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现代生物科技专题
基因工程的工具及程序
【考点梳理】
典例1
图1表示某种DNA分子上的多种限制酶切割位点，图2表示EcoRⅠ、BamHⅠ、Sau3AⅠ三种限制酶识别序列和切割位点，下列相关叙述错误的是( )
A.获取该目的基因可采用EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切
B.限制酶能使特定碱基序列的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
C.Sau3AⅠ和BamHⅠ酶切该DNA分子，产生不同的黏性末端
D.能被Sau3AⅠ切割的序列不一定能被BamHⅠ切割
答案：C
解析：EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位点位于目的基因的两侧，EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，用EcoRⅠ和BamHⅠ切割目的基因，产生的末端不同，可防止构建基因表达载体时目的基因自连，A正确；限制酶能使特定碱基序列的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，B正确；Sau3AⅠ和BamHⅠ识别的碱基序列不同，但Sau3AⅠ和BamHⅠ酶切目的基因，产生的黏性末端相同，C错误；Sau3AⅠ识别的序列BamHⅠ酶不一定能识别，所以能被Sau3AⅠ切割的序列不一定能被BamHⅠ切割，D正确。
考点链接
基因工程的原理与工具
一、基因工程的概念
（1）基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
（2）对基因工程概念的深度理解
别名 基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
基本过程 剪切→拼接→导入→表达
目的 定向改造生物的遗传性状
二、基因工程的原理
基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效地表达。
具体地说，基因工程就是在DNA分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
三、基因工程的诞生和发展
（1）基础理论的突破：DNA是遗传物质的证明；DNA双螺旋结构和中心法则的确立；遗传密码的破译。
（2）技术的发明：基因转移载体和工具酶的相继发现；DNA合成和测序技术的发明；DNA体外重组的实现及重组DNA表达实验的成功；第一例转基因动物的问世及PCR技术的发明。
四、DNA重组技术的基本工具
1.限制性核酸内切酶（又称限制酶）——“分子手术刀”
（1）来源：主要来自原核生物。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（3）结果：产生黏性末端或平末端。
（4）应用：已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同（填“相同”或“不同”），说明限制酶具有专一性。
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
（1）作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（2）种类
种类 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
作用 缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）种类
①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的、环状的、裸露的DNA分子，独立于拟核之外。
②λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。
（2）目的
①将目的基因转运到宿主细胞中去。
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
（3）必备条件
①在宿主细胞中保存下来并大量复制。
②有多个限制酶切割位点。
③有一定的标记基因，便于筛选。
④对受体细胞无害。
（4）重组DNA分子的模拟操作
①材料用具：剪刀代表EcoRⅠ，透明胶条代表DNA连接酶。
②切割位点：
分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出—GAATTC—序列，并选G—A之间作切口进行“切割”；再从另一条链上互补的碱基之间寻找EcoR Ⅰ相应的切口剪开。
③操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端应能互补配对；否则，说明操作有误。
例题练习
1.下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述正确的是( )
A.用限制酶剪切获得一个目的基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开
B.序列和被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
C.限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
D.T4DNA连接酶和E.coliDNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接
答案：C
解析：用限制酶剪切获得一个目的基因时得到两个切口，有4个磷酸二酯键被水解，A错误；和序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同，都是4个，B错误；限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，C正确；T4DNA连接酶和E.coliDNA连接酶都能催化黏性末端的连接，其中T4DNA连接酶可以连接平末端，D错误。
2.用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是( )
