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《动物细胞工程》
知识解读及实例分析
一、动物细胞培养技术
1、动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养、动物细胞融合和细胞核移植等，其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。
2、动物细胞培养：是从动物体中取出相关的组织或器官,将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下,让这些细胞生长和增殖的技术。动物细胞培养是对体内细胞生长和繁殖的模拟。
3、动物细胞培养所需基本条件
动物细胞培养所需的基本条件
其他条件
营养条件
糖类、氨基酸、无机盐、维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压、适宜的气体环境
将细胞所需的上述营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基(区别天然培养基)。培养动物细胞一般使用液体培养基,也叫培养液。
由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此，在使用合成培养基时，通常需加入血清和血浆等一些天然成分。
（1）营养条件
（2）无菌、无毒的环境
无菌：无菌操作—防止培养过程中的微生物污染。
无毒：定期更换培养液—清除代谢产物，防止代谢产物积累对细胞造成危害。
（3）温度、pH和渗透压
温度：36.5±0.5℃；pH：7.2-7.4；渗透压：维持细胞正常形态
（4）气体环境
O2：细胞代谢所必须；CO2 ：维持培养液的pH值。用培养皿或松盖培养瓶，在95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
4、动物细胞培养的过程
（1）动物细胞培养的过程图解
机械方法、胰蛋白酶处理或胶原蛋白酶理
动物
组织块
分散成
单个细胞
加培养液
细胞
悬液
放入培养瓶
在适宜条件
在适宜条
件分瓶培养
原代培养
传代培养
（2）原代培养：将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经过处理后的初次培养称为原代培养。
（3）传代培养：将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
（4）体外培养动物细胞分为两类
①悬浮生长细胞：细胞能够悬浮在培养液中生长增殖
②贴壁生长细胞：细胞需要贴附于某些基质(如培养瓶壁)表面才能增殖(主要类型)
（5）细胞贴壁：悬液中大多数分散的细胞很快就贴附在瓶壁上生长增殖，这种现象称为细胞贴壁。
（6）接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为接触抑制。但肿瘤细胞失去接触抑制，在培养液可以无限增殖下去。
（7）细胞株与细胞系
①细胞株:传代培养的细胞能传到10~50代,这样的传代细胞称为细胞株。
②细胞系:传代培养的细胞在传到50代后,部分细胞的遗传物质发生改变,并且具有癌变的特点,能够无限地传代下去,这样的传代细胞称为细胞系。
1、干细胞：机体中能进行自我更新（产生与自身相同的子代细胞）并具有多向分化潜能（分化形成不同细胞类型）的一类细胞称为干细胞，如图。
二、干细胞培养及其应用
（1）胚胎干细胞(ES细胞)：存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。特点：体积小、 细胞核大、核仁明显。取自早期胚胎。也叫做全能干细胞。
2、干细胞分类：
（2）成体干细胞：存在于成体组织或器官内中，包括骨髓中的造血干细胞，神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞。成体干细胞具有组织特性，一般只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
（1）再生医学：
运用克隆技术获得患者“自身” 的胚胎干细胞，然后在合适的条件下，定向分化成患者所需的各种细胞类型，如胰岛细胞可用于移植和糖尿病的治疗。如图示过程。
3、干细胞应用
①胚胎干细胞的培养：将治疗性克隆技术与人胚胎干细胞的制备相结合，利用体外构建的自身组织与器官来使患者得以康复。
②“诱导性多潜能干细胞”的制备：日本京都大学教授山中伸弥在2006 年， 选取了24 个对胚胎干细胞维持十分重要的基因，在小鼠的成纤维细胞中诱导表达，最后发现同时转入4 种基因（Oct4、Sox2、c-myc 和KLF4）就可诱导产生一种多能干细胞，称“诱导性多潜能干细胞”（iPScell）。iPS技术是干细胞研究领域的一项重大突破，它回避了历来已久的伦理争议，解决了干细胞移植医学上的免疫排斥问题。
取出
病人
移植
转入相关因子，细胞发生转化
成纤维细胞
iPS细胞
分化
各种类型的细胞
例析1.为初步检测药物X和Y的抗癌活性,在细胞培养板的每个孔中加入相同数量的肝癌细胞,使其贴壁生长,实验组加入等体积相同浓度的溶于二甲基亚砜(溶剂)的药物X或Y,培养过程及结果如下图所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A.细胞培养液中通常需要加入血清
