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生物学技术与工程专题
第一讲：微生物的培养与发酵工程
第二讲：细胞工程与胚胎工程
第三讲：基因工程 ·上
第四讲：基因工程 ·下
第五讲：酶工程、凝胶电泳与色谱、 DNA粗提与鉴定等
01.培养基
02.无菌技术
03.微生物的培养
04.发酵工程
本节看点
1. 理解代谢类型不同微生物的培养要求
2. 区分碳源与能源的差异
3. 区分选择培养基与鉴别培养基
微生物的代谢类型
微生物 ：一般指直径小于0.1mm的生物
营养类型 碳源 能源
举例
光能自养型
化能自养型
异养型
氧化
NH3 NO2
氧化
NO3
附：硝化细菌的自养方式
C6H12O6 合成
放能
放能
CO2 光能
蓝藻等
CO2 化学能
硝化细菌、硫化细菌等
有机物 化学能
真菌、病毒、原生动物等
培养基的化学成分
成分
作用
碳源 无机碳源： CO2， NaHCO3等
①用于合成微生物的细胞物质和一些代谢产物
②异养型微生物的主要能源物质
有机碳源：糖类，脂肪酸等
注意： 碳源 ≠ 能源
如光能自养型微生物(蓝藻)的培养中， CO2作为碳源，但其能源来自于光能
培养基的化学成分
成分
作用
碳源 无机碳源： CO2， NaHCO3等
①用于合成微生物的细胞物质和一些代谢产物
②异养型微生物的主要能源物质
有机碳源：糖类，脂肪酸等
氮源 无机氮源： N2， NH3 ，硝酸盐等
用于合成蛋白质、核酸和含氮的代谢产物
有机氮源：尿素，牛肉膏蛋白胨等
牛肉膏： 是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有
牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色
蛋白胨： 将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气 息。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨
注意：
1. 某些微生物可以利用氮源作为能源，如硝化细菌
2. 某些既含碳元素又含氮元素的物质(如牛肉膏蛋白胨等)可以同时提供碳源和氮源
3. 牛肉膏主要为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素
培养基的化学成分
成分
作用
碳源 无机碳源： CO2， NaHCO3等
①用于合成微生物的细胞物质和一些代谢产物
②异养型微生物的主要能源物质
有机碳源：糖类，脂肪酸等
氮源 无机氮源： N2， NH3 ，硝酸盐等
用于合成蛋白质、核酸和含氮的代谢产物
有机氮源：尿素，牛肉膏蛋白胨等
水 H2O
①作为溶剂溶解营养物质
②调节溶液浓度，维持渗透压
③为培养对象的生存提供相应的水环境
无机盐 磷酸盐， 硫酸盐， 钾 、钙， 钠， 镁， 铁等盐类
①维持渗透压
②维持生物大分子和细胞结构的稳定性
③某些微生物的生长能源物质
铁细菌： 一类生活在含有高浓度二价铁离子的池
塘、湖泊、温泉等水域中，能将二价铁盐氧化成 三价铁化合物，并能利用此氧化过程中产生的能 量来同化二氧化碳进行生长的细菌的总称
培养基的化学成分
成分
作用
碳源 无机碳源： CO2， NaHCO3等
①用于合成微生物的细胞物质和一些代谢产物
②异养型微生物的主要能源物质
有机碳源：糖类，脂肪酸等
氮源 无机氮源： N2， NH3 ，硝酸盐等
用于合成蛋白质、核酸和含氮的代谢产物
有机氮源：尿素，牛肉膏蛋白胨等
水 H2O
①作为溶剂溶解营养物质
②调节溶液浓度，维持渗透压
③为培养对象的生存提供相应的水环境
无机盐 磷酸盐， 硫酸盐， 钾 、钙， 钠， 镁， 铁等盐类
