资源简介

(共42张PPT)
二、基因表达载体的构建
1.构建原因
① ;
② 。
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代
使目的基因能够表达和发挥作用
二、基因表达载体的构建——核心步骤
2.基因表达载体的组成
当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
终止子
启动子
目的基因
标记基因
复制原点
基因表达载体
（1）启动子：
一段有特殊序列结构的____片段。
DNA
①本质：
②位置：
位于基因的____，紧挨__ __________。
上游
转录的起始位点
③功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
诱导型启动子：
（启动子≠起始密码子）
终止子
启动子
目的基因
标记基因
复制原点
基因表达载体
（2）终止子：
①本质：
一段有特殊序列结构的____片段。
DNA
②位置：
位于基因的_____。
下游
③功能：
使转录在所需要的地方停下来。
（3）标记基因：
①作用：
便于重组DNA分子的筛选。
（4）目的基因：
②常见类型：
抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
如Bt基因,能控制表达所需要的特殊性状。
（5）复制原点：
DNA复制的起始位点。
注意：目的基因必须插入到 与 之间。
启动子 终止子
（终止子≠终止密码子）
重组DNA分子
限制酶
3.基因表达载体的构建过程
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
DNA连接酶
基因表达载体构建模式图
限制酶
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
质粒
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶
？
①单酶切法
目的基因
3.基因表达载体的构建过程
思考：单酶切的方法缺陷是什么？
单酶切缺点:
质粒重新环化
目的基因自身环化
质粒与目的基因反向连接
D. 质粒与质粒连接
E. 目的基因与目的基因连接
如何避免上述问题？
a
b
a
b
双酶切的优点:
防止质粒重新环化
防止质粒与目的基因反向连接
防止目的基因自身环化
②双酶切法
图解限制酶的选择原则
核心归纳
1、不能破坏目的基因和标记基因（复制原点）
2、切割目的基因两端——产生4个黏性末端（平末端）
3、为避免目的基因和质粒的自身环化和确保定向连接——不同的限制酶
(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取(　　)
(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子(　　)
(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因(　　)
(4)当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制目的基因的表达
(　　)
判断正误
×
×
√
√
1.构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
提示　不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
2.与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
提示　可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。
3.下图为基因表达载体的模式图，下列有关说法，错误的是
典题应用
及时反馈　知识落实
A.基因表达载体的构建是在生物体外完成的
B.任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别
C.图中启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位
D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选
√
4.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反
　向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
√
（1）图1为某种常用质粒的序列图，LacZ基因编码的酶能使白色的X﹣gal变为蓝色，Ampr为氨苄青霉素抗性基因．图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列．请回答下列问题：
实验小组用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割目的基因和质粒，若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有 和 ．
氨苄青霉素
X﹣gal
二.基因表达载体的构建
（7）图1为某种常用质粒的序列图，LacZ基因编码的酶能使白色的X﹣gal变为蓝色，Ampr为氨苄青霉素抗性基因．图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列．请回答下列问题：
成功导入重组质粒的大肠杆菌菌落显 ， 若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入 ． 没有导入任何外源DNA的大肠杆菌 （填“能”或“不能）在该培养基上生存．
白色
无目的基因的空质粒
不能
二.基因表达载体的构建
三、将目的基因导入受体细胞
（一）导入植物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
(最多)
导入方法
1.花粉管通道法：
我国科学家独创
①用___________将___________________直接注入____中；
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
②在植物受粉后的一定时间内，剪去____，将________滴加在________上，使目的基因借助___________进入_____；
柱头
DNA溶液
花柱切面
花粉管通道
胚囊
受体细胞：
受精卵
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
③花粉管通道法的过程：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
2.农杆菌转化法
①转化：
②农杆菌特点：
a.能在自然条件下侵染___________和_________，而对大多数___________没有侵染能力；
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
b.农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______（___________）转移到被侵染的细胞，并且将其_________________________；
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
将目的基因插入_____________中，通过农杆菌的_____作用，就可以使目的基因___________
③利用农杆菌进行转化的思路：
Ti质粒的T-DNA
转化
进入植物细胞
近年来，农杆菌转化在一些单子叶植物（水稻、玉米）中也得到了广泛应用。
④农杆菌转化法的过程：
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现出新性状的植物
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
植物组织培养
两次拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体DNA上。
两次导入：
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入
⑤转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后_____________，并__________；
受体细胞为_______
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将____直接浸没在________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；
受体细胞为_______
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
——显微注射法
1.受体细胞：
受精卵
(因为受精卵容易表现出全能性)
2.过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
（二）导入动物细胞
显微注射法
——Ca2+处理法
1.受体细胞：
常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。
2.原核生物的优点:
繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。
3.一般过程:
Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
（感受态细胞）
（三）导入微生物细胞
Ca2+
感受态细胞
吸收
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（无内质网和高尔基体加工），需要在体外进行再加工。
生物 种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法 农杆菌转化法; 花粉管通道法 显微注 射法 Ca2＋处理法(感受态细胞法)
受体 细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
小结：将目的基因导入受体细胞
DNA分子导入受体细胞后就说明成功了吗？
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；
四、目的基因的检测与鉴定
1.目的:
2.检测内容及方法:
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
病原体接种实验等
1.分子水平的检测
(1)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中： 技术。
DNA分子杂交或PCR等
用放射性同位素标记的含有目的基因的单链DNA片段制成基因探针。将转基因生物的基因组DNA提取出来，和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已插入受体细胞的DNA中。
基因探针：
简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂）、且顺序已知的、与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。
变性
15N
出现杂交带，说明目的基因成功插入基因组DNA
取出转基因生物的基因组DNA
探针：用放射性同位素
标记的含目的基因序列的DNA片段
+
（1）检测目的基因是否导入
DNA和DNA之间
1、检测——分子水平的检测
DNA分子杂交技术
15N
出现杂交带，说明目的基因成功转录
取出转基因生物的mRNA
探针：用放射性同位素
等标记的含目的基因序列的DNA片段
+
（2）检测目的基因是否转录
mRNA和DNA之间
1、检测——分子水平的检测
分子杂交技术
(3)检测目的基因是否翻译出蛋白质： 技术。
从转基因生物提取出来的 和 进行杂交，如果出现 ，说明目的基因已经翻译。
抗原—抗体杂交
蛋白质
相应的抗体
杂交带
补充思考：
1.在抗原-抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？
抗原
2.个体生物学水平的鉴定具体有哪些做法？
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未侵染上病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
目的基因的检测与鉴定归纳
(1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞(　　)
(2)Ti质粒上的T-DNA可转移到植物细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起(　　)
(3)可以将目的基因直接导入受体细胞(　　)
(4)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术(　　)
(5)用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，利用了碱基互补配对原则(　　)
(6)基因工程是否成功需进行个体生物学水平的鉴定(　　)
判断正误
×
√
×
√
√
√
1.重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？
提示　限制酶、DNA连接酶。
2.在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上的原因是什么？
提示　原因是农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。
3.将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
提示　基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。
4.用什么方法检测目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上？
提示　PCR技术。
5.用什么方法检测目的基因是否发挥作用？
提示　用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA；用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
6.如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎么检测？如果目的基因是耐盐基因呢？
提示　如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验；如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。
1.下图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是
典题应用
及时反馈　知识落实
A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶
　和DNA连接酶
B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C.图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达
√
2.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达
A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B.通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
C.提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测
D.抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
√

展开更多......

收起↑