B.可用胰蛋白酶处理使肝癌细胞脱落下来并进行计数
C.对照组中应加入等体积的无菌蒸馏水
D.根据实验结果，可以初步判断药物X的抗癌效果较好
C
点评：细胞培养液中一般都要加入少量的血清，其原因是有利于细胞生长与分裂；用胰蛋白酶处理肝组织，可使肝细胞表面的蛋白质被分解，使细胞之间失去相连的物质，可以获得游离的肝癌细胞并计数；实验采用单一变量原则，对照组应加入等体积的二甲基亚矾，以排除溶剂对实验结果的干扰；根据实验结果可知，对照组(7.8×106)>药物Y(5.3×105)>药物X(6.7×104)，加入药物X的实验组存活的癌细胞数最少，所以，药物X的抗癌效果较好。
例析2.下列有关干细胞的叙述，错误的是( )
A.干细胞是具有分裂和分化能力的细胞
B.造血干细胞可定向诱导分化成机体所有种类的细胞
C.胚胎干细胞在饲养层细胞上培养能够维持不分化的状态
D.移植胚胎干细胞可使退化的组织得以修复并恢复正常功能
B
点评：造血干细胞是专能干细胞，可定向诱导分化成机体的各种血细胞。
1、概念：动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交细胞就有原来两个细胞的遗传遗传信息。
3、方法：
（1）物理方法：电融合法、离心法
（2）化学方法：聚乙二醇（PEG）法
（3）生物方法：灭活病毒诱导法
2、原理：与植物原生质体融合的基本原理相同即依赖细胞膜的流动性
肺结核病病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
三、动物细胞融合技术
（3）灭活病毒诱导法
灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
①突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。
②研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
③利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
（3）动物细胞融合的意义
1、传统抗体的生产方法
向动物反复
注射某种抗原
使动物产生抗体
从动物血清中
分离所需抗体
产量低、纯度低、特异性差
四、单克隆抗体及其应用
05
由于动物会接触多种天然抗原，体内相应产生的特异性抗体种类可以达到百万种以上，但每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的淋巴细胞，形成细胞群。
一个B淋巴细胞
B淋巴
细胞群
单克隆
抗体
克隆
产生
×
2、体外培养B淋巴细胞不具有无限增殖的能力
3、1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：
B细胞
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
抗体
4、米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程示意图
4、米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程示意图
单克隆抗体制备过程图解
5、单克隆抗体的应用
（1）诊断疾病：作为诊断试剂
（2）治疗疾病：运载药物；作为药物治疗疾病
D
例析1、利用细胞工程方法，以SARS病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体。下列叙述正确的是（ ）
A、用纯化的核衣蛋白反复注射到小鼠体内，产生的血清抗体为单克隆抗体
B、体外培养单个效应B细胞可以获得大量针对SARS病毒的单克隆抗体
C、将等量效应B细胞和骨髓瘤细胞混合，经PEG诱导融合后的细胞均为杂交瘤细胞
D、利用该单克隆抗体与SARS病毒核衣壳蛋白特异性结合的方法可诊断出病毒感染者
例析2、为研制抗病毒A的单克隆抗体,某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题。
(1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A,该处理的目的是 。
(2)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞,需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于 ,使用该培养基进行细胞培养的结果是
图中筛选2含多次筛选,筛选所依据的基本原理是 。
(3)若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖,可采用的方法有
(答出2点即可)。
将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖
或将杂交瘤细胞在体外培养
诱导小鼠甲产生能够分泌
抗病毒A抗体的B淋巴细胞
选择培养基
只有杂交瘤细胞能够生存　
抗原与抗体的反应具有特异性　
例析3、人乳头瘤病毒(HPV)是一种DNA病毒,可诱发细胞癌变。抗HPV的单克隆抗体可以准确检测出HPV,从而及时监控宫颈癌的发生。以HPV衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体的过程如图所示。下列错误的是( )
