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《植物细胞工程》
知识解读及实例分析
一、植物组织培养技术
1、概念：植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
外植体：用于植物组织培养的离体的植物器官、组织或细胞。
2、原理：植物细胞全能性
细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能，即细胞具有全能性。
外植体
愈伤组织
芽、根
植株
脱分化
再分化
脱分化：已经分化的细胞，经过诱导，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程。
愈伤组织：细胞排列疏松且无规则、高度液泡化、高度未分化、呈无定形状态的薄壁细胞团。
再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化出根或芽等器官的过程。
（1）植物组培常见的几种途径：
①胚胎发生途径：外植体→愈伤组织→胚状体→幼苗
②器官发生途径：外植体→愈伤组织→（发芽）丛状苗→生根
③不经过愈伤组织途径：腋芽（含分生组织）→（发芽）丛状苗→生根
3、过程：
（2）通过器官发生的途径再生成植株。分生细胞需要在一定的诱导条件下才能重建芽的分生组织，分化出芽后生根，进而形成完整植株。生长素和细胞分裂素的比例和浓度都会影响植物细胞的发育方向
适宜的激素比例
细胞分裂素
生长素
低→利于芽的分化
高→利于根的分化
适中→利于愈伤组织的形成
材料与用具
材料：幼嫩的菊花茎段、MS培养基、无菌水、体积分数为70%的酒精、质量分数为5%的次氯酸钠。
用具：锥形瓶、烧杯、酒精灯、超净工作台、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、解剖刀、镊子、培养皿。
步骤
①准备外植体
②取材切段
③接种外植体
④诱导脱分化
⑤诱导再分化
⑥移栽试管苗
炼苗
4、实例：菊花的组织培养
外植体
愈伤组织
芽、根
植株
脱分化
再分化
例析1.某科研小组拟培育一种名贵菊花的脱毒苗，其技术路线为“制备MS固体培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培”，下列相关叙述错误的是（ ）
A.取材部位应选择植物顶端分生区附近，因其分裂旺盛且病毒少
B.外植体消毒常进行无菌水冲洗、酒精处理、消毒液处理等措施
C.接种时，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中
D.“外植体接种→培养→移栽”的过程中不需要更换培养基
D
点评：取材部位一般选择植物顶端分生区附近，因其分裂旺盛且病毒少，易于培养；外植体必须消毒，可以用酒精消毒，同时也可以进行流水冲洗、消毒液处理；培养的不同阶段，对主要营养物质和激素的需求不同，所以培养过程中要及时调整各种营养物质、激素的比例，及时更换培养基，否则会导致外植体死亡。
例析2.为探究矮牵牛原生质体的培养条件和植株再生能力，某研究小组的实验过程如图。下列叙述正确的是（ ）
A.过程①获得的原生质体需悬浮在30%蔗糖溶液中
B.过程②需提高生长素的比例以促进芽的分化
C.过程③需用秋水仙素处理诱导细胞壁再生
D.原生质体虽无细胞壁但仍保持细胞的全能性
D
点评：获得的原生质体若悬浮在30%的蔗糖溶液中会导致原生质体失水皱缩甚至死亡;过程②为再分化过程,需提高细胞分裂素的比例以促进芽的分化;过程③不需要用秋水仙素处理,愈伤组织细胞已经具备细胞壁;原生质体虽无细胞壁,但含有细胞核等结构,即含有个体发育所需的全部遗传信息,故原生质体仍保持细胞的全能性。
二、植物体细胞杂交技术
1、概念：植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
2、优缺点：打破远缘亲本杂交生殖隔离，扩展杂交亲本组合范围；有可能杂交不成功，即使杂交成功也可能不产生人们想要的性状。
番茄-马铃薯(理想图)
3、过程
（1）去除细胞壁，获得原生质体
①方法：酶解法纤维素酶和果胶酶
②注意：去除细胞壁的植物细胞需要保证渗透压稳定，可以加入山梨醇和甘露醇来稳定渗透压，防止细胞吸水涨破或失水皱缩。
（2）诱导原生质体融合
②方法：物理方法和化学方法
物理方法：电融合法、离心法；
化学方法：聚乙二醇(PEG)法、高Ca2+-高pH融合法
再生出细胞壁
正在融合的原生质体
①原理：细胞膜具有流动性
③注意：融合后杂种细胞需要经过筛选才能获得所需要的杂种细胞！
例析1.花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病，野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株，流程如右图。下列相关叙述错误的是（ ）
A.①通常将植物细胞置于含纤维素酶和果胶酶的30%的蔗糖溶液中
B.细胞融合成功的标志是再生出细胞壁，此时细胞内高尔基体和线粒体活动明显增强
