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(共24张PPT)
微专题10 PCR技术与电泳相关问题
1.原理与条件
一、PCR的原理
2. PCR过程
结论：
① n次复制后含有引物A的_______个。
含有引物B的_______个。同时含有引物A和B的_______个。
②从第____次扩增开始能够获得单纯的目的基因。
2n-1
2n-1
2n-2
3
例.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是
A.用PCR方法扩增目的基因时不必
知道基因的全部序列
B.设计引物时需要避免引物之间形
成碱基互补配对而造成引物自连
C.复性温度过高可能导致
PCR反应得不到任何扩增产物
D.第四轮循环产物中同时含有引物A和引
物B的DNA片段所占的比例为15/16
D
若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
②④
3.引物的基本要求：
引物自身不能环化
两种引物之间不能互补配对
引物长度不宜过短，防止引物随机结合
（1）传统PCR结果分析
对扩增后的DNA染色处理后凝胶电泳分离。DNA电泳是根据DNA分子大小来分离和识别DNA片段的技术。较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
缺点：只能作定性分析，不能准确定量。易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制。
4.PCR的结果检测
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
（2）（实时）荧光定量PCR（（r）RT-PCR）
rRT-PCR可以分两部分来看，其中r代表实时（real-time），主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。 ；RT表示逆转录（reverse transcription）。在RT-PCR中，通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA（图1）。
2019-nCoV 核酸检测
优点：
早期诊断、灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据。
二.PCR的应用
（1）检测是否被病毒感染
（2）反向PCR测定未知DNA区域
（3）PCR定点突变技术—重叠延伸PCR
P345例1变式.(2022·扬州市高三期中)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是 （ ）
（1）检测是否被病毒感染
下列说法错误的是（ ）
A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交
C
P345例2.(2)如果要同时扩增两种基因，则试剂盒中的引物应该有________种。图1为新冠病毒的“ORFlab”基因对应的cDNA片段结构示意图，则与之对应的引物结合的部位应该是图中的________(子链延伸方向为其自身的5′→3′，用图中数字作答)。若已知该基因的一条引物，________(填“能”或“不能”)依据其碱基序列设计出另一条引物，理由是__________________。
4
4、1
不能
两种引物的碱基序列没有相关性
例2.(3)在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断积累，荧光信号的强度也随之增加。根据荧光强度的变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线(如图2)。
试剂盒中的原料、引物和探针数量一定，超出一定的循环数后，荧光分子不再增加
①出现“平台期”最可能的原因是__________________________。
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制性内切核酸酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。
（2）反向PCR测定未知DNA区域
该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
PCR定点突变技术—重叠延伸PCR
重叠延伸PCR技术是常规PCR技术的衍生，它依据需要连接的基因中核苷酸序列(或基因片段)设计出多对具有互补末端的引物，先分段对模板进行扩增，再将PCR产物混合，其中的重叠链将相互搭桥、互为模板而延伸，最终实现不同来源的扩增片段重叠拼接起来的目的，如下图1所示。请分析并回答下列问题：
看懂图1引物2和引物3之间的关系
②理论上，在检测过程中，有荧光信号出现，则说明检测结果呈________(填“阴”或“阳”)性，但为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。现有两个待检样本，检测时都出现了如图2所示的曲线，但甲的A点比乙的A点明显左移。请给这种结果作出科学合理的解释(试剂盒合格且正常，操作过程规范且准确)：______________。
阳
甲样本中的新冠病毒核酸含量更高，达到阈值所需的循环数更少
(1)图1中的过程②在______个反应体系中进行，原因是_____________。
经过程②后，体系中存在不同长度的DNA片段，获取所需DNA的方法是 。①中引物2和引物3的游离部分分别与_ 的部分序列。同源。
外显子B、外显子A
2
引物互补影响PCR结果
(琼脂糖凝胶)电泳分离
(2)图1中的过程⑥________(填“需要”或“不需要”)另加引物，原因是__________________。
进行②⑥⑧⑩过程时，需要在一定的缓冲溶液中进行，⑩过程除图示条件还需要加入______________________。
两条DNA的交错部分即可作为其延伸的引物
不需要
原料(四种脱氧核苷酸)、耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)
(3)重叠延伸PCR技术可用于基因的定点突变。基因定点突变是根据目的基因(如图2蛋白A基因)的序列，设计4条单链寡核苷酸片段为引物(图2中的引物A→D)，原理是取引物A、B进行PCR1反应，以及引物C、D进行PCR2反应，然后将需要的两个片段混合、延伸并大量扩增。图2引物B和引物C中的“ ”代表 ，引物B和引物C碱基序列间存在的关系是__________。
突变的碱基
互补
PCR定点突变技术—大引物PCR
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。
某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。
1.若拟突变位点的碱基对为A—T，
则需要让其突变为_______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为__________(假设引物为单链DNA)。
C—G或T—A
G或A
某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。
2.中引物2或引物3设计的要求是 .
将两个基因的未端序列设计在同一引物中（或引物2和引物3中必须具有互补配对的片段）

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