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《微生物培养技术与应用》相关知识解读及实例分析
一、实验室培养微生物的基本思路：
（主要是培养用于发酵的细菌和真菌）
1、为微生物提供合适的营养--配置合适的培养基
2、为微生物提供合适的环境条件--控制适宜的培养条件
3、确保其他微生物无法混入--无菌处理
4、将需要的微生物分离出来--用相应的方法分离
培养基：按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质。培养基可用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
培养
分离
鉴定
保存
菌落：由单个微生物细胞接种到培养基表面或内层时，当它占有一定的发展空间并处于适宜的培养条件下，该细胞就会迅速生长繁殖形成一堆肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。
二、培养基
1、培养基的营养成分
提示：培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中，不需加入氮源。如：培养固氮菌不需要加入氮源。
（1）水分
（2）无机盐
（3）碳源：提供碳元素的物质。有机碳源 —— 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等（异养微生物）；无机碳源 —— CO2 、 CO32- 、 HCO3-等（自养微生物）。
（4）氮源：提供氮元素的物质。有机氮源 —— 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等；无机氮源 —— NH4＋ 、 NO3- 、 NH3等。。
（5）特殊营养物质：主要指生长因子
①概念：是一类调节微生物正常生长代谢所必需，但不能用简单的碳、氮源自行 合成的有机物。
②种类：维生素、碱基、卟啉、胺类等。
③来源：酵母膏、玉米浆、麦芽汁、蛋白胨、动植物组织提取液等。
2、培养基的分类
天然培养基：化学成分不十分清楚或成分不恒定的天然有机物制成的培养基；一般用于大规模的生物发酵工业
合成培养基：化学成分完全清楚的培养基；一般用于实验室进行的、要求可重复性强的各项研究
（1）按化学成分
：
加入凝固剂（琼脂）
液体培养基：不含凝固剂、呈液体状态的培养基
固体培养基：含有凝固剂、呈固体状态的培养基
（2）按物理性质分
选择培养基：根据某种微生物的特殊营养要求配置
鉴别培养基：加入能与目的菌的代谢产物发生显色反应的指示剂
（3）按作用分
（1）pH 、O2条件
培养霉菌
培养细菌
培养厌氧微生物
培养基pH调至酸性
培养基pH调至中性或弱碱性
控制培养环境为无氧
3、培养条件
（2）温度条件
例析、某培养基成分如下：
葡萄糖 (NH4)2SO4 K2HPO4 KH2PO4 MgSO4 CaCl2
4~10g 4g 7g 2g 1g 0.02g
微量元素(Fe、Co、Mn、Zn、Cu、Ni、Mo)各2~10μg，蒸馏水1000mL，pH7.2
下列相关叙述正确的是（　　）
A．从培养基组成来看，该培养基属于固体培养基
B．从培养基的pH分析该培养基可用于培养霉菌
C．去掉（NH4)2SO4该培养基可用于选择培养固氮微生物
D．微量元素在生物体中含量很少，培养基中可以不加或少加
C
点评：从培养基组成来看，没有添加琼脂，该培养基属于液体培养基；从培养基的pH（中性）分析该培养基可用于培养细菌；去掉（NH4)2SO4该培养基可用于选择培养固氮微生物；微量元素在生物体中含量很少，但功能必不可少，培养基中必须添加。
（1）无菌技术：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
4、无菌技术
（2）无菌操作对象：
①实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒
② 培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
无菌操作过程中，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
概念：使用较温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
方法：
①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
②巴氏消毒法：62-65℃煮30min或 80℃-90℃下处理30s-1min。可杀死绝大多数微生物，不破坏食物的营养成分。
③化学药物消毒法：用75%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等.
