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第2节 动物细胞工程
02
植物细胞工程的应用ZHIWUXIBAOGONGCHENGDEYINGYONG
01
动物细胞培养
DONGWUXIBAOPEIYANG
教学目标
1. 阐明动物细胞培养的条件和过程。
2. 简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。
3. 阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程,认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值。
4. 阐明利用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和该技术的应用前景。
本节聚焦
1. 动物细胞培养需要哪些基本条件？
2. 动物细胞培养的基本操作过程是什么？
3. 怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？
动物细胞工程（含胚胎工程）的发展历程
1890年，希普将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例
1907年，哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法
1951年，张明觉等发现了哺乳动物精子的获能现象
1958年，格登用非洲爪蟾进行体细胞核移植实验，成功培育出性成熟个体，同一时期，我国科学家童第周等开展了鱼类细胞核移植工作
1959年，试管家兔诞生，之后，多种试管动物相继出生
1975年，米尔斯坦和科勒等创立了单克隆抗体技术
1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割，次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊
1981年，埃文斯等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞
1996年，世界上第一只体细胞克隆羊多莉在英国诞生，随后多种克隆动物相继问世
2006年，山中伸弥等获得了诱导多能干细胞，我国科学家用这种细胞培育出了小鼠
2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生
2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源不足而且会产生排异反应。
那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤呢？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增。目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。
动物细胞工程
动物细胞培养（基础）
动物细胞融合
动物细胞核移植
人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产等，都离不开动物细胞的培养。
1.动物细胞培养的概念、原理分别是什么？
3.动物细胞培养的过程是怎样的？
2.动物细胞培养的条件分别是什么？
4.干细胞的概念、分布、分类分别是什么？
阅读教材P43-P45，解决以下问题。
5.什么是诱导多能干细胞？如何用于治疗人类疾病？
6.干细胞的应用领域有哪些？
动物细胞培养是指动物机体中取出相关组织，将它分散成单个细胞，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖的技术。
1.概念
2.原理
细胞增殖
（一）动物细胞培养的概念、原理
（二）动物细胞培养的条件
（二）动物细胞培养的条件
2.无菌、无毒的环境
1.营养
对培养液和所有培养用具进行无菌处理以及在无菌环境下进行操作；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对培养细胞自身造成危害。
细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质。
合成（液体）培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加入血清等天然成分。
（二）动物细胞培养的条件
3.温度、pH和渗透压
适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为（36.5±0.5）℃。
多数动物细胞适宜的pH：7.2~7.4
此外渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。
4.气体环境
（1）组成
动物细胞培养所需气体主要有___和____
（2）不同气体的作用
①O2：_____________________
②CO2：_________________________
（3）培养容器
通常采用_______或____________
（4）培养仪器
含有_______和______的混合气体的__________。
O2
CO2
O2是细胞代谢所必需的
CO2的主要作用维持培养液的pH
培养皿
松盖培养瓶
95%空气
5%CO2
CO2培养箱
阅读教材P44-P45
（三）动物细胞培养的过程
1.为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞呢？可用什么方法？
2.体外培养动物细胞有哪些类型？
3.什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？
4.什么是原代培养和传代培养？
5.对细胞进行传代培养时，是直接将细胞转移到其他培养皿或培养瓶中吗？
（三）动物细胞培养的过程
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液中进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
用机械的方法，或用胰蛋白酶，胶原蛋白酶等处理的方法，将组织分散成单个细胞。
传代培养
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液原代培养
分瓶
传代培养
重要名词解释
①原代培养
通常将________的细胞培养，即动物组织经_____后的________称为原代培养；
②传代培养
将______的细胞培养称为传代培养；
③细胞贴壁
______体外培养的细胞需要_________________才能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的____上，这种现象称为细胞贴壁；
④接触抑制
当_____细胞生长到___________时，细胞通常会____________；
分瓶之前
处理
初次培养
分瓶后
大多数
贴附于某些基质表面
瓶壁
贴壁
表面相互接触
停止分裂增殖
1.取动物组织
（1）取材
________或________的组织、器官
（2）取材原因
________________________________
动物胚胎
幼龄动物
细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养
2.制成细胞悬液
（1）制成细胞悬液的步骤
①____________________
②_______________________
（2）将组织分散成单个细胞的原因
①从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞________，彼此_______________；
②_______________________________________
（3）将组织分散成单个细胞的方法
①_______
②________________________________