①维持渗透压
②维持生物大分子和细胞结构的稳定性
③某些微生物的生长能源物质
生长因子 维生素、氨基酸、碱基、嘌呤、 嘧啶、生物素、烟酸等
一般是酶和核酸的组成成分
注意： 培养基中必须具备生长因子，但未必需要“单独添加”
培养基的类型
液体培养基： 主要用于工业生产、扩大化培养及动物细胞培养
不加凝固剂
固体培养基： 主要用于微生物的分离、纯化、鉴定、计数等
加入较多的凝固剂，如琼脂或明胶
半固体培养基： 主要用于观察微生物的运动
加入较少的凝固剂
物理状态
天然培养基： 如牛肉膏-蛋白胨培养基、锯末培养基、牛粪培养基等
人工合成培养基： 如MS培养基等
化学成分
培养基的类型——依照功能分类
根据微生物的特殊营养需求配制培养基或加入
某种化学物质，允许特定种类的微生物生长， 同时抑制或阻止其他种类微生物生长
常用于培养、分离特定微生物
※ 选择培养基 ※
类型1 ：根据微生物特殊营养需求
1. 以纤维素为唯一碳源——分离纤维素分解菌
2. 以尿素为唯一氮源——分离尿素分解菌
3. 缺乏单独添加氮源——分离固氮菌
类型2：加入化学物质抑制或杀死其他微生物
1. 加入青霉素——分离真菌
2. 加入高浓度食盐——分离金黄色葡萄球菌
3. 加入10%酚——分离放线菌
培养基的类型——依照功能分类
培养基中加特定化学物质，某种微生物生长代
谢产物可与培养基中化学物质发生反应，产生 特征性变化
主要用于微生物快速分类鉴定和筛选产生某种 代谢产物的微生物菌种
※ 鉴别培养基 ※
加入显色指示剂或显形指示剂
如伊红-美蓝、刚果红、酚红、明胶等
鉴别不同种类微生物
图为伊红-美蓝培养基培养大肠杆菌效果
培养基的类型——依照功能分类
常见的鉴别培养基
培养基名称 用途 加入化学物质 微生物代谢产物
培养基特性变化
伊红-美蓝培养基 鉴别大肠杆菌 伊红、美蓝 酸性物质
黑色
刚果红培养基 鉴别纤维素分解菌 刚果红 纤维素酶
透明圈
酚红培养基 鉴别尿素分解菌 酚红 脲酶
培养基变红
明胶培养基 鉴别产蛋白酶菌株 明胶 胞外蛋白酶
明胶液化
纤维素分解菌释放纤维素酶分解菌落周边纤维素使其变为葡萄糖供自身利用
注意：“透明圈”的理解与使用
刚果红 + 纤维素 = 红色
A
B
透明圈半径 菌落半径
越大效果越好
培养基配置的基本原则
细菌、放线菌——6.5~7.5
酵母菌、霉菌——4.5~6
营养全面、协调：碳源、氮源、水、无机盐、生长因子
目的明确：分离？鉴别？选择？扩大化培养？
控制pH条件
配制原则
灭菌处理
01.培养基
02.无菌技术
03.微生物的培养
04.发酵工程
本节看点
1. 理解灭菌与消毒的核心区别
2. 理解常见的灭菌与消毒操作
无菌技术
项目 条件 结果 常用方法
应用范围
消毒 较为温和的物理 或化学方法 仅杀死物体表面或内部部 分对人体有害的微生物 不包括芽孢和孢子 煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用75%酒精擦拭双手 用氯气消毒水源等
芽孢又称内生孢子，是细菌休眠体。芽孢含水量极低，抗逆性强，能经受高温、紫外线，电离辐射以及多种化学物质灭杀等 孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞。它是有丝分裂或减数分裂的产物；多数为单倍体，少数为二倍体
芽孢外膜
芽孢壳
核芯
皮层
芽孢壁
芽孢内膜
无菌技术
项目 条件 结果 常用方法
应用范围
灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外 所有微生物 包括芽孢和孢子 湿热灭菌法 (高压蒸汽灭菌法)
培养基及容器的灭菌
干热灭菌法
玻璃器皿及金属工具