A.在HAT培养基上存活的杂交瘤细胞既能无限增殖又可分泌抗体
B.单克隆抗体的特点是灵敏度高、特异性强，可以大量制备
C.可用HPV衣壳蛋白检测筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞
D.单克隆抗体制备过程涉及的生物学原理有细胞增殖和细胞膜的选择透过性
D
点评：由于小鼠骨髓瘤细胞不能在HAT培养基上生长，所以，在HAT培养基上存活的杂交瘤细胞既能无限增殖又可以分泌抗体；单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌，与血清抗体相比，其特点是灵敏度高、特异性强，可以大量制备；抗原和抗体可特异性结合，故可用HPV衣壳蛋白检测筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞；单克隆抗体的制备过程主要运用的细胞工程技术包括动物细胞培养和动物细胞融合，原理依次是细胞的增殖、细胞膜具有一定的流动性。
例析4、一个抗原往往有多个不同的抗原决定簇，一个抗原决定簇只能刺激机体产生一种抗体，由同一抗原刺激产生的不同抗体统称为多抗。将非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72注入小鼠体内，可利用该小鼠的免疫细胞制备抗p72的单抗，也可以从该小鼠的血清中直接分离出多抗。下列说法正确的是( )
A.注入小鼠体内的抗原纯度对单抗纯度的影响比对多抗纯度的影响大
B.单抗制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合
C.利用该小鼠只能制备出一种抗p72的单抗
D.p72部分结构改变后会出现原单抗失效而多抗仍有效的情况
D
点评：抗原纯度越高，获得的单抗纯度也越高，相反多抗纯度减少，即注入小鼠体内的抗原纯度对单抗纯度的影响比对多抗纯度的影响小；融合后的杂交瘤细胞进行培养后还要进行抗体阳性检测才可获得大量抗p72的单抗；将非洲猪瘟病毒农壳蛋白p72注入小鼠体内，可利用该小鼠的免疫细胞制备抗p72的单抗，也可以从该小鼠的血清中直接分离出多抗；一个抗原有多个抗原决定簇，产生多种抗体，p72部分结构改变后抗p72的单抗失效，对其他的抗体不影响，即多抗仍有效。
1、概念：将动物的一个细胞（胚胎细胞或体细胞）的细胞核，移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。
五、动物细胞核移植技术
06
2、原理：动物体细胞核的全能性
3、种类：
①胚胎细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易
②体细胞核移植：细胞分化程度高，恢复全能性十分困难
4、供体与受体：供体提供细胞核；受体（去核卵细胞）提供细胞质
供体高产奶牛
①收集牛卵巢，采集卵母细胞
②通过显微操作去核
③从供体高产奶牛身体的某一部分取体细胞，进行培养
④将供体细胞注入去核的卵母细胞
⑤通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞形成重构胚
⑥将胚胎移入受体(代孕)母牛体内
⑦生出与供体奶牛遗
传物质相同的犊牛
5、动物细胞核移植过程
6、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
畜牧业
加速家畜遗传改良进程、促进改良畜群繁育
医药卫生
克隆动物（也经过转基因操作）的细胞、组织、器官可作为异种移植的供体
科研
保护濒危物种
问题
①成功率低
②克隆动物存在健康问题
③克隆动物食品的安全性问题存在争议
例析1、2018年1月国际顶尖学术期刊《Cell》杂志报道，我国科学家以一只雌性猕猴胎儿成纤维细胞为核供体成功克隆两只猕猴，成为全球首例体细胞克隆灵长类动物。下列相关叙述错误的是（ ）
A.这项技术证明高度分化的动物体细胞具有全能性
B.研究中需要使用成熟卵母细胞作为核移植的受体
C.培育出的两只雌性猕猴的基因组成几乎完全相同
D.克隆猕猴的成功为大量培育灵长类遗传病模型动物提供了可能
A
点评：核移植培育出的动物，证明了高度分化的动物体细胞核具有全能性；
研究中需要使用成熟卵母细胞作为移植核的受体；培育出的两只猕猴的细胞核取自同一个体，故培育出的两只猕猴的基因组几乎完全相同；克隆称猴的成功为大量培育灵长类遗传病模型动物提供可能。
例析2、“中中”和“华华”是两只在我国出生的克隆猕猴，它们也是国际上首例利用体细胞克隆技术获得的非人灵长类动物。如图表示培育“中中”和“华华”的流程。下列相关叙述正确的是（ ）
A.图示过程中利用的技术有核移植和干细胞移植技术等
B.这两只克隆猕猴是由同一受精卵发育而成的双胞胎
C.融合细胞的培养过程需要无菌、无毒的环境和营养等条件
D.利用A猴的胚胎干细胞核移植获得克隆猕猴的难度更大些
C
点评：图示过程中利用的技术有核移植技术和早期胚胎培养技术、胚胎分割技术等；A猴提供了细胞核，B猴提供了去核的卵细胞，形成重组卵细胞再发育成早期胚胎，然后将其移植到C猴中产下了2个个体，属于无性繁殖；融合细胞的培养过程需要无菌无毒的环境和营养等条件；胚胎干细胞的全能性比体细胞的全能性高，所以利用 A 猴的胚胎干细胞核移植获得克隆猕猴的难度要小些。

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