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《基因工程的操作工具及操作的基本程序》
知识解读及实例分析
一、基因工程概念
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程(重组DNA技术/转基因技术)的概念理解 操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
基本过程 剪切→拼接→导入→表达
原理 基因重组
结果 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
1、限制性内切核酸酶----“分子手术刀”
（1）来源：主要来自原核生物
（2）种类：数千种，限制酶不是一种酶，而是一类酶。
GAATTC
CTTAAG
（3）特点：能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，如下图。
二、基因工程操作的基本工具
③结果：产生黏性末端或平末端，如右图。
GAATTC
CTTAAG
①作用部位：特定切点上的磷酸二酯键
②识别序列长度：大多数是6个核苷酸序列，如右图。
EcoRⅠ
中轴线
粘性末端
平末端
SamⅠ
④沿中轴线切开，产生平末端；沿中轴线两侧切开，产生粘性末端，如下图。
⑤能被限制性酶特异性识别的切割位点一般都具有回文序列：即在切割位点，DNA一条链正向读的碱基序列与另一条反向读的碱基序列完全一致，如下图。
⑥在切割含目的基因的DNA分子时，需要在目的基因的两端都用限制性核酸内切酶切割，会产生4个末端。
⑦切割线性DNA一次产生两个DNA片段，但切割环状DNA一次只产生一个DNA片段，环状DNA变为线性DNA。
2、DNA链接酶 ---- “分子缝合针”
（1）作用：将双链 DNA双链片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
E.coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
从大肠杆菌中分离得到
只能链接互
补黏性末端
从T4噬菌体中分离得到
黏性末端与平末端均可连接，但连接平末端的效率相对比较低。
（2）种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶
（3）作用部位：磷酸二酯键，且DNA连接酶没有识别特异性。
E.coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
（4）DNA连接酶与DNA聚合酶的区别与联系
相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶
不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；DNA连接酶连接的是DNA片段。
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，
形成两条长链
（5）几种相关酶的比较
例析1.下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是（ ）
注：Y为C或T，R为A或G。
A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
限制酶名称　 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
C
点评：BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成的黏性末端是不相同的。
例析2.第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是（ ）
A.构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒
B.图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团
C.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物
D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
C
点评：用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，会产生多种连接产物，有目的基因自连、质粒自连、目的基因与质粒正反向连接等。
3、基因进入受体细胞的载体----“分子运输车”
（1）作用：将目的基因转入受体细胞并在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
①能在受体细胞中稳定保存并复制
②有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因
③具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞
④对受体细胞无害、易分离
（2）运载体需具备的条件
普通培养基
不含抗生素
选择培养基
50 g/ml四环素
载体上标记基因的标记原理
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
（3）种类：通常是用质粒，噬菌体、动植物病毒也可以。
三、DNA的粗提取与鉴定
05
1、实验原理
①利用DNA、RNA、蛋白质和脂质在理化性质方面的差异进行提取和分离，DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2M的NaCl溶液中，DNA不溶于（冷）酒精，但某些蛋白质溶于酒精
②在一定的温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
①研磨：10g香蕉果肉＋10mL研磨液，充分研磨。
②过滤：双层尼龙纱布过滤。
③离心：3000r/min离心2min，取上清液。
④加冷酒精：入等体积冷酒精，静置3～5min，用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起丝状物。
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶活性
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
NaCl 溶解DNA
2、实验步骤
⑤鉴定：丝状物或沉淀物＋二苯胺试剂2mL混匀，95℃沸水浴加热10min，冷却后观察到蓝色（二苯胺试剂2mL不加DNA做对照）。
从左至右：少量DNA、大量DNA、空白对照
例析1.下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（ ）
A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C.预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
A
点评：兔是哺乳动物，成熟的红细胞中无细胞核，提起不到DNA。
例析2.下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液
B.采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质
C.用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损
D.将白色丝状物溶解在NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后振荡,观察颜色变化
B
点评：DNA在体积分数为95%酒精溶液中溶解度最低，可以析出DNA达到去除部分杂质提纯DNA的目的。
四、基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达
载体的构建
将目的基因
导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
1、目的基因的筛选与获取
（1）目的基因筛选方法：
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
（2）获取目的基因方法：
①人工合成目的基因
②用PCR特异性地快速扩增目的基因
① PCR是聚合酶链式反应的缩写。根据DNA半保留复制的原理，在体外（PCR扩增仪）提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
（3）利用PCR获取和扩增目的基因
②利用PCR获取和扩增目的基因时应具备以下条件:
A、DNA的两条链需要解链、打开,用高温即可，两条链提供复制的模板。
B、需要四种脱氧核糖核酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，合成子链的原料。