C.可通过观察叶绿体的有无来初步筛选杂种细胞
D.用此方法获得新品种的育种原理是染色体变异
A
点评：通常将植物细胞置于含纤维素酶和果胶酶的30%的适宜浓度的甘露醇溶液中以保持一定的渗透压，其作用是保持原生质体的完整性；高尔基体与细胞壁的形成有关；过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中有供体的叶绿体存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。
例析2.下图是通过植物体细胞杂交技术获得“番茄—马铃薯”植株的技术流程图，下列说法正确的是（ ）
A.图中过程②表示再分化的过程
B.植物体细胞融合完成的标志是原生质体融合
C.已知番茄、马铃薯分别为四倍体、二倍体，
则“番茄—马铃薯”属于三倍体
D.该过程体现了植物细胞的全能性
D
点评：据图分析可知,②表示人工诱导原生质体融合的过程;植物体细胞融合完成的标志是再生出新的细胞壁;由于番茄、马铃薯分别为四倍体、二倍体,因此植物体细胞杂交得到的“番茄-马铃薯”属于异源多倍体中的异源六倍体。
例析3.中华猕猴桃原产我国长江中下游,抗寒能力弱;狗枣猕猴桃原产俄罗斯,耐低温,但果实小。将两种猕猴桃原生质体进行融合,得到果大且抗寒的杂种植株。以下分析错误的是（ ）
A.此项技术体现了植物细胞具有全能性
B.两原生质体融合成功的标志是再生出新的细胞壁
C.用PEG促进两个亲本的原生质体融合
D.杂种植株和两个亲本不存在生殖隔离
D
点评：细胞的全能性是指已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能，两种猕猴桃细胞原生质体融合形成杂种细胞，杂种细胞经过脱分化和再分化获得杂种植株，这体现了植物细胞具有全能性；可以用PEG促进两个亲本的原生质体融合；杂种植株是两种猕猴桃经过植物体细胞杂交技术培育的新物种，不同物种之间一般是不能相互交配的，故杂种植株和两个亲本可能存在生殖隔离。
1、植物繁殖的新途径
特点：保持优良品种的遗传特性；高效快速地实现种苗的大量繁殖
（1）快速繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。被人们形象地称为植物的快速繁殖技术。也叫做微型繁殖技术。
经济林木 濒危植物 优良观赏植物 无性繁殖作物
三、植物细胞工程的应用
（2）作物脱毒培育
应用：在马铃薯、草莓、大蒜、甘蔗、菠萝和香蕉等许多作物上获得成功。
顶端分生区(如茎尖、根尖：病毒极少，
甚至无毒)
组培
脱毒苗
明显提高农作物的产量和品质
①方法花药离体培养、人工诱导染色体加倍
②步骤
2、作物新品种的培育
花药中的花粉
单倍体幼苗
脱分化
纯合二倍体
人工诱导染色体加倍
愈伤组织
再分化
离体培养
（1）单倍体育种
③优点：明显地缩短育种年限，当年就可以获得纯合二倍体植株。
④实例：国科学家1974年成功培育出世界第一个单倍体作物新品种——单育1号烟草。
我国科学家把单倍体育种与常规育种结合起来，育成水稻、玉米、油菜、甘蓝和甜椒等作物的新品种。
染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易出现
例析、某二倍体植物是杂合体，下图为其花药中未成熟花粉在适宜的培养基上培养产生完整植株的过程。据图回答：
(1)图中①表示的是该花粉培养过程中的______过程，②表示的是_______过程，X代表的是_______，③表示的是 过程，④表示的是诱导________过程。
(2)图中从愈伤组织形成完整植株的途径有两条，具体通过哪一条途径主要取决于培养基成分中______的种类及其浓度配比，最后获得的来源于未成熟花粉的完整植株都称为_______，植株(甲)未成熟花粉经培养能形成完整植株，说明未成熟花粉具有________。
(3)对植株甲进行_______，才能使其结实产生后代(乙)，否则植株甲只有通过_______的方式才能产生后代(丙)。乙、丙两种植株中，能产生可育花粉的是 植株，该植株群体中每一植株产生可育花粉的基因组成种类数为______种，该群体植株产生可育花粉的基因组成种类为_____种。花药培养在育种上的特殊意义是 ，从而开辟育种新途径。
脱分化
再分化
胚状体
分化(或发育)
生根
激素
单倍体
全能性
染色体加倍
无性繁殖
乙
一
多
缩短育种周期
（2）突变体的利用
②原理：突变(基因突变、染色体变异)
①来源：在植物组织培养过程中,由于培养细胞一直处于不断增殖的状态，因此它们容易受到培养条件和诱变因素(如射线、化学物质等)的影响而产生突变。从突变的个体中筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。
③优点与缺点：
优点--提高愈伤组织的突变率，可以获得高产、优质、抗逆的新品种，加快育种进程。
缺点--突变具有不定向性、多害少利性和低频性的特点，因此需要处理大量突变材料才有可能少选出需要的品种。
④实例：培育抗病植株、抗盐植株等
