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传统发酵技术的应用与发酵工程
第十单元　生物技术与工程
与旧教材对比 增：①科技探索之路；②发酵工程的发展历程；③发酵工程及其应用。
改：①腐乳制作内容精减；②亚硝酸盐含量的鉴定放入课后习题。
内容要求——明考向 近年考情——知规律
(1)举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的；(2)阐明发酵工程利用微生物进行发酵来生产特定的产物；(3)举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上的应用；(4)利用乳酸菌发酵制作泡菜(活动)；(5)利用酵母菌、醋酸菌分别制作果酒和果醋(活动)。 2021·湖北卷(3)、2021·辽宁卷(8)、2021·全国乙卷(37)、2020全国卷Ⅲ(37)
01
考点一　传统发酵技术的应用
1.发酵的概念？类型？传统发酵技术的概念？特点？类型？
2.腐乳制作:主要菌种？代谢类型？生长温度？发酵原理？
3.泡菜制作：菌种来源？代谢类型？种类？气体环境？发酵原理（化学方程式）？制作过程？怎样创造无氧环境？加“陈泡菜水”目的？泡菜制作过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化情况？
4.果酒制作：菌种来源？代谢类型？生长温度？发酵原理（化学方程式） ？
5.果醋制作：菌种？生物类别？代谢类型？发酵原理（糖源充足？糖源不足？）？
6.果酒果醋制作过程：冲洗葡萄时要不要先除去枝梗？装罐时为什么留大约1/3的空间？拧松瓶盖目的？
7.果酒制作过程中为什么有气泡？酒的颜色为什么是深红色？如何检测酒精？放置久的葡萄酒表面为什么有一层白膜？
一、发酵与传统发酵技术
1.发酵的概念
发酵是人们利用　　　，在适宜的条件下，将原料通过　　　　　　转化为人类所需要的产物的过程。
微生物
微生物的代谢
2.传统发酵技术
固体
半固体
有氧或无氧　
二、传统发酵食品的制作
1.腐乳制作
(1)原理：蛋白质　　　 　　　　　　　　　。脂肪 　　　　　　。
(2)腐乳制作过程中参与的微生物：毛霉是一种丝状　　，其繁殖方式为　　　　，代谢类型是　　　　型。
2.泡菜的制作
(1)乳酸菌发酵制作泡菜的原理：_______________________________。
小分子的肽和氨基酸
甘油和脂肪酸
真菌
孢子生殖
异养需氧
乳酸菌是厌氧细菌，常见的有： 、 。
乳酸链球菌 乳酸杆菌
(2)制作泡菜的方法步骤
5%～
20%
晾干
半坛
八
冷却好
全部菜料
向水槽中补充水
发酵时间
①盐的作用：
②盐水煮沸的目的：
③用水密封泡菜坛的目的：
调味；抑制其他微生物生长
杀灭微生物；
去除水中的溶解氧
给泡菜坛内创造无氧环境，
严格控制厌氧条件
(2)制作泡菜的方法步骤
5%～
20%
晾干
半坛
八
冷却好
全部菜料
向水槽中补充水
发酵时间
④为什么泡菜坛只能装八分满？
在泡菜发酵初期，酵母菌等较为活跃，发酵产物中有较多的CO2，防止发酵液溢出坛外；
防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂；
同时留有一定空间，也更方便拿取泡菜。
(2)制作泡菜的方法步骤
5%～
20%
晾干
半坛
八
冷却好
全部菜料
向水槽中补充水
发酵时间
⑤在泡菜制作过程中营造“无氧环境”的3项措施是什么？
⑥用盐过多时，制作的泡菜会“咸而不酸”，原因是什么？
a.选择的泡菜坛要密封性好。b.加入蔬菜后要注入煮沸冷却的盐水，使盐水没过全部菜料。
c.盖上坛盖后要在坛盖边沿的水槽中注满清水。
盐过多，抑制了乳酸菌发酵。
泡菜的制作过程分析
泡菜在发酵期间，由于乳酸菌的发酵作用，发酵产物乳酸不断积累，因此可以根据微生物的活动情况和乳酸积累量，将泡菜发酵过程分为三个阶段。
①发酵初期：蔬菜刚入坛时，其表面带入的微生物，主要以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等较为活跃,坛内尚有留存的O2，酵母菌等微生物呼吸作用，产生较多的CO2, 会有气泡从坛沿水槽内间歇性地放出，从而使坛内逐渐形成厌氧状态，乳酸发酵开始。
②发酵中期：由于初期乳酸发酵使乳酸不断积累，pH下降，厌氧状态形成，乳酸菌开始活跃，并产生大量乳酸，乳酸的积累量可达到0.6%～0.8%，pH为3.5～3.8。这一期间为泡菜完全成熟阶段，泡菜有酸味而且清香。
试分析此时期坛内其他微生物的活动情况及原因：
由于pH的不适，大肠杆菌、酵母菌和霉菌的活动受到抑制；
由于氧气耗尽，需氧型微生物的活动受到抑制.
