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第五章 植物细胞培养技术
植物的单细胞分离及培养
植物细胞的悬浮培养
植物细胞的规模培养 植物细胞培养的应用
本章主要内容
知识目标
掌握植物的单细胞分离方法
掌握植物的单细胞培养方法
植物细胞规模培养技术要点
掌握植物细胞悬浮系的建立以及种细胞的筛选方法。
了解植物细胞悬浮培养生物反应器主要类型及其特点
了解提高细胞次生代谢产物的途径
能力目标
会分离植物单细胞（详见实验实训指导）。
会培养植物单细胞（详见实验实训指导）。
能力目标
会分离植物单细胞（详见实验实训指导）。
会培养植物单细胞（详见实验实训指导）。
第一节　植物单细胞的分离
单细胞的分离通常主要采用
机械法;
酶解法;
愈伤组织分散法等。
一、由植物器官分离单细胞
要从完整植物器官中分离单细胞，通常主要采用机械法和酶解法等。
叶片是分离单细胞的最好材料。
1、由完整的植物器官分离单细胞
机械法
酶解法
叶片是分离单细胞的最好材料
⑴ 机械法
Ball&Joshi (1965)、Noggle (1967)、Joshi &Ball (1968)
研究者和时间：
研究材料：
花生成熟叶片
第一种方法：用刀片刮叶片
具体方法
撕去下表皮
露出叶肉细胞
用解剖刀刮下细胞
第二种方法：叶片研碎、离心
研碎成粉
加研磨介质
过滤、离心
只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。
⑵ 酶解法
Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞
加果胶酶
过滤、离心
机械法和酶解法比较
机械法
酶解法
细胞不受到酶的伤害；
不用质壁分离；
细胞产量低；
细胞易破。
细胞受到酶的伤害；
要质壁分离；
细胞产量高；
细胞不易破。
注意：大麦，小麦和玉米，很难通过酶解法使细胞分离。（叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间链状互锁结构）
二、由愈伤组织分离单细胞
这是用愈伤组织分离获得游离单细胞的方法。它是将园艺植物的器官或组织采用一般的组织培养方法诱导愈伤组织，把产生的愈伤组织继代培养，然后将继代培养的愈伤组织置于悬浮培养液中。可加少量纤维素酶和果胶酶以促使愈伤组织离散，还可用搅拌．振荡等方法加速其离散。
最后，将这种悬浮液用一定规格的细胞筛去除未分散的愈伤组织和较大的细胞团，这样剩下的游离细胞和较小细胞团的悬浮液即可作为接种液。
主要步骤：
1 诱导产生愈伤组织；
2 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；
3 将这种悬浮液用一定规格的细胞筛去除未分散的愈伤组织和较大的细胞团，这样剩下的游离细胞和较小细胞团的悬浮液即可作为接种液。
二、由愈伤组织分离单细胞
茎段
诱导
步骤：
摇床用于振荡
继代
悬浮
将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物
优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。
第二节 单细胞培养技术
本节主要介绍植物单细胞培养的意义、培养方法、影响因素和注意事项。
一、植物单细胞培养的意义
1．建立单细胞无性系；
2．排除体细胞的干扰，有利于对细胞活动跟踪观察；
3．培养用于无性繁殖，大大提高繁殖速度；
4. 用于生物科学研究；
5. 有目的的改造园艺植物种质资源。
二、单细胞培养的方法
单细胞培养的方法有液体浅层培养；
微室培养（微滴培养）；
平板培养；
看护培养；
悬浮培养等。
（一）液体浅层培养
1．概念：液体浅层培养是指先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，石蜡膜封口，静置培养。
2．液体浅层培养法特点：
优点：培养物与空气接触面大，有利于气体交换，通气性好；细胞代谢产物容易扩散，有利于有毒物质的扩散，不会造成有害物质的危害；继代培养方便．便于观察。
缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察单细胞生长．分裂后，难以得到单细胞系。
1、液体浅层培养法
将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团
培养在浅层液体培养基中
液体培养基
用途：主要用来增殖细胞。
特点：
有利于有毒物质的扩散；
有利于气体交换；
不利于定点观察；
单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。
（二）微室培养（微滴培养）（40-100μl）
1．概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，即将细胞培养在很少量的培养基中，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。
薄层培养微室制作示意图
微室培养（Microculture）图示：
1滴含单细胞培养液
周围加石蜡油
凹穴载玻片
旁边加石蜡油
盖盖玻片
盖盖玻片
平视图
置培养皿中26~28 ℃恒温培养
4-2 微室培养特点：
在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。
4-3 微室培养要求：
（1）微室内不能有气泡。
（2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖 玻片 的厚度要在0.17~0.18毫米左右。
（3）观察时要保持温度和培养时的一致。
（三）平板培养
1．概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养(一般是将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合接种）
2. 主要用途
是为了分离单细胞无性系，研究其生理、生化遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。
广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。 One of the most widely used method for single cell cultrue
Think over what the advantages and disadvantages are for it.