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌箱 干热灭菌： 160 170 ℃下加热1 2h 高压蒸汽灭菌锅 100kPa 、121 ℃下维持15 30min。 灼烧灭菌(酒精灯)
01.培养基
02.无菌技术
03.微生物的培养
04.发酵工程
本节看点
1. 理解培养基的配制流程
2. 理解单菌落的定义及其获得方式
3. 掌握平板划线法的基本操作
4. 理解稀释涂布平板法的计数规则
5. 区分菌种保藏的不同方式
培养基的配置流程
灭菌 倒平板 平板倒置
计算 称量 溶化 调pH
牛肉膏(膏状物)
称量纸
注意：
由于牛肉膏为膏状物(粘稠)，所以在称量之后须连同称量纸一起进入溶化步骤
培养基的配置流程
灭菌 倒平板 平板倒置
计算 称量 溶化 调pH
②
③
④
①
1. 将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左后拔出棉塞
2. 右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰
3. 用左手拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10~20ml)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿皿盖
4. 等待平板冷却凝固，大约5~10min。然后将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上
培养基的配置流程
灭菌 倒平板 平板倒置
计算 称量 溶化 调pH
注意： 平板倒置的目的
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠。将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免 培养基中水分过快的蒸发
补充：
接种前：防止培养基与培养皿脱离；易于拿取
接种后：减少空气流通；防止失水干裂；防止杂菌污染； 利于营养物质的富集与吸收；防止菌落过 快扩散，方便计数
平板正置
平板倒置
单菌落
由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体
单菌落分离： 在一定的培养条件下，不同种微
生物表现出各自稳定的菌落特征
大小、形态、隆起程度和颜色
培养
∴ 形成单菌落的核心，是让每个微生物之间在培
养基上的“距离”变大
微生物B
微生物A
培养
平板划线法
接种环
酒精灯
菌液
①
将接种环放在火焰上灼 烧，直到接种环烧红
在火焰旁冷却接种环， 并打开棉塞
将试管通过火焰
②
③
④
将已冷却的接种环伸入 菌液中，沾取一环菌液
将试管口通过火焰，并 塞上棉塞
⑤
⑥
⑦
左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖，注意不要划破培养基
灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划 线的末端开始往第二区域内划线。重复以 上操作。在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连
平板划线法
接种环
酒精灯
菌液
冷却再插，烧后再画
头尾不连，用力不大
平板划线法
接种环
酒精灯
菌液
冷却再插，烧后再画
头尾不连，用力不大
注意： 平板划线法可以对微生物进行分离、纯化、鉴定，但无法计数
稀释涂布平板法
将涂布器浸 入盛有酒精 的烧杯中 取少量菌液(一般 为0.1mL)滴加到培 养基表面 将沾有少量酒精的涂布 器在火焰上引燃，待酒 精燃尽后冷却8-10s