③发酵后期：在此期间继续进行乳酸发酵，乳酸含量继续增加，可达1.0%以上。当乳酸含量达到1.2%以上时，发酵速度会逐渐变缓甚至停止，主要原因是______________________________。此阶段泡菜酸度过高，风味已不协调。
pH过低，乳酸菌的活动受到抑制
(3)泡菜腌制中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
发酵 时期 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐
发酵 初期 少(有O2，乳酸菌活动受抑制) 少 增加(硝酸盐还原菌的作用)
发酵 中期 ___________________________ 积累、增多、pH下降 下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)
发酵 后期 减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制其活动) _____________________ 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)
最多(乳酸抑制其他菌活动)
继续增多，pH继续下降
变化 曲线
3.果酒和果醋的制作
(1)原理和条件
项目 制作果酒 制作果醋
发酵菌种 酵母菌 醋酸菌
代谢类型 异养　　　　型 异养　　型
兼性厌氧
需氧
对氧的 需求 前期　　，后期______ 一直需氧
产物检测 闻气味、品尝、酸性条件下的重铬酸钾(橙色→灰绿色) 酸碱指示剂(pH试纸)、闻气味、品尝
需氧
不需氧
发酵过程 有氧条件下，酵母菌通过有氧呼吸大量繁殖：_________________ ___________________________；无氧条件下，酵母菌通过无氧呼吸产生酒精：__________________________________ O2、糖源充足时：
C6H12O6＋2O2 2CH3COOH＋2CO2＋2H2O＋能量；
O2充足、缺少　　时：C2H5OH＋O2　　　CH3COOH＋H2O＋能量
C6H12O6＋6H2O＋
6O2 6CO2＋12H2O＋能量
C6H12O6 2C2H5OH＋2CO2＋
能量
糖源
(2)方法步骤
①70%的酒精的作用：
②冲洗的目的：
③冲洗1-2次即可，能否反复冲洗，为什么？
④为什么去梗前冲洗：
70%
清水
1/3
18～30
拧松瓶盖
发酵瓶口
一层
纱布
30～35
7～8
消毒
去除表面灰尘、污物
防止野生菌种数量减少，影响发酵
避免葡萄破损，减少被杂菌污染的机会
⑤葡萄汁装入发酵瓶时，
为何要留有1/3的空间？
⑥每隔12h左右将瓶盖拧松一点的目的：
⑦拧松但不打开的目的：
70%
清水
1/3
18～30
拧松瓶盖
发酵瓶口
一层
纱布
30～35
7～8
a.先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后，再进行酒精发酵；
b.防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出
排出气体
防止杂菌污染
⑧如何检测果酒的发酵情况
（检测是否产生酒精）？
⑨醋酸菌从何而来？
70%
清水
1/3
18～30
拧松瓶盖
发酵瓶口
一层
纱布
30～35
7～8
a.闻
b.品尝
c.用酸性条件下的重铬酸钾溶液检测：橙色→灰绿色
打开瓶盖后，空气中的醋酸菌会进入果酒发酵液中大量繁殖，其他的菌因不适应环境条件（不能利用乙醇）而不能繁殖
⑩如何检测果醋的发酵情况？
在制作果醋的过程中，酵母菌是否还会继续发酵？
70%
清水
1/3
18～30
拧松瓶盖
发酵瓶口
一层
纱布
30～35
7～8
a.闻；b.品尝；
c.使用pH试纸检测检测和比较发酵前后的pH值；
d.观察醋酸菌膜是否形成；
随着醋酸发酵的进行，发酵液的pH、发酵温度等均不利于酵母菌的生长繁殖，因此酵母菌活性很低，不会继续发酵。
关闭
果酒和果醋改进装置及其分析
装置的使用：使用该装置制作果酒时，应该关闭充气口；制作果醋时，应将充气口连接充气泵，输入空气。
CO2
防止空气中微生物的污染
(1)醋酸菌在无氧条件下利用乙醇产生乙酸。(　　)
(2)酵母菌是嗜温菌，所以果酒发酵所需的最适温度高于果醋发酵温度。(　　)
(3)在果酒发酵后期拧松瓶盖的间隔时间可延长。(　　)
(4)在家庭中用新鲜葡萄制作果酒时，需给发酵装置适时排气。(　　)
×
√
×
√
(5)泡菜制作的菌种主要是醋酸菌。(　　)
(6)制作泡菜时，盐水煮沸后可以立即使用。(　　)
(7)泡菜发酵过程中泡菜坛沿要注满水有利于泡菜的无氧发酵。(　　)
×
√
×
易错易混的四种传统发酵产品的菌种与原理
食品 菌种 呼吸类型 原理 温度
果酒 18～30℃
果醋 30～35℃
腐乳 —
泡菜 室温
酵母菌
醋酸菌