④紫外线消毒法：对接种室、接种箱或超净工作台用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。
（3）方法：消毒、灭菌
①消毒
概念：用强烈的理化方法杀死物体内外的所有的微生物，包括芽孢和孢子。
芽孢：某些细菌生长到一定阶段，在细胞内形成的休眠体
孢子：某些生物的繁殖体
②灭菌
芽孢和孢子具有高度的耐热性，可抗化学药物和抗辐射
灭菌方法：
高压蒸汽灭菌锅
方法1、湿热灭菌
方法2、干热灭菌
方法3、灼烧灭菌
干热灭菌箱
接种环灼烧灭菌
充分燃烧层
不充分燃烧层
方法：
湿热灭菌
干热灭菌
1
方法：
灼烧灭菌：迅速彻底灭菌
2
3
接种环的灼烧灭菌
例析、无菌技术是获得纯净微生物培养物的关键。下列相关叙述正确的是（　　）
A．实验过程中所有器皿、培养基及生物材料均需进行灭菌处理
B．酒精能使细胞中的蛋白质变性失活，70%的酒精用来灭菌效果最好
C．试管口、瓶口等易被污染的部位，接种时可通过火焰灼烧来灭菌
D．不耐高温的牛奶可使用巴氏消毒法，其优点是能够杀死全部微生物，保留牛奶风味
点评：实验过程中生物材料消毒处理；酒精能使细胞中的蛋白质变性失活，75%的酒精用来灭菌效果最好；试管口、瓶口等易被污染的部位，接种时可通过火焰灼烧来灭菌；不耐高温的牛奶可使用巴氏消毒法，其优点是能够杀死部份微生物，保留牛奶风味。
C
三、微生物的纯培养
1、培养物：将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。
2、纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体。
3、纯培养：获得纯培养物的过程，包括配制培养基→灭菌→接种→分离→培养等环节。采用划线或涂布的接种方法实现目标微生物的分离与纯化
①分散的微生物在适宜的固体培养培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见菌落。
②采用平板划线法或稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上。之后经培养得到的的单菌落一般是由单个为微生物繁殖形成的纯培养物。
（1）微生物的纯培养的原理
③平板划线法
通过接种环在固体培养基（平板）表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到由单个微生物繁殖而形成的单菌落。
材料
天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸(或报纸)、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱、恒温培养箱
酵母菌培养液
提供接种
用的酵母菌
马铃薯
葡萄糖(或蔗糖)
蒸馏水
琼脂
配制酵母菌固体培养基
（2）微生物的纯培养过程
步骤1
配置培养基
步骤2
灭菌
--高压蒸汽灭菌
步骤3
倒平板
①拔出锥形瓶的棉塞
②将瓶口迅速通过火焰
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10 ~ 20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置，防止冷凝水滴落在培养基上引发污染。
待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
防止瓶口微生物污染
步骤4
接种和分离酵母菌
步骤4
接种和分离酵母菌
注意：
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次；
②划线首尾不能相接；③每次划线前接种环进行灭菌；
④划线后，培养皿倒置培养。
步骤5
培养酵母菌
将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右 (培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异) 的恒温培养箱中培养24 ~ 48h。
例析1.无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中正确的是（ ）
A.紫外线照射前，适量喷洒石炭酸等消毒液，可以加强消毒效果
B.牛奶的消毒常用紫外线消毒法
C.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D.在微生物接种的实验中，用95%酒精对实验者的双手和超净工作台进行消毒
A
点评：用紫外线照射30min，可以杀死物体表面或空气中的微生物，在照射前，适量喷洒石碳酸等消毒液，牛奶消毒常用巴氏消毒法即62-65℃煮30min或 80℃-90℃下处理30s-1min，可杀死绝大多数微生物，不破坏食物的营养成分；为了防止污染，接种环经火焰灭菌、冷却后才可以快速挑取菌落；在微生物接种的实验中，一般用75%酒精对实验者的双手进行消毒，用紫外线照射30min对超净工作台进行灭菌。
例析2.如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为1→2→3→4→5，下列说法正确的是（ ）
A.操作前要将接种环用酒精消毒
B.划线操作须在酒精灯火焰附近进行
C.只有在5区才可以得到所需菌落
D.在1、2、3、4、5区域中划线前后都不需要对接
种环灭菌
B
点评：每次划线前、后都要将接种环放在火焰上灼烧灭菌;在5个区域中,只要有单个活细菌,通过培养即可获得所需菌落。
四、微生物的选择培养和计数
1、稀释涂布平板法
培养：待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板倒置,放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。在涂有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落
7
方法1、平板划线法
方法2、稀释涂布平板法
稀释涂布平板法除了可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
2、获得单菌落的方法
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
方法1、稀释涂布平板计数法计数
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
（2）原则：一般选择菌落数在30-300的平板进行记数。同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值，可减小实验误差。