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
答案：D
解析：本题结合电泳图谱考查基因工程中限制酶的相关知识，包括限制酶的作用特点、功能、作用对象等。不同的限制酶识别序列不同，A项正确；限制酶切割的产物可用于构建重组DNA，B项正确；泳道①显示四个条带，是SalⅠ处理后的酶切产物的电泳结果，泳道②显示三个条带，是XhoⅠ处理后的酶切产物的电泳结果，C项正确；限制酶的作用特点是识别特定DNA序列，并在DNA两条链特定部位切割产生黏性末端或平末端，D项错误。
典例2
关于目的基因获取过程的叙述中，不正确的是( )
A.人工合成法可合成未知序列的任意大小的DNA片段
B.真核与原核生物的目的基因均可从基因文库中提取
C.原核生物的目的基因一般不从cDNA文库中提取
D.若可设计出特定引物，PCR方法也可获取目的基因
答案：A
解析：当基因比较小，核苷酸序列又已知的情况下，适合用人工合成法合成，A错误；真核生物和原核生物的基因都可 以从基因文库中提取，B正确；原核生物的基因不含内含子，因此不需从cDNA文库中获取，C正确；在目的基因的核苷酸序列已知的情况下，可以根据目的基因的核苷酸序列合成特定的引物，进而用PCR技术获取目的基因，D正确。
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目的基因的获取
一、目的基因
1.主要是指编码蛋白质的基因。
2.一些具有调控作用的因子。
二、获取方法
1.从基因文库中获取
（1）基因组文库：含有一种生物所有的基因。
（2）部分基因文库：含有一种生物的一部分基因，如cDNA文库。
2.利用PCR技术扩增目的基因
（1）含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
（2）原理：DNA双链复制。
（3）条件：引物、DNA模板、Taq酶、四种脱氧核苷酸。
（4）过程。
①目的基因DNA受热变性后解链为单链（90～95 ℃）。
②引物与单链相应互补序列结合（55～60 ℃）。
③在DNA聚合酶作用下进行延伸（70～75 ℃）。
④重复循环多次。
（5）特点：指数形式扩增。
3.人工合成法
（1）条件：基因比较小，核苷酸序列已知。
（2）方法：通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
例题练习
1.如图表示基因工程中目的基因的获取示意图，不正确的是( )
A.③表示PCR技术，用来扩增目的基因
B.某生物的不同器官和组织构建的cDNA文库不同
C.利用限制酶从基因组文库中获取目的基因
D.若基因比较小，序列又已知，则可以直接通过化学方法合成
答案：C
解析：③表示利用DNA或cDNA中的目的基因进行PCR，扩增目的基因；cDNA由mRNA反转录形成，由于基因的选择性表达，不同细胞中mRNA不同，所以cDNA文库不同；从基因组文库中获取目的基因，需要限制酶和DNA连接酶；如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可用DNA合成仪通过化学方法直接人工合成。
2.下列有关目的基因筛选与获取的叙述错误的是( )
A.目的基因就是编码蛋白质的基因
B.筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
C.来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D.从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是获取目的基因较为有效的方法之一
答案：A
解析：目的基因主要指编码蛋白质的基因，但不是全部，A错误；目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步，B正确；来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因，C正确；从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是获取目的基因较为有效的方法之一，D正确。
典例3
在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是( )
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子
②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止
④所有基因表达载体的构建是完全相同的
⑤必须在细胞内进行
A.②③⑤ B.①④⑤ C.①②⑤ D.③④
答案：B
解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子和标记基因等，①错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子控制着转录的结束，③正确；由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误；基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤错误。综上，②③正确，①④⑤错误，故选B。
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基因表达载体的构建与转化
一、基因表达载体的构建
1.构建基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
两子启动和终止；目的基因在中间；标记基因来筛选。
3.基因表达载体的功能
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
（2）使目的基因表达和发挥作用。
二、将目的基因导入受体细胞
1.转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.转化方法
（1）导入植物细胞
①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物。
②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。