毛霉等
乳酸菌
兼性厌氧
需氧
需氧
厌氧
无氧呼吸产生酒精
糖(乙醇)→乙酸
蛋白酶、脂肪酶分别水解蛋白质、脂肪
无氧呼吸产生乳酸
【例1】(2022·河北衡水金卷)下面是果酒和果醋制作的实验流程以及某同学设计的果酒和果醋的发酵装置。根据图示回答下列问题：
(1)图A中方框内的实验流程是_____________。
(2)冲洗的主要目的是　　　　　，冲洗应特别注意不能　　　　，以防止菌种的流失。
(3)图B装置中的充气口在　　　　　时关闭，在　　　　　时连接充气泵，并连续不断地向内　　　　　　　。
(4)排气口在酒精发酵时排出的气体是由　　　　产生的　　　　，在乙酸发酵时排出的是____________________________。
乙酸发酵
除去污物
反复冲洗
酒精发酵
乙酸发酵
泵入空(氧)气
酵母菌
CO2
(含氧量少的)空气、CO2
因为酒精发酵时的缺氧环境能抑制醋酸菌生长，
且醋酸菌的发酵需要充足的氧气
(5)写出与(4)题有关的反应式：
①_______________________________________________；
②__________________________________________________________________
__________________________________。
(6)若果汁中含有醋酸菌，在酒精发酵旺盛时，醋酸菌能否将果汁中的葡萄糖发酵为醋酸？　　　，说明原因：_________________________________________
_________________________________。
不能
【例2】杨梅果实风味独特、酸甜适中，具有很高的营养和保健价值。下图是制作杨梅酒和杨梅醋的流程图。请回答下列问题：
(1)传统发酵中，发酵液虽然未经过严格的灭菌处理，但杂菌却不能正常生长繁殖，这是由于果酒发酵的__________________条件抑制了杂菌的生长。用来检验酒精的化学试剂是____________________。
　酸性重铬酸钾　
缺氧、酸性
(2)果酒制作过程中，酵母菌无氧呼吸产生酒精的场所是_______________。温度适宜时果酒发酵时间较短，原因是______________________________
___________________。
此时，与果酒发酵相关的酶活性
细胞质基质
最高，发酵速度快
(3)杨梅醋的发酵过程中，除具备必需的营养物质外，还需要往发酵液中持续地通入_______________________。
无菌氧气(或无菌空气)
(4)下图表示果酒发酵过程中，发酵液的糖度(葡萄糖的浓度)和酒精度(酒精浓度)随时间变化的关系。发酵前24 h，糖度变化很小，酒精度上升很慢，其原因是____________________________________________。96 h后酒精度和糖度的变化都趋于平缓，其原因是_______________________________
_____________________。
高浓度的酒精和代谢废物会抑制酵母菌的代谢而影响发酵
此阶段酵母菌主要进行有氧呼吸，大量增殖
【例3】(2020·山东烟台模拟)蓝莓酒和蓝莓醋被称为“液体黄金”“口服化妆品”等。下图是以鲜蓝莓为原料天然发酵制作蓝莓酒和蓝莓醋的过程简图。下列叙述错误的是( )
A．去除蓝莓枝梗应在冲洗之后，目的是防止杂菌污染
B．过程③在氧气、糖源充足条件下可直接发酵为蓝莓醋
C．在过程④时，榨出的蓝莓汁需经过高压蒸汽灭菌后才能密闭发酵
D．过程⑤中酒精可作为醋酸菌的碳源和能源
C
1．[2017·全国Ⅱ，T37(3)]如果在实验后，发现32 h内的发酵效果越来越好，且随发酵时间呈直线上升关系，则无法确定发酵的最佳时间；若要确定最佳发酵时间，还需要做的事情是__________________________________
_______________________________________________________________。
延长发酵时间，观测发酵效果，最好的发酵效果所对应的时间即为最佳发酵时间
2．[2013·全国Ⅰ，T39(1)]制作泡菜时，所用盐水需煮沸，其目的是____________。为了缩短制作时间，有人还会在冷却后的盐水中加入少量陈泡菜液，加入陈泡菜液的作用是_________________。
杀灭杂菌
增加乳酸菌数量
3．[2013·全国Ⅰ，T39(4)]从开始制作到泡菜品质最佳这段时间内，泡菜液逐渐变酸。这段时间内泡菜坛中乳酸菌和其他杂菌的消长规律是_______________________________，原因是______________________。
乳酸菌数量增多，杂菌数量减少　
乳酸菌比杂菌更耐酸
4．[2018·全国Ⅲ，T37(3)]制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是_____________________