3. 特点
可以定点观察；
分离单细胞系比液体浅层培养容易；
培养细胞气体交换不畅。
固体培养基
4. 平板培养的基本技术
(1)、培养基配制 1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。
（2）悬浮细胞密度的调制
平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为1×10 ~ 100×10 个/ml 。
初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。
调制方法：若悬浮液中细胞密度高，
则加培养液稀释；若悬浮液中细胞密
度过低，则通过离心使细胞沉淀后，
取一定量的上清液使其达到所要求
的密度。
若悬浮液与培养基以1:4混合，
则应把悬浮液的细胞密度调到
5×10 ~ 500×10 个/ml。
（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ ）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板，盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。
(4) 培养： 26℃置暗处培养21天。低倍显微镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。
细胞的平板培养示意图
植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。
每个平板上形成的细胞团数
植板效率=
该平板上接种的细胞数
5. 平板培养必须注意的方面
（1）选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是能够在低的初始植板密度下使细胞生长。
（2）不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分裂旺盛时期的细胞才有最高的植板率。
（3）在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种类而不同。如：烟草细胞适宜的为5~10 ×10 个/ml,若低于此数则植板率显著下降。
（4）接种时培养基的温度要控制，一般不超过35 ℃ 。
（四）看护培养
1.概念： 指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。
2. 用途：⑴ 诱导形成单细胞系。Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞株。⑵ .诱导花粉形成单倍体细胞系。 Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培养。
3. 看护培养基本技术
（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。
（2）在无菌的条件下，先将一小块（1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm ）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。
（3）将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。
（4）恒温培养。
看护培养示意图之一
A.愈伤组织及滤纸 B.滤纸上接种单细胞
C.滤纸上形成细胞团 D. 新形成球形胚
看护培养（Nurse culture）图示之二
Nurse callus
Filter paper
Single cell
单细胞无性系
恒温培养1个月
2~3月
用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使
其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织
4. 要求：
（1）看护愈伤组织处于活跃生长状态；
（2）愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也可以不同。
离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养下则分裂，为什么？
Nurse callus provides nutrition and other substances that enhances cell division.
（营养物质和促进细胞分裂物质）
5. 特点：
（1）效果好，易于成功。
（2）简便易行。
（3）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。
⑷ 看护培养适用于难于培养的植物种类 。
注意：要得到单细胞系必须保证
接种材料是真正的单细胞。
三、影响单细胞培养的因素
1．植物因素：不同基因型对培养反应不同。
2．培养基成份：
3．初始细胞植板密度(>临界密度)
2、培养基成份
3、初始细胞植板密度(>临界密度)
三、影响单细胞培养的因素
相互依赖
植板密度较高时，与悬浮培养中或愈伤组织中相似的培养基即可；较低时，则成份非常复杂，可加入椰子汁，水解酪蛋白或酵母浸出液等物质.
临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。
初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。一般要求每毫升在1000个细胞以上。
4．培养方式的影响
培养方式不同也是重要的影响因素
固体培养；
液体培养。
其他因素
5.生长激素
加1种细胞分裂素和几种氨基酸。临界密度只需25-30细胞/毫升。激素配比不当影响培养效果。
6.pH PH值不适或变化过大都不利于培养。
7.CO2 培养容器内气体状况也是重要的影响因素 。
四、细胞培养注意事项
1．实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
2．无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。
3. 实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
4．工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。操作过程中，小心毒性药品，并避免尖锐针头之伤害等。
5.实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
思考题：
如何得到单离的细胞？
单细胞培养有哪些方法？
影响单细胞培养因素？
再 见 ！

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