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新人教生物一轮复习学案
第51讲　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
课标要求 1.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验（活动）。 2.利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验（活动）。
实验17　DNA的粗提取与鉴定
实 验 回 归
1.实验原理
（1）提取的原理
①DNA不溶于　　　　，但某些蛋白质可以，利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。
②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于　　　　的NaCl溶液。
（2）鉴定的原理：DNA＋二苯胺试剂　　　　。
2.方法步骤
（1）称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分　　　　。
（2）在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
（3）在上清液中加入体积相等的、预冷的　　　　溶液（体积分数为95%），静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的　　　　。将玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。
（4）取两支20 mL的试管，各加入2 mol·L－1的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4 mL的　　　　试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。呈　　　　的试管中含有DNA。
实 验 提 炼
1.DNA与蛋白质的溶解性
项目 溶解规律 2 mol·L－1NaCl溶液 0.14 mol·L－1 NaCl溶液
DNA 溶解 析出
蛋白质 NaCl溶液浓度从 2 mol·L－1降低到0.14 mol·L－1过程中，溶解度逐渐增大 部分发生盐析沉淀 溶解
2.实验注意事项
（1）取材原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
（2）过滤含DNA的研磨液时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。
（3）加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
（4）二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果
素 养 点 拨
试剂的选择和使用
生物实验中，对材料进行处理、实验具体操作及实验结果的检测等过程中，经常用到多种试剂，根据实验原理、材料性质、实验目的等选择合适的材料尤为重要，试剂的正确使用也影响着实验结果。
（1）用二苯胺鉴定DNA时需水浴加热，试回顾还有哪些试剂使用或实验过程中需水浴加热？请举例说明。
（2）高中生物实验中，哪些试剂使用时需现用现配？试举例。
典 题 固 法
1.（2022·山东卷）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（　　）
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
2.（2021·山东卷）粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（　　）
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37～40 ℃的水浴箱中保温10～15 min
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol·L－1→过
滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol·L－1
3.（2019·江苏卷）下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（　　）
A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
实验18　 DNA片段扩增及电泳鉴定
实 验 回 归
1.实验原理
（1）扩增原理：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够　　　　　　　的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
（2）电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷　　　　的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为　　　　的紫外灯下被检测出来。
2.PCR反应条件
①稳定的缓冲液环境；②DNA模板；③分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物（一小段　　　　　　）；④A、T、G、C 4种　　　　　　；⑤耐高温的DNA聚合酶，一般用　　　　　　　；⑥能严格控制　　　　变化的温控设备。
3.实验过程
（1）扩增DNA片段
①在微量离心管中依次加入各组分（配方略）。
②待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。
③参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 　　　℃，5 min / /
30次 94 ℃，30 s 　　　℃，30 s 　　　℃，1 min
最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
（2）电泳
①根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖　　　　。稍冷却后，加入适量的　　　　染料混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入　　　　内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V·cm－1。待指示剂前沿迁移接近　　　　时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于　　　　下观察和照相。
实 验 提 炼
实验注意事项
（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
（2）该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
（3）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
（4）在操作时，一定要戴好一次性手套。
典 题 固 法
1.（2021·湖北卷）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是（　　）
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
2.（2022·衡水调研）下列有关电泳的叙述，不正确的是（　　）
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
第51讲　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验17　DNA的粗提取与鉴定
【实验回归】
1.（1）①酒精　②2 mol·L－1　（2）蓝色
2.（1）研磨　（3）酒精　DNA　（4）二苯胺　蓝色
[素养点拨]　（1）提示：斐林试剂。另外，探究温度对酶活性的影响实验中，反应体系也需要在不同温度中水浴保温。　（2）提示：斐林试剂、双缩脲试剂和二苯胺试剂等。
【典题固法】
1.B　解析：低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中有的蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
2.A　解析：在得到的滤液中加入适量的木瓜蛋白酶，能够将染色体上的蛋白质成分分解，容易取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；加入木瓜蛋白酶后在37～40 ℃的水浴箱中保温10～15 min，能够提高DNA的相对含量，但是仅进行水浴加热不能提高DNA的含量，B错误；加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，可以令DNA快速析出，但是不能提高DNA的相对含量，C错误；加入NaCl调节浓度至2 mol·L－1，经过滤后调至0.14 mol·L－1，2 mol·L－1 NaCl溶液是为了溶解DNA，0.14 mol·L－1是为了析出DNA，不能提高DNA的含量，D错误。
3.A　解析：哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和细胞器，不能提取到DNA，鸡血、菜花、豌豆、菠菜等都具有细胞核，可以通过不同的方法提取DNA，用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量差异很大，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，D正确。
实验18　DNA片段扩增及电泳鉴定
【实验回归】
1.（1）自动调控温度　（2）相反　300 nm
2.DNA或RNA　脱氧核苷酸　Taq DNA聚合酶　温度
3.（1）③94　55　72　（2）①熔化　核酸　③电泳槽　⑥凝胶边缘　⑦紫外灯
【典题固法】
1.D　解析：PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合。
2.C　解析：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳，即带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，A正确，C错误。

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