③花粉管通道法：我国科学家独创的一种方法。
（2）导入动物细胞
①常用方法：显微注射技术。
②常用受体细胞：受精卵。
（3）导入微生物细胞
①方法
a.用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（这种细胞称为感受态细胞）。
b.感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子。
②受体细胞：原核细胞（使用最广泛的是大肠杆菌）。
③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
例题练习
1.如图为基因表达载体的模式图，下列有关说法错误的是( )
A.构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶
B.任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别
C.图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位
D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
答案：B
解析：A正确，构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶。B错误，用不同种类的载体构建基因表达载体时处理方法是有差别的。C正确，启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位。D正确，抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于检测受体细胞中是否导入了目的基因。
2.将Bt毒蛋白基因转入棉花植株体内，可增强其对棉铃虫的抗性。下列叙述错误的是( )
A.可从苏云金芽孢杆菌的基因文库中获取Bt毒蛋白基因
B.将Bt毒蛋白基因插入Ti质粒的T-DNA上构建表达载体
C.将Bt毒蛋白基因导入经Ca2+处理过的棉花植株受体细胞
D.可用抗虫接种实验检测转基因棉花对棉铃虫的抗性程度
答案：C
解析：获取目的基因的方法有多种，例如利用PCR技术扩增目的基因、人工合成目的基因等，也可以从苏云金芽孢杆菌的基因文库中获取Bt毒蛋白基因，A正确；因为农杆菌的Ti质粒的T-DNA可以转移至被侵染的细胞并整合到该细胞染色体DNA上，所以要将Bt毒蛋白基因插入Ti质粒的T-DNA上构建表达载体，B正确；应将含Bt毒蛋白基因的Ti质粒导入经Ca2+处理过的农杆菌细胞，C错误；用抗虫接种实验检测转基因棉花对棉铃虫的抗性程度属于个体生物学水平鉴定，D正确。
典例4
棉花产业在我国国民经济发展中占有举足轻重的地位，为了抵抗虫害，我国育成了拥有自主知识产权的转基因抗虫棉，使棉田生态环境得到改善。在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是( )
A.观察害虫吃棉叶是否死亡
B.检测目的基因片段能否与DNA探针形成杂交带
C.检测目的基因转录形成的mRNA能否与DNA探针形成杂交带
D.检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带
答案：A
解析：检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，方法是DNA分子杂交技术，即将转基因生物的基因组DNA与DNA探针杂交，检测是否出现杂交带；检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是分子杂交技术，即从转基因生物中提取的mRNA与DNA探针杂交，检测是否出现杂交带；检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是抗原—抗体杂交技术，即从转基因生物中提取蛋白质与相应的抗体进行杂交，检测是否出现杂交带。除了上述分子检测外，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，检测抗虫或抗病基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，所以通过观察害虫吃棉叶是否死亡属于个体生物学水平的鉴定，而不是分子检测，A符合题意。
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目的基因的检测与鉴定
一、分子水平检测
1.检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因。
方法：DNA分子杂交技术。
2.检测目的基因是否转录出mRNA。
方法：分子杂交技术。
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质。
方法：抗原—抗体杂交技术。
二、个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。
例题练习
1.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达( )
A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B.利用相应的DNA探针与受体细胞DNA分子进行杂交
C.提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测
D.抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
答案：A
解析：检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种：①分子水平上的检测：检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出mRNA用mRNA—DNA分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原一抗体杂交技术。②个体生物学水平的鉴定；检测是否具有抗性及抗性程度；检测基因工程产品与天然产品的活性是否相同。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因，故选A。