（3）注意：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不用活菌数来表示。
★
3、微生物的计数方法
方法2、显微镜直接计数法
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
（2）特点：快速、直观，能观察微生物的形态特征。不能区分死菌和活菌，统计结果一般是活菌数和死菌数的总和
（1）提出问题：
①如何分离土壤中能分解尿素的细菌？
②如何计算每克土壤样品中有多少分解尿素的细菌？
（2）基础知识：①绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。
②利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
提供无机盐
提供碳源
提供氮源
提供水分
4、探究与实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
步骤1.土壤取样
①要求：富含有机质、酸碱度接近中性的潮湿土壤。
城市：公园里、街道旁、花盆中；农村：农田里、菜园里。
②取样土层：距地表3~8cm的土壤层，取样时一般要铲去表层土
步骤2.配置培养基
配置以尿素为唯一氮源的培养基和牛肉膏蛋白胨培养基
（3）实验设计
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
提供无机盐
提供碳源
提供氮源
提供水分
测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105、1×106倍稀释倍数进行平板培养。
步骤3.样品的稀释
步骤4.涂布平板：选用1×104、1×105、1×106 、1×107倍稀释倍数进行涂布平板。
1×106
1×107
1×104
1×105
无菌水
对照
步骤5.培养观察与计数：倒置于30~37℃下培养1~2d
1×106
1×107
1×104
1×105
无菌水
例析1.稀释涂布平板法是分离菌种常用的方法，下列相关叙述不恰当的是（ ）
A.固体培养基灭菌后，应冷却至50℃左右时倒平板
B.倒好的平板需立即使用，以免表面干燥，影响菌的生长
C.稀释涂布平板分离到的单菌落需进一步划线纯化
D.稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数
B
点评：固体培养基灭菌后，应冷却至50℃左右时倒平板，固体培养基中含有琼脂，40℃左右会凝固，因此温度过低会导致培养基凝固无法倒平板；倒好的平板需要冷却后使用，且不宜久存，以免表面干燥，影响接种后微生物的生长；平板涂布分离到的单菌落仍需进一步划线纯化，以利于菌种保藏；结合分析可知，平板涂布法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数。
例析2.为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
B
点评：分析平板结果可知，采用的接种方法为平板划线法，且划线顺序是Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区，可以看到Ⅲ区中出现了单菌落；倒平板后无需晃动；Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，故应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；出现单菌落即达到了菌种纯化的目的；刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
例析3.营养缺陷型菌株是野生型菌株经过人工诱变或自发突变失去合成某种成长因子的能力，只能在补充了相应的生长因子的基本培养基中才能正常生长的变异菌株。某研究小组对酵母菌用紫外线照射后将其接种到甲培养皿的培养基上，一段时间后将甲培养皿的菌落影印接种(不改变菌落位置)到乙、丙两培养皿的培养基中，进一步培养得到如下图所示结果。下列分析正确的是（ ）
A.接种到甲培养皿采用的是平板划线法
B.甲、丙两培养皿中的培养基是基本培养基
C.甲培养皿中菌落数有可能比接种的酵母菌数少
D.甲、乙、丙三个培养皿都可能存在营养缺陷型菌落
C
点评：甲培养皿的菌落均匀分布，接种方法应为稀释涂布平板法；甲、丙培养基菌落数目多，包括野生型酵母菌菌株和某种营养缺陷型酵母菌菌株，乙培养皿菌株是某种营养缺陷型酵母菌菌株，乙培养皿的培养基是基本培养基，甲和丙是加入了同种营养成分的培养基；由于基因突变具有不定向性，接种到甲培养皿的酵母菌可能还有其他营养缺陷型，且有些菌落不一定由一个酵母菌形成，所以，甲培养皿中菌落数有可能比接种的酵母菌数少；乙培养皿的培养基是基本培养基，形成的菌落只可能是野生型菌落。
例析4.解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是（ ）
A.甲菌属于解脂菌
B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
B
点评：根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌；乙菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌落也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观；可以利用该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标可以以菌落周围深蓝色圈的大小。
例析5.含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是（ ）
A.乙菌的运动能力比甲菌强
B.为不影响菌的运动需选用液体培养基
C.该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D.穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
B
点评：两种菌的繁殖速度相等,在两种菌数量相等的前提下,由图可知,乙的运动能力比甲强；穿刺接种一般用固体或者半固体培养基,液体培养基中微生物是悬浮培养,由图可以判断出该培养 基不是液体培养基；黑色沉淀区域面积大小反应微生物的运动能力强弱,但不能反映出硫化氢的量；防止杂菌污染是多种接种技术的关键和核心。

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