C、需要耐高温DNA聚合酶，催化合成DNA子链。
D、需要两种引物，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
DNA模板
加热至90℃以上
使双链分开
冷却至50℃左右使引物与DNA结合
引物
DNA合成
+DNA聚合酶
+dATP +dGTP
+dCTP +dTTP
第一轮的产物
①变性
90℃以上
②复性
③延伸
冷却
加热
50℃左右引
物模板结合
72℃左右DNA从5’端到3’端延伸。
72℃时，
③PCR获取和扩增目的基因的过程
①变性
②复性
③延伸
循环
获取目的基因时至少要经过三次循环才能分离出目的基因，共消耗引物2n-2个
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
④PCR获取和扩增目的基因的鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。
例析1.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实
现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如
下图所示。下列分析不正确的是（ ）
A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩
增的结果
B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基
C.①过程需要先加热至90℃以上后再冷却至50℃左右
D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD
D
点评：PCR扩增DNA的过程中，新合成的两条单链延伸方向相反，PCR1应选择引物a和b，PCR2应选择引物c和d，突变产物AD扩增选择的引物是a和d。重叠延伸时，可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸，所以不需要引物，所以D错误。
例析2.为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ）
A.①＋③ 　　　B.①＋②
C.③＋② 　　　D.③＋④
B
点评：引物①③同向，另一端缺少引物，A错误；B、引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列，B正确；C、引物③扩增的片段不含启动子，不含外源高效启动子片段，C错误；D、引物③扩增的片段不含启动子，不含外源高效启动子片段，D错误。
例析3、根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段。请从图中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取 作为引物进行扩增，得到的片段将用于获取该基因的全序列信息。
B、C
点评：右图中可知被插入的基因片段位置，再根据四种引物的延伸方向可推知，选用引物BC才能将被插入的基因片段扩增。
2、基因表达载体的构建(核心工作)
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
（1）基因表达载体的作用
① 让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；
② 使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）基因表达载体的组成（见右图）
①目的基因
②标记基因
③启动子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。
④终止子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，终止转录。
构建载体时，需要用同种限制酶切割载体和目的基因，以获得相同的黏性末端，便于两者顺利连接。但是由于被切割后的质粒本身也具备相同的黏性末端，所以会有一定概率的自身环化，因此常用两种酶分别切割载体和目的基因（即双酶切），避免目的基因和质粒任意连接。见下图
(3)基因表达载体的构建过程
3、将目的基因导入受体细胞
（1）目的基因导入受体细胞
细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2+处理法（感受态细胞法）
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
（2）农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
农杆菌生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
①将花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定。
②将新鲜的从叶片上取下的圆形小叶与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
4、目的基因的检测与鉴定
检测目的基因
DNA分子杂交
检测mRNA
检测表达的蛋白质
分子杂交
抗原—抗体杂交
PCR反应
PCR反应
标记基因
标记基因
（1）分子水平检测
普通培养基
不含抗生素
选择培养基
50 g/ml四环素
①抗性鉴定
（2）个体水平鉴定
②抗虫鉴定
棉铃虫
棉铃虫（死亡）
例析1、某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5'末端,获得了L1-GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题。
(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是　　　　 。使用这两种酶进行酶切是为了保 ,也是为了保证 。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了 和 过程。
E1和E4
甲的完整　
甲与载体正确连接
转录
翻译
(3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:将能够产生绿色荧光细胞的　　　　
移入牛的 中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的 (填“mRNA”、“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
细胞核
去核卵母细胞
核DNA
例析2、水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉,直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻,实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑,从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需的酶是
,重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为 。
(2)根据启动子的作用推测,Wx基因启动子序列的改变影响了 ,从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比,3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列 (填“发生”或“不发生”)改变,原因是 。
限制性核酸内切酶和DNA连接酶
转化
RNA聚合酶与启动
子的识别和结合
不发生
编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子　
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响,科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经过 程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA,原因是　　　　　　　　　　　　 。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如下图所示,据图推测糯性最强的品系为 　　　　,原因是 。
引品系3的Wx mRNA最少,控制合成的直链淀粉合成酶最少,直链淀粉合成量最少,糯性最强
逆转录
物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)　　
品系3

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