__________________________。
酵母菌分解葡萄糖会
产生CO2，CO2使面包松软
5．[2016·全国Ⅲ，T39(1)]分离纯化乳酸菌时，首先需要用______________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是____________________
________________________________。
无菌水
浓度高，直接培养很难分离得到单菌落
6．制作泡菜时，泡菜坛一般用水密封，目的是创造________(填“无氧”或“有氧”)环境。蔬菜在腌制过程中，会产生亚硝酸盐。将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较，估算出的亚硝酸盐含量如下图曲线所示，据图可以得出的结论是_________________________________
_____________________________________________________________。
泡菜封坛后亚硝酸盐含量不断增加，至第4天含量最高，以后逐渐减少，最终趋于稳定(合理即可)
无氧
02
考点二　发酵工程及其应用
1.发酵工程的概念？优点？
2.发酵工程的基本环节？
3.选择发酵工程的菌种时需要考虑哪些因素？
4.怎样对发酵条件进行调控以满足微生物的生长需要？
5.发酵工程的应用？
6.什么是单细胞蛋白？
1．发酵工程
(1)概念：利用微生物的____________，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。
特定功能
(2)对发酵工程概念的理解
①微生物：包括来自自然界的微生物(即“常规菌”)和基因重组的微生物(即“工程菌”)。
②产品：通过微生物的大量繁殖获得所需产品。如利用酵母菌发酵制造的啤酒、果酒，利用乳酸菌发酵制造的酸奶，及利用工程菌生产的人胰岛素。
③实质：利用微生物进行产品生产(如次生代谢物和菌体本身)。
2．发酵工程基本环节分析
营养协调
pH适宜
碳源
氮源
防止杂菌污染
稳定、温和
自然界
基因工程
产物浓度
过滤
沉淀
蒸馏、萃取
例：啤酒发酵的工业化生产流程及操作目的
大麦种子发芽，释放淀粉酶
淀粉分解，形成糖浆
酵母菌将糖转化为酒精和二氧化碳
后发酵
主发酵
酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成
低温、密闭环境下存储
啤酒花
“精酿”啤酒与“工业”啤酒的区别
长
短
低
高
3.发酵工程的特点
温和
丰富
低廉
专一
污染小
容易处理
4.发酵工程的应用
食品添加剂
酶制剂
黑曲霉（蛋白酶）
酿酒酵母
谷氨酸棒状杆菌
工程菌
苏云金杆菌
放线菌
细菌、真菌
青贮饲料中添加乳酸菌（保鲜、提高品质、提高免疫力）
(1)在发酵工程中，可通过诱变育种、基因工程育种获得菌种。(　　)
(2)分离、提纯酵母菌发酵生产的单细胞蛋白，可采用过滤、沉淀等方法。(　　)
(3)在连续培养过程中补充的同种培养液和空气须先灭菌。(　　)
(4)乳酸菌可以代替酵母菌用于乙醇的生产。(　　)
(5)发酵罐中微生物的生长繁殖、代谢物的形成速度都与搅拌速度有关。(　　)
(6)单细胞蛋白是从微生物细胞中提取出来的。(　　)
×
√
√
√
√
×
【例4】(2021·高考广东卷)中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜(甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖)为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图所示。回答下列问题：
(1)为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效
率，可在液体培养基中将蔗糖作为______，
并不断提高其浓度，经多次传代培养(指培
养一段时间后，将部分培养物转入新配的
培养基中继续培养)以获得目标菌株。培养
过程中定期取样并用________________________________的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有_____________________________________(答出两种方法即可)等。
碳源
稀释涂布平板法(血细胞计数法)
基因工程育种
诱变育种、
(2)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是________________________
