有全能性的原因：
生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。
3、体现细胞全能性的标志：
细胞→ 完整个体或其他各种细胞
实例：胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株；
受精卵发育成个体（动植物）；
蜜蜂受精卵发育成工蜂，卵细胞发育成雄峰；
用一片叶子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株。
4、不体现全能性的实例：
芽原基只能发育为芽，叶原基只能发育为叶
5、不体现全能性的原因：
基因在特定时间、空间条件下选择性表达
细胞全能性实例：
——多肉进行叶插繁殖
1.选取多肉上健康、饱满的叶片。
2.用剪刀切下整片叶片，切口要平滑、整齐。也可以直接用手轻轻掰下叶片。
3.平躺放在沙床上，叶片间隔相聚2~3厘米。
4.叶片切口不要有碰脏，摆放通风处2~3天，晾干。
5.待叶片晾干后移至半阴处养护。
6.约2~3周后生根，或从叶基处长出不定芽。
7.叶插成功
植物组织培养是指依据细胞全能性的原理，在无菌条件下，将离体的植物的器官、组织、细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
1.植物组织培养的概念
一、植物组织培养技术
外植体
如：茎尖、根尖
2. 一般过程：
一、植物组织培养技术
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽等
试管苗
驯化移栽
完整植株
移栽成活
根、芽
植物体
脱分化
再分化
培养条件：
① 无菌
② 营养物质
③ 适宜环境条件（温度、PH、光等）
④ 植物激素：
细胞分裂素 生长素
如：胡萝卜的形成层、菊花幼茎段、月季的花药…
植物组织培养技术的过程
遮光
一定的光照
芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照
排列不规则，高度液泡化，呈不定型状态的薄壁细胞
愈伤组织
离体的植物器官、组织或细胞（外植体）
愈伤组织重新分化为芽、根等器官
失去特有结构和功能转变成未分化的细胞
2. 一般过程：
(1)外植体——离体的植物器官、组织、细胞或原生质体。
植物的茎尖、幼嫩的叶片、花药是常用的外植体。
(2)脱分化：已经分化的细胞，经过诱导，失去其特有的结构和功能而转变
成未分化细胞的过程。
(3)愈伤组织：细胞排列疏松且无规则、高度液泡化、呈无定形状态的薄壁细胞团。
一、植物组织培养技术
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽等
试管苗
驯化移栽
完整植株
(4)再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化出根或芽等
器官的过程。
(5)胚状体：离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程
所形成的胚状类似物，因而统称为体细胞胚或胚状体。
愈伤组织的细胞排列疏松而无规则是一种高度液泡化的无定形状态的细胞。愈伤组织形成以后，如果在原来的培养基上续培养，就会由于培养基中养分不足或有毒代谢产物的，导致愈伤组织生长停止，甚至老化变黑乃至死亡。如果要愈伤组织续生长增殖，必须定期地将它们分成小，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的再分化主要有两种方式。一种是不定芽方式，就是在某些条件下，愈伤组织的细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根（图1-2-8）。另一种是胚状体方式，就是由愈伤组织诱导分化出的具有胚芽、 胚根、胚轴的类似于胚的结构。能够产生胚状体的愈伤组织常见于胡萝卜、芦笋、玉米和小麦等植物。
小贴士
5.影响植物组织再分化的因素有：
① 生长素和细胞分裂素的比值 ② 微生物
③ 培养基的离子平衡 ④ pH值 ⑤ 温度
3.植物组织培养的理论基础：
植物细胞全能性
4.植物组织培养的条件：
①离体 ②无菌 ③培养基 ④适宜的外界条件
生长素含量＞细胞分裂素时，主要诱导根原基的形成，反之，主要诱 导芽原基的形成。
一、植物组织培养技术
探究-实践
菊花的组织培养
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽等
试管苗
完整植株
移栽
1、原理：
2、目的：
（1）了解植物组织培养的基本原理
（2）了解生长素和细胞分裂素的浓度、用量比例对菊花愈伤组织
形成和分化的影响。
（3）尝试进行植物组织培养
3、步骤：
（1）制备外植体
（2）接种到诱导愈伤组织培养基
（3）接种到诱导生芽培养基
（4）接种到诱导生根培养基
生长素用量与细胞分裂素用来的比值 结果
比值高
比值低
比值适中
有利于根的分化，抑制芽的形成
有利于芽的分化，抑制根的形成
促进愈伤组织的形成
比值适中→比值低→比值高
简记：
先“生”分裂不分化，
后“生”分裂又分化，
同“使”分化频率高
（4）材料用具
①外植体：_______________
*经常选择根尖（分生区）、茎的韧皮部（形成层）等分裂能力强、分化程度低的区域作为材料，容易诱导形成愈伤组织；
②体积分数为70%的酒精
*对手、超净工作台、外植体进行消毒
③质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液
*对外植体进行消毒
④无菌水
*清洗外植体
⑤培养基（参见本书附录1）