用涂布器将菌液均与的 涂布在培养基表面，涂 布时可转动培养皿，使 菌液涂布均匀
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
涂布器
①
②
③
④
思考：
1. 稀释液的要求
2. 稀释倍数的选择
3. 同一稀释梯度实验次数 4. 是否需要空白对照
5. 统计结果可靠性
6. 与血球计数板的对比
稀释涂布平板法
注意：
1. 稀释液要严格保证无菌，所以一般采用无菌水进行稀释。 2. 涂布平板用菌液量一般为0.1ml
3. 通常选择一定稀释范围的样液培养，保证菌落数在30~300之间 4. 同一稀释度的对照平板不少于3个，且菌落数不应相差很大
5. 设置空白对照实验，提高实验结果的可信度
6. 相较于血球计数板，稀释涂布平板法只对活菌计数 7. 统计的菌落数往往比活菌实际数目偏小
将涂布器浸 入盛有酒精 的烧杯中 取少量菌液(一般 为0.1mL)滴加到培 养基表面 将沾有少量酒精的涂布 器在火焰上引燃，待酒 精燃尽后冷却8-10s
用涂布器将菌液均与的 涂布在培养基表面，涂 布时可转动培养皿，使 菌液涂布均匀
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
涂布器
①
②
③
④
菌种保藏
方法 操作 目的
频繁使用 的菌种 临时保藏 ①菌种接种到试管固体斜面培养基上，适宜温度培养 ②菌落长成后将试管放入4℃冰箱中保藏 ③每隔3~6个月，转移菌种至新培养基 注意：临时保藏菌种易被污染或产生变异
保持菌种的纯净
长期保存 甘油管藏 ①3ml甘油管中装入1ml甘油，灭菌 ②将1ml培养的菌液转移到甘油管中与甘油充分混合 ③将甘油管放入-20℃冷冻箱中保存
增大接种面积，创造合适的条件
固体斜面培养基
常见微生物生长的影响因素
环境因素 影响机理 最适条件
不适宜因素导致结果
温度 影响蛋白质和 核酸结构 25~37℃
低温时反应速率降低；高温时蛋白质和核酸结构被破坏
pH 影响酶活性和 膜稳定性 细菌： 6.5~7.5 真菌： 4.5~6.0
酶活性或膜稳定性改变；新陈代谢受阻
氧气 影响微生物呼 吸作用或生命 不同微生物所需 条件不同
①严格厌氧型：短时间有氧造成生长停滞或死亡
②兼性厌氧型：无氧时无氧呼吸，有氧时有氧呼吸
③好氧型：无氧条件下难以生存
微生物的生长规律
01.培养基
02.无菌技术
03.微生物的培养
04.发酵工程
本节看点
1. 理解传统发酵技术的原理
2. 理解各菌种的代谢类型
3. 掌握亚硝酸盐鉴定的基本方式
传统发酵技术——果酒
菌种 代谢 类型 发酵原理 发酵 条件 注意事项
物质鉴定
果 酒 酵母菌 (真核) 异养 兼性 厌氧 有氧呼吸细胞增殖 酵母菌有氧呼吸增加细胞数量 无氧呼吸酒精发酵 酵母菌无氧呼吸产生酒精与CO2 T:18-25℃ pH:5-6 1.实验器具70%酒精消毒 2.葡萄先冲洗后去梗 3.果汁量不高于发酵瓶2/3 4.注意及时排气 5.果酒酒精浓度不高于14%
酸性重铬酸钾
橙黄 →灰绿
选取葡萄 冲洗 榨汁 发酵10-12天
1. 葡萄先冲洗后去梗—— 防杂菌污染
2. 70%酒精对器皿消毒
3. 先发酵瓶留1/3空间——先有氧增殖 （或者先通气后密封也可）
4. 发酵过程控温18-25℃
5. 发酵过程严格密封
6. 果酒浓度一般不超过14% （酵母菌会死亡）
7. 注意定期排气 （排出CO2）
8. 生成物检测： 酸性重铬酸钾——橙黄 → 灰绿
酵母菌
传统发酵技术——果醋
菌种 代谢 类型 发酵原理 发酵 条件 注意事项
物质鉴定
果 醋 醋酸 杆菌 (原核) 异养 需氧 型 糖源充足 糖 醋酸 糖源不足 酒精 醋酸 T:30-35℃ O2 充足 全通气