___________________________________________________________________________________________________(答出两点即可)。
培养基是高盐浓度的液体环境，杂菌会由于渗透失水而死亡；培养基的液体环境是碱性的，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制
(3)研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中________可能是高密度培养的限制因素。
(4)菌株H还能通过分解餐厨垃圾(主要含蛋白质、淀粉、油脂等)来生产PHA，说明其能分泌____________________________________________。
氧气
蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和PHA合成相关的酶
微生物的培养技术及应用
第十单元　生物技术与工程
与旧教材对比 改：①大肠杆菌纯化培养改为酵母菌的纯培养；②分解纤维素微生物的分离改为课后习题呈现。
删：①菌种的保藏；②制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤。
01
考点一　微生物的基本培养技术
1.培养基的概念？培养基的作用？根据物理状态分类？各类的作用？
2.培养基的一般成分？在此基础上还需要满足什么需求？
3.自养微生物、异养微生物的碳源分别是什么？
4.获得纯净的微生物培养物的关键是？无菌技术的目的？
5.什么是消毒、灭菌？常用的消毒和灭菌方法有哪些？操作对象分别是？
6.培养物、纯培养物的概念？纯培养步骤？
7.菌落、单菌落的概念？获得单菌落的常用方法？
8.倒平板的过程？冷凝的平板怎么放置？为什么？
9.平板划线法的概念及过程？第一次灼烧接种环的目的？每次划线前？划线结束？接种环冷却的目的？
10. 第二次后的划线从上一次的哪里开始？为什么？
11.培养时怎样设置对照？目的？怎样放置平板？在什么设备里培养？标记的位置？
1．培养基的配制
营养物质
生长繁殖
液体
氮源
鉴定
积累其代谢物
除了上述主要营养物质外，还需要满足微生物生长对_________________
的需求。例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加_____ ；在培养霉菌时，一般需要将培养基调至　　；在培养细菌时，一般需要将培养基调至　　　　　　；在培养厌氧微生物时，需要提供_____
的条件。
pH、特殊营养物质以及氧气
酸性
中性或弱碱性
无氧
维生素
培养基中营养物质的确定方法
(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机物，碳源可由大气中的CO2提供，氮源可由含氮无机盐提供。
(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
(3)几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 NH4＋、NO3－等 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
酵母菌 糖类、蛋白质等 有机物 蛋白质等 有机物
2.无菌技术
(1)目的：获得　　　　　　。(2)关键：　　　　　　。
(3)区别：消毒与灭菌的比较
比较项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的______ 　　或生物等方法 仅杀死物体表面或内部一部分微生物 煮沸消毒法 日常用品
__________ 不耐高温的液体
_______________ 操作空间、操作者的衣物和手等
紫外线消毒法 接种室、接种箱或超净工作台
纯净的培养物
防止杂菌污染
物理、
化学
巴氏消毒法
化学药物消毒法
灭菌 强烈的理化方法 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 __________ 培养基、容器等
__________ 玻璃器皿、
金属用具等
___________ 接种工具等
湿热灭菌法
干热灭菌法
灼烧灭菌法
生物消毒法是指利用生物或其　　 除去环境中的部分微生物的方法。
代谢物
3.微生物的纯培养
(1)概念辨析
固体培养基
一定形态结构
(2)酵母菌纯培养的操作步骤
15～20 g琼脂
湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)法
干热灭菌
马铃薯琼脂培养基
酒精灯火焰
灼烧灭菌
平板划线法
恒温培养箱中
28
将平板倒置的原因：
避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
(3)平板划线法操作步骤
据图思考以下问题：