2.我国科学家利用Bt毒蛋白基因培育出转基因抗虫棉。可以用做检测目的基因的探针的是( )
A.用放射性同位素等标记的含有Bt毒蛋白基因的DNA片段
B.Bt毒蛋白的特异性抗体
C.用放射性同位素等标记的Bt毒蛋白的特异性抗体
D.含有Bt毒蛋白基因的DNA片段
答案：A
解析：探针是用放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。我国科学家利用Bt毒蛋白基因培育出转基因抗虫棉，检测目的基因的探针是标记的含有Bt毒蛋白基因的DNA片段，A正确，B、C、D错误。
【要点突破】
一、DNA连接酶与限制性核酸内切酶的比较
1.区别
作用 应用
限制性核酸内切酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体
DNA 连接酶 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 用于目的基因和载体的连接
2.联系
二、DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
不同点 模板 不需要模板 需要DNA的一条链为模板
作用对象 游离的DNA片段 单个的脱氧核苷酸
作用结果 形成完整的DNA分子 形成DNA的一条链
用途 基因工程 DNA复制
三、载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
四、目的基因获取方法的选择
（1）如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中去获取目的基因。
（2）如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法人工合成。
（3）如果只知道扩增目的基因的两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可以通过PCR技术扩增目的基因。
五、目的基因获取过程的比较
（1）基因组文库：
供体生物→全部DNA→DNA片段→受体菌群→目的基因
（2）cDNA文库：
供体生物→mRNA→cDNA→受体菌群→目的基因
（3）PCR技术：
目的基因→大量目的基因
（4）人工合成：
蛋白质的氨基酸序列→mRNA核苷酸序列→DNA核苷酸序列→目的基因
六、PCR技术与DNA复制的比较
比较项目 DNA复制 PCR技术
区 别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 细胞内（主要在细胞核内） 细胞外（主要在PCR扩增仪中）
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐热的DNA聚合酶
温度 细胞内温和条件 控制温度，需55 ℃～95 ℃高温
结果 合成DNA分子 合成DNA片段或基因
联系 （1）模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 （2）原料：均为四种脱氧核苷酸 （3）酶：均需DNA聚合酶 （4）引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
七、将目的基因导入受体细胞的方法比较
生物类型 植物 动物 微生物
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
常用方法 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 显微注射技术 感受态细胞法
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
八、农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上；第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的TDNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的TDNA导入受体细胞。
九、目的基因的检测与鉴定在不同方面的比较
类型 步骤 检测内容 方法 结果显示
分子检测 导入检测 目的基因是否导入受体细胞 DNA分子杂交技术（DNA和DNA之间） 是否成功显示出杂交带
表达检测 目的基因是否转录出mRNA 核酸分子杂交技术（DNA和mRNA之间） 是否成功显示出杂交带
目的基因是否翻译出蛋白质 蛋白质分子杂交（抗原和抗体之间） 是否成功显示出杂交带
个体生物学水平的鉴定 ①确定是否具有抗性及抗性程度 ②基因工程产品与天然产品的活性是否相同 ①抗虫或抗病的接种实验 ②基因工程产品与天然产品活性的比较 是否赋予了预期抗性或蛋白质活性
十、常见不同转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法
个体水平的鉴定实际上是检测目的基因是否表达出所控制的性状，不同的转基因生物检测方法不同。
转基因生物 检测方法 观察目标
抗虫植物 害虫吞食 害虫死亡
抗病毒（菌）植物 病毒（菌）感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能活性正常
易错辨析
1.病毒在生物学中的应用举例：①基因工程中作载体，②动物细胞工程中作诱融合剂③在免疫学上可作疫苗用于免疫预防。
2.标记基因（通常选抗性基因）的作用是：用于检测重组质粒是否被导入受体细胞（不含抗性）洏而选择性培养基（加抗生素的培养基）的作用是：筛选是否导入目的基因的受体细胞。抗生素针对的不是目的基因，而是淘汰不具有抗性的没有导入目的基因的受体细胞。
3.动物细胞融合技术的最重要用途是制备单克隆抗体，而不是培养出动物
4.基因工程中导入的目的基因通常考虑整合到核DNA中，形成的生物可看作杂合子（Aa）产生配子时，可能含有目的基因，后代会发生性状分离。
5.重组质粒即基因表达载体的构建）在细胞外形成，而不是在细胞内。
6.质粒不是细菌的细胞器而是某些基因的载体，质粒存在于细菌细胞内的小型环状DNA。拟核是大型环状DNA
7.启动子、终止子是基因的结构，在构建基因表达载体时目的基因插入两者之间；而起始密码、终止密码在mRNA上。

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