果醋鉴定
1. 有糖用糖，无糖用酒
2. 发酵过程控温30-35℃
3. 持续通氧 （无菌空气是最经济的选择）
4. 果醋的鉴定方法
①观察菌膜的形成
②嗅味和品尝
③比较发酵前后的pH
选取糖源 冲洗 榨汁 发酵7-8天
醋酸杆菌
传统发酵技术——腐乳
菌种 代谢 类型 发酵原理 发酵 条件 注意事项
物质鉴定
腐乳 毛霉 (真核) 异养 需氧 型 酶的催化 1.蛋白酶 Pr 氨基酸 + 多肽 2.脂肪酶 脂肪 甘油 + 脂肪酸 T:15-18℃ 1.豆腐含水量70% 2.加盐调味并析出豆腐水分 3.越接近瓶口盐量越大 4.盐浸提毛霉菌丝的蛋白酶 5.卤汤含12%酒精，抑菌 6.香辛料调味，抑菌
——
1. 豆腐含水量70%左右（否则易碎）
2. 发酵过程控温15-18℃
3. 加盐调味并析出豆腐水分，防止酥烂
4. 越接近瓶口，盐量越大 （防杂菌污染） 5. 加盐还可以浸提毛霉菌丝的蛋白酶
6. 卤汤中加12%酒精，抑制微生物生长
7. 香辛料调制风味，防腐杀菌
8. 封瓶时将瓶口通过酒精灯火焰，防止污染
豆腐上长出毛霉 加盐腌制 加卤汤装瓶 密封腌制
毛霉
传统发酵技术——泡菜
菌种 代谢 类型 发酵原理 发酵条件 注意事项
物质鉴定
泡菜 乳酸菌 (原核) 异养 厌氧型 乳酸菌无氧呼吸 T:20℃ 1.5%~20%盐水 2.盐水煮沸后冷却 2.泡菜坛严格密封 3.标准显色液现用现配
亚硝酸盐鉴定
发酵 成品
盐水没过全部菜料
泡菜坛严格密封
坛盖边沿水槽中注满水
称取 食盐 配制 盐水
泡菜 盐水
修整、洗涤、晾晒 切分成条状或片状
加入调味 料，装坛
亚硝酸盐 含量测定
选择原料
乳酸杆菌/链球菌
5%~20%浓度盐水，煮沸后冷却
盐调味抑菌；煮沸杀菌，冷却为保乳酸菌存活
亚硝酸盐的鉴定
亚硝酸盐是一种分布广泛的食品添加剂，低剂量不危害人类健康，大部分随尿液排出
亚硝酸盐在适宜的pH、温度和一定的微生物作用会转化为亚硝胺
亚硝胺具有致癌作用，对动物具有畸形和突变作用，人类的某些癌症与亚硝胺有关 亚硝酸盐含量的鉴定方法为比色法，其机理包括：
①NO2- ＋ 对氨基苯磺酸 → 反应物；
反应物 ＋ N －1 －萘基乙二胺盐酸盐 → 玫瑰红色染料。
②亚硝酸盐溶液的浓度高，颜色深；溶液浓度低，颜色浅。
(2)检测步骤：配制溶液 → 制备标准显色液 → 制备样品处理液 → 比色
传统发酵技术
菌种 代谢 类型 发酵原理 发酵 条件 注意事项
物质鉴定
果 酒 酵母菌 (真核) 异养 兼性 厌氧 有氧呼吸细胞增殖 酵母菌有氧呼吸增加细胞数量 无氧呼吸酒精发酵 酵母菌无氧呼吸产生酒精与CO2 T:18-25℃ pH:5-6 1.实验器具70%酒精消毒 2.葡萄先冲洗后去梗 3.果汁量不高于发酵瓶2/3 4.注意及时排气 5.果酒酒精浓度不高于14%
酸性重铬酸钾
橙黄 →灰绿
果 醋 醋酸 杆菌 (原核) 异养 需氧 型 糖源充足 糖 醋酸 糖源不足 酒精 醋酸 T:30-35℃ O2 充足 全通气
果醋鉴定
传统发酵技术
菌种 代谢 类型 发酵原理 发酵 条件 注意事项
物质鉴定
腐乳 毛霉 (真核) 异养 需氧 型 酶的催化 1.蛋白酶 Pr 氨基酸 + 多肽 2.脂肪酶 脂肪 甘油 + 脂肪酸 T:15-18℃ 1.豆腐含水量70% 2.加盐调味并析出豆腐水分 3.越接近瓶口盐量越大 4.盐浸提毛霉菌丝的蛋白酶 5.卤汤含12%酒精，抑菌 6.香辛料调味，抑菌
——
泡菜 乳酸菌 (原核) 异养 厌氧 型 乳酸菌无氧呼吸 T:20℃ 1.5%~20%盐水 2.盐水煮沸后冷却 2.泡菜坛严格密封 3.标准显色液现用现配
亚硝酸盐鉴定

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