a.第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，这样做的目的是什么？
能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
b.平板划线时最后一次划线为何不能与第一次划线相连？
最后一次划线已经将酵母菌稀释成单个细胞，如果与第一次划线相连，则增加了酵母菌数目，得不到纯化的效果。
c.操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的填写下表：
项目 第一次操作 每次划线之前 划线结束
目的 _________________________ 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于____________ ，使每次划线菌种数目减少 _________________________________________________________
杀死接种环上原
有的微生物
上次划线的末
端
杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
(1)所有的培养基中都要加入琼脂。(　　)
(2)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。(　　)
(3)培养不同微生物的培养基成分完全一样。(　　)
(4)获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染。(　　)
×
√
×
×
(5)灭菌相比消毒对微生物的杀灭更彻底。(　　)
(6)倒平板后，待平板冷凝之后需将其倒置。(　　)
(7)在实验室中，全部培养工作结束后，所有使用过的器皿、废弃物等都必须先经过高压灭菌后再洗涤或倾倒。(　　)
√
√
√
【例5】(2022·山西太原调研)自然界里有多种微生物，将其进行合理的筛选、培养和应用，能给医药和化工等生产领域带来巨大经济效益。回答下列问题：
(1)对培养基进行灭菌时，多采取　　　　　　法，而对接种环或涂布器灭菌时则用　　　　法，若要将微生物采用平板划线法进行分离操作，在固体培养基表面连续进行了5次划线，则需要对接种环灼烧　　次。平板划线在做第二次及其后的划线操作时，要从上次划线的　　开始划线，最后一次划的线不能与第一次划的线　　。
(2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中　　　　培养，以减少培养基中水分的挥发。其中，培养未接种的固体培养基是为了
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
6
末端
相连
倒置
作为对照组，排除培养基被杂菌污染的可能
(3)甲、乙两组同学用稀释涂布平板法测定某种微生物的数量，在同一稀释倍数下每隔一段时间记录数据(统计时间内微生物总数小于环境容纳量)，得到如表结果：
培养时间/小时 24 48 72 96
甲组菌落均值/个 18 25 36 32
乙组菌落均值/个 20 28 38 32
据表可知，计数时最好取培养　　　　小时记录的菌落数作为实验结果，一方面是由于培养时间较短，会遗漏菌落数目，另一方面是由于______________
________________________________。
72
培养时间过长，
两个或多个菌落连成一个菌落
1．[2018·全国Ⅱ，T37(2)]牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是__________________________
__________________。
在达到消毒目的的同时，
营养物质损失较少
2．[2018·全国Ⅲ，T37(1)]分离培养酵母菌通常使用____________(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用_____________灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到菌落，菌落的含义是____________________________________。
麦芽汁琼脂
高压蒸汽　
有一定形态结构的子细胞群体
由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的、
3．[2014·全国Ⅱ，T39(2)]某小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过________灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是____________________________
______________。
灼烧