*包括无机营养成分（水和无机盐）、有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素等）、特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）；
*蔗糖的作用：提供能量，调节渗透压
*培养基灭菌方法为：___________
幼嫩的菊花茎段
湿热灭菌法
菊花的组织培养
一、植物组织培养技术
1.用酒精擦拭双手和超净工作台台面。将流水充分冲洗后的外植体（幼嫩的茎段）用酒精消毒30s,然后立即用无菌水清洗2~3次；再用次氯酸钠溶液处理30 min后，立即用无菌水清洗2~3次。
2.将消过毒的外植体置于无菌的培养皿中，用无菌滤纸吸去表面的水分。用解剖刀将外植体切成0.5~1cm长的小段。
3.在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3~1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
菊花的组织培养
一、植物组织培养技术
4.将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18~22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
5.培养15~20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。
6.移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
幼 苗
愈伤组织
脱分化
CTK/IAA比例适合
再分化
CTK/IAA比例先增大在减小
菊花植物组织培养过程示意图
完整植株
外植体
思考：
1.为什么整个过程要保证无菌操作？
2.为什么外植体不能倒插？
避免杂菌在培养基上迅速生长消耗营养，同时防止有些杂菌危害培养物的生长。
与生长素的极性运输有关；
生长素含量多的部分容易生出不定根，含量少的部分生出不定芽，一般而言，容易长不定芽的是形态学上端，容易长不定根的是形态学下端，因此应该将形态学上端朝上，下端朝下，若倒插，外植体不易存活。
脱分化
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18-22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
*该过程一般不需要光照；
*有光易形成维管组织，不易形成愈伤组织。
再分化
*注意顺序，先诱导生芽，再诱导生根；
*该过程每日需要给予适当时间和强度的光照。
培养15~20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上
长出芽后
将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗
结果分析与评价
① 接种3~4d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，试分析它们被污染的可能原因。
② 从刚接种的外植体到长出愈伤组织需经历多少天？
③ 培育的试管苗能直接移栽到露地吗？应如何操作？
培养基、接种工具灭菌不彻底；
外植体消毒不彻底；
操作过程不符合无菌操作要求等。
2周左右
生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。
一般使用无土栽培方法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒质量分数为5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12h，掀开塑料薄膜24h后才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，待其长壮后再移植到大田或盆中。
结果分析与评价
④ 若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？
空白对照：不加任何激素
实验组1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1；
实验组2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1；
实验组3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。
能否从以上内容中概括植物组织培养中细胞表现出全能性所需要的条件？
植物组织培养中细胞表现出全能性的条件
（1）离体（最关键）
（2）严格的无菌条件
（3）适宜的培养条件
（4）适宜浓度和比例的激素
（5）一定的营养条件
①对操作环境、双手、外植体进行消毒；
②对培养基和器械进行灭菌；
③接种操作必须在酒精灯火焰旁进行。
①温度（例如菊花植物组织培养应为18-22℃）；
②光照（例如脱分化需避光，再分化需照光）。
*植物激素的种类和含量不同，对愈伤组织的形成和分化的影响不同。
*配制合适的培养基，包括有机营养成分、无机营养成分、适宜浓度和比例的激素。
*若细胞不离体，细胞中的基因会选择性地表达，从而形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性。
特殊的植物组织培养——花药离体培养
花药离体培养
配子
DDTT
DDtt
ddTT
ddtt
正常植株（纯合）
秋水仙素诱导
高杆抗病
DdTt
DT
Dt
dT
dt
单倍体植株
DT
Dt