靠在一起
限制了生长和增殖
将组织分散成单个细胞
用培养液将细胞制成细胞悬液
机械法
用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间
能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换
思考：
1.用胰蛋白酶分散细胞，可以说明什么问题？
2.可以用胃蛋白酶处理吗？为什么？
3.酶解法较温和，一定不会对动物细胞造成损伤，对吗？
动物细胞间的物质主要是蛋白质
不可以；
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2-7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行
不对；
使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。
3. 原代培养：
从动物体获取组织或细胞后，进行的第一次培养过程称为原代培养，也叫初代培养。
原代培养的细胞一般传至10代左右，细胞生长分裂就会停滞。极少会代至40~50代。
3.原代培养
（1）具体做法
将________放入_____________内
（2）体外培养细胞的两大类
①________________________；
②____________________________________________
（3）两类细胞的生长特点
①悬浮生长类
____________________________________________
____________________________________________
②贴壁生长类
____________________________________________
细胞悬液
培养皿或培养瓶
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻
除受密度、有害代谢物、营养物质影响外，还会发生接触抑制
能够悬浮在培养液中生长增殖
大多数需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁）
细胞贴壁过程
接触抑制
(contact inhibition)
思考：
“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因
癌细胞；
癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少
4.分瓶、传代培养
（1）需分瓶进行传代培养的原因
____________________________________________
____________________________________________
____________________________________________
（2）分瓶的具体做法
①收集细胞
a.悬浮生长类
________________
b.贴壁生长类
____________________________________________
____________________________________________
②____________________________________________
悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质等因素而分裂受阻，贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象
直接用离心法收集
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。
将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
思考：
1.离心的作用？
。
2.动物细胞培养技术有没有体现动物细胞的全能性？
在沉淀中得到细胞，同时去掉上清液中的胰蛋白酶。
未体现；
动物细胞培养只是细胞增殖的过程。
思考：
正常细胞能否一直传代培养下去？
不可以；
细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下去，这时细胞能保持细胞正常的二倍体核型；
传至10～50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化，这一阶段的细胞称为细胞株；
继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展，这一阶段的细胞称为细胞系，细胞系的遗传物质一定改变了。
原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。
细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
6.细胞系
5.细胞株
细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
胰蛋白酶或胶原蛋白酶
剪碎
单个细胞
加培养液
制成
细胞悬浮液
部分细胞“癌变”，遗传物质改变，无限传代
动物细胞培养不能
最终培养成动物体
50代细胞
原代培养
传代培养
剥离、分瓶
细胞
10代细胞
细胞株
细胞系
细胞贴壁
贴壁抑制
（三）动物细胞培养的过程
有关动物细胞培养的问题
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？
2.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同与不同之处？
3.为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？
4.为什么用胰蛋白酶处理？蛋白酶的作用是什么？由此说明细胞间的物质是什么成份？用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？
5.可以用胃蛋白酶来处理动物组织以得到单个细胞吗？为什么？
6.培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？
7.动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？
8.目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为几代以内？为什么？
有关动物细胞培养的问题
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？
细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说,幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样,分化程度越低的细胞,，增殖能力越强，所以更容易培养。
有关动物细胞培养的问题
2.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同与不同之处？
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
获得细胞及代谢产物
细胞的全能性
细胞株、细胞系
植物体
快速繁殖、培育无病毒植株等
葡萄糖、动物血清
蔗糖、植物激素
液体培养基
固体培养基
细胞增殖
有关动物细胞培养的问题
3.为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？
成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于培养。所以将组织细胞分散成单个细胞，既有利于细胞的生长和增殖，同时也扩大细胞与培养液的接触面积，有利于细胞吸收营养及排除细胞代谢废物。
有关动物细胞培养的问题