例析、（作物新品种的培育）花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病。野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图：
据图回答下列问题：
(1)过程①所需的酶是__________________________。
(2)过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中有供体的________存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。
纤维素酶和果胶酶
叶绿体
(3)原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是______________________。原生质体经过__________再生，进而分裂和脱分化形成愈伤组织。
(4)若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和__________________植株的根尖，通过________、________、染色和制片等过程制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的形态和数目。
(5)采用特异性引物对花椰菜和黑芥基因组DNA进行PCR扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种植株的鉴定。下图是用该引物对双亲及再生植株1～4进行PCR扩增的结果。据图判断，再生植株1～4中一定是杂种植株的有________。
(6)对杂种植株进行________接种实验，可筛选出具有高抗性的杂种植株。
保持原生质体完整性　　
细胞壁
双亲(或花椰菜和黑芥)　
解离　
漂洗
1、2、4
黑腐病菌
（1）次生代谢物
植物代谢产生一些不是植物基本生命活动所必需的产物——次生代谢物。初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动,因此在整个生命过程中它一直进行着。
①种类：糖类、脂质、蛋白质和核酸等
②作用：植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。
3、细胞产物的工业化生产
③植物次生代谢物工厂化生产的原因：含量低、从植物组织提取会大量破坏植物资源（直接获取困难）；有些产物不能或难以通过化学合成途径得到（化学合成困难）
外植体
细胞悬液
脱分化
细胞产物
愈伤组织
分散开
培养提取
④生产过程
（2）应用：
来源：紫草细胞中提取的一种药物和色素
作用：抗菌、消炎、康肿瘤
②植物细胞工程产品--紫杉醇（传统生产方法：从红豆杉树皮和树叶中提取）
来源：红豆杉属植物体内产生一种次生代谢产物
作用：具有高抗癌活性，已广泛用于乳腺癌等癌症的治疗
我国在人参、三七等植物细胞的大规模培养领域取得了很大的进展。
①世界首例药用植物细胞工程产品 --紫草宁
例析1、（细胞产物工厂化生产）人参是一种名贵中药材，其有效成分主要是人参皂甙。利用细胞培养技术生产人参皂甙的大致流程如图所示。请回答：
(1)配制诱导愈伤组织的固体培养基，分装后要进行______，接种前，要对人参根进行________。
(2)用于离体培养的根切成的小块叫做_______。
(3)用少量________酶处理愈伤组织，获取单细胞或小细胞团，在液体培养基中进行悬浮培养，可有效提高人参皂甙合成量。
灭菌
消毒
外植体
果胶
例析2.花粉植株是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。下面是培育四季柑橘(2n＝18)花粉植株的过程示意图，下列错误的是（ ）
A.花粉植株培育的原理是花粉粒细胞具有全能性，其技术是植物组织培养
B.过程③是细胞再分化，其根本原因是基因的选择性表达
C.四种培养基中所含植物激素的种类和比例相同
D.观察处于分裂中期的四季柑橘花粉植株根尖细胞，可观察到9条染色体
C
点评：生长素和细胞分裂素的比例和浓度都会影响植物细胞的发育方向，所以四种培养基中所含植物激素的种类和比例不相同；四季柑橘体细胞中染色体数为18,它的花粉是通过减数分裂产生的,花粉细胞中的染色体数为9,因而分裂中期时细胞中染色体数为9。
例析3.人工种子是将组培产生的体细胞胚和性细胞胚包裹在能提供养分的胶囊里,在胶囊外包一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜,形成一种类似于种子的结构。下列错误的是（ ）
A.人工种子的胚状体通过植物组织培养技术得到
B.人工种皮、人工胚乳与正常种子相应结构的作用相似
C.通过体细胞胚状体得到的植株,不能再进行有性生殖
D.解决某些作物发芽率低、繁殖力差、结子困难等问题
C
点评：通过体细胞胚状体得到的植株,和正常植株一样，可以再进行有性生殖产生后代。

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