dT
dt
需要的纯合矮抗品种
（1）植物组织培养过程中涉及的分裂方式为_________；
（2）该过程涉及的生殖方式是_________*；
（3）经秋水仙素加倍之后，获得的植株一般为_______，一定是吗？_______。
有丝分裂
有性生殖
纯合子
不一定
2003年1月5日，“神舟”四号准确陆。这次时6天18小时的空行，开展了多 项在轨研究，其中有一项被媒体描述成“太空婚礼”的生物实验。不过，“婚礼”中的 “新郎”和“新娘”是一对对体细胞，作为“新房”的是一个黑色的小合子——电融合仪。原来，这是科技工作者在空间微重力条件下进行的细胞融合(cell fusion)实验。
二、植物体细胞杂交技术
1.植物体细胞杂交技术
植物体细胞杂交技术是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
2.植物体细胞杂交技术环节
原生质体的制备、原生质体的融合、杂合细胞的筛选和植物组织培养等环节。
二、植物体细胞杂交技术
欲培育地上长番茄和地下结马铃薯的“超级作物”。你有什么好妙招？
利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？
不能。因为不同种生物之间存在着生殖隔离
二、植物体细胞杂交技术
尝试用这两种植物的体细胞进行杂交
1．你认为两个来自不同植物的体细胞完成融合，遇到的第一个障碍是什么？
2．有没有一种温和的去壁方法呢？
请思考：
去细胞壁
酶解法
植物体细胞杂交技术流程图
植物细胞融合
植物组织培养
二、植物体细胞杂交技术
标志：成功融合
人工诱导
去壁
植物体细胞杂交过程实例
二、植物体细胞杂交技术
“白菜－甘蓝”同普通白菜相比，具有生长期短、耐热性强和易于贮藏等优点。
3.植物体细胞杂交的方法
（1）化学法和物理法（原生质体融合用这两种方法）
化学法：聚乙二醇
优点：使用方便，诱导细胞融合的频率高
缺点：有一定的毒性对某些细胞不适用（如卵细胞）
物理法：电刺激、离心等
优点：诱导细胞融合的频率高、对细胞无毒害作用、
操作简便、可重复性好，诱导过程可控性强。
二、植物体细胞杂交技术
原生质体
4.植物细胞杂交前还需去除细胞壁
（2）生物法：病毒诱导融合（仙台病毒——应用最为广泛）
优点：诱导细胞融合的效率高，对各种动物细胞都适宜，
并且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养
缺点：仙台病毒不稳定，保存过程中融合活性降低，制
备烦琐，病毒进入细胞后，会对细胞的生命活动
产生干扰。
二、植物体细胞杂交技术
细胞壁
纤维素酶、果胶酶
原生质体
拓展：
① 原生质体是指植物细胞去除细胞壁后剩余的部分，包括细胞膜、细胞质和细胞核。
② 原生质层是指成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质，包括细胞膜、细胞质、液泡膜。
③ 从概念上可以看出，原生质层中没有包含细胞液（液泡中的液体部分）和细胞核，因此原生质体应该比原生质层多这两部分成分。
区分原生质体与原生质层：
【注意】质壁分离的“质”指的是原生质层。
小结：
植物组织培养的过程
外植体
愈伤组织
根、芽
植物体
脱分化
再分化
（离体的,已分化组织或细胞）
（未分化）
（分化）
条件？
优点？
特点？
繁殖速度快
不受季节限制
工厂化生产
幼苗无毒
保持优良性状
①适宜温度、光照、 pH和无菌环境。
②无机物、有机物和植物激素（生长素，细胞分裂素等）
无定形状态
薄壁细胞
高度液泡化
排列疏松、无规则
无叶绿体,不进行光合作用
原理
基础概括
过程
植物体细胞杂交
细胞膜具有一定的流动性
概念
生殖方式
分裂方式
植物细胞融合
植物细胞的全能性
可遗传变异类型
实例
意义
植物组织培养
去除细胞壁
原生质体间的融合
再生出新的细胞壁
脱分化
再分化
小结：
练习与应用
一、概念检测
1. 下图是利用甲、乙两种植物的各自优势，通过植物细胞工程技术培育高产、耐盐的杂种植株的实验流程图。下列相关叙述错误的是( )
A.进行a处理时能用胰蛋白酶
B.b是诱导融合后得到的杂种细胞
C.c是培养后得到的具有耐盐性状的幼芽
D.进行d选择时要将植株种在高盐环境中
A
2. 科学家在制备原生质体时，有时使用蜗牛消化道提取液来降解植物细胞的细胞壁。据此分析，蜗牛消化道提取液中可能含有什么成分？
【答案】纤维素酶和果胶酶。
二、拓展应用
“番茄-马铃薯”杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么？
【提示】 1978年，梅尔彻斯(G.Melchers)等人首次获得了马铃薯与番茄的体细胞杂种植株。他们将培育的二倍体马铃薯和番茄的叶片细胞原生质体进行融合，产生了杂种植株一一“番茄-马铃薯”，它同时具有马铃薯和番茄的形态特征。其中一些植株形成了“类似块茎的生殖根”，但是并没有产生可结实的花、果实以及真正意义上的块茎。到目前为止“番茄-马铃薯”一类的体细胞杂交植物还不能产生经济效益，但是其研究价值不可忽视。
“番茄-马铃薯”没有像人们预想的那样地上结番茄、地下长马铃薯，主要原因是：生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以“番茄-马铃薯”杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达。杂种植株自然就不能地上结番茄、地下长马铃薯了。近年来，有报道称利用嫁接技术培育出了地上结番茄、地下长马铃薯的植株。
谢谢
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