4.为什么用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理？这里中酶作用是什么？由此说明细胞间的物质是什么成份？用酶制备单细胞悬液不会把所培养的细胞消化掉吗？
动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。
催化蛋白质水解。
细胞间的物质主要是蛋白质(胶原蛋白等)。
长时间处理会消化细胞膜蛋白，当然会损伤细胞，所以必须控制好时间！
有关动物细胞培养的问题
5.可以用胃蛋白酶来处理动物组织以得到单个细胞吗？为什么？
动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。
细胞进行有丝分裂，数量不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象成为细胞的接触抑制。
6.培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？
有关动物细胞培养的问题
7.动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。
通常为10代以内；
以保持细胞正常的二倍体核型。
8.目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为几代以内？为什么？
（四）干细胞培养及其应用
1.干细胞
（1）概念
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
（2）分布
存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
1.干细胞
（3）分类
包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
（四）干细胞培养及其应用
① 胚胎干细胞（简称ES细胞）：也叫全能干细胞，存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
1.干细胞
（3）分类
包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
（四）干细胞培养及其应用
② 成体干细胞：是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓中的造血干细胞（多能干细胞）、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞（专能干细胞）等。一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
应用最成熟的成体干细胞：造血干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。
2.诱导多能干细胞（iPS细胞）
（四）干细胞培养及其应用
（1）概念
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
（2）获取方法
① 将特定基因或特定蛋白导入细胞；
② 用小分子化合物诱导形成。
2.诱导多能干细胞（iPS细胞）
（四）干细胞培养及其应用
（3）诱导多能干细胞优点
① 诱导过程无须破坏胚胎；
② iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
2.诱导多能干细胞（iPS细胞）
（四）干细胞培养及其应用
（4）iPS细胞治疗疾病过程
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
病人
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
取成纤维细胞
转入相关因子
细胞转化为iPS细胞
诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞
移植回病人体内
思考：
1.如果想将iPS细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施？
2.如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
建立iPS细胞库（HLA多态性丰富的iPS细胞库），可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞。
可以用来治疗不孕症；
可以用来进行濒危物种的克隆；
可以对获得的生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物；
可能会带来一系列的伦理问题，例如用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿，有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而”设计”婴儿。
T淋巴细胞
造血干细胞
巨噬细胞
红细胞
B淋巴细胞
血小板
肥大粒细胞
嗜中性粒细胞
嗜酸性粒细胞
嗜碱性粒细胞
3.主要用途
（1）通过造血干细胞的移植可以治疗白血病、遗传性血液病（如地中海贫血、血液再生障碍性贫血、镰刀状细胞贫血）等疾病。
四、干细胞培养及应用
3.主要用途
病人
（2）自体器官移植
科学家正在研究用胚胎干细胞治疗神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）、糖尿病、心肌坏死等疾病。
四、干细胞培养及应用
（四）干细胞培养及其应用
3.干细胞的应用
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
类型 应用
造血干细胞
神经干细胞
iPS细胞）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
4.干细胞应用面临的问题
存在____________________
导致肿瘤发生的风险
思考：
干细胞可以治疗某些顽症的原理是什么？
干细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞，经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能。
概述
培养条件
过程
动物细胞培养
原理
取材
地位
原代培养
营养条件
温度、pH和渗透压
无菌、无毒的环境
气体环境
制成细胞悬液
传代培养
干细胞
分布
分类
应用
五、课堂小结
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。 （ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。 （ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清。 （ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖。
（ ）
一、概念检测
练习与应用
×
√
×
×
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用
一、概念检测
练习与应用
A
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
二、拓展应用
练习与应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
二、拓展应用
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
练习与应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
二、拓展应用
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
练习与应用
谢谢
让课堂绽放魅力 让教育更加美好

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