将聚集的菌种逐步稀释以便
获得单菌落
4．在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？________，原因是___________________
__________________________________________________。
不能
空气中的微生物
可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，从而造成污染
5．培养基灭菌后，需要冷却至50 ℃左右时才能倒平板的原因是______________________________________________________________。
倒平板时高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时若不及时操作，琼脂会凝固
6．采用下表配方配制的培养液分离果胶酶产生菌时，该表X处的成分应是________(填“葡萄糖”或“果胶”)，不选另一种成分的原因是________________________________________________。
K2HPO4 MgSO4 NaNO3 FeSO4 X H2O
0.1 g 0.5 g 3 g 0.01 g 2 g 加至1 L
大多数微生物以葡萄糖作为碳源，不具有选择作用
果胶
7．经多次规范操作、重复实验，平板上均出现________________的菌落，初步证明鲜牛奶中存在金黄色葡萄球菌，但鲜牛奶供应商仍认为此菌并非鲜牛奶所携带，因此，要对本操作进行完善，完善的方案是__________
_____________________________________。
金黄色葡萄球菌
为增强实验结论的严谨性，应增加空白对照组
02
考点二　微生物的选择培养和计数
1.实验室微生物筛选的原理？
2.选择培养基的概念？
3.一些细菌能利用尿素的原因？尿素不能作为分解尿素的细菌的碳源的原因？
配制什么培养基将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
4.培养基中KH2PO4和Na2HPO4作用？
5.微生物的数量测定的方法？
6.活菌计数法常用的接种方式？原理？选择菌落数多少的平板计数？
结果统计的是活菌数还是死菌数？为什么统计值比实际值小？
7.直接计数法的优点？材料用具？结果统计的是活菌数还是死菌数？
8.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数探究与实践：如何设置重复？
两种对照的目的分别是？如何操作？
1.选择培养基
抑制或阻止
尿素
氮源
细菌
高温
自然界中目的菌筛选的依据：
生物与环境相适应的观点：根据目的菌对生存环境要求，到相应环境寻找。
原理：
人为提供______________ _的条件（包括_____、_____和_____等），同时_______________________
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
温度
营养
pH
区分选择培养基与鉴别培养基
种类 特点 用途 举例
选择 培养基 允许___________________ ___，同时______________ _______________ 从众多微生物中分离所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别 培养基 根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 用伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌
特定种类的微生物生
长
抑制或阻止其他
种类微生物生长
（1）目的：分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长
原理：青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用
配制：使用__________的培养基
（2）目的：分离固氮菌
原理：固氮微生物能利用空气中的氮气
配制：使用______________________的培养基
（3）目的：分离自养型微生物
原理：自养型微生物能利用无机碳源
配制：使用__________________________的培养基
（4）目的：分离耐酸菌
原理：耐酸菌能在pH为酸性的条件下生长
配制：使用______________的培养基
加入青霉素
不加氮源（以N2为氮源）
不加有机碳源（以CO2为碳源）
将pH调至酸性
实例：
2.微生物的选择培养和数量测定
(1)稀释涂布平板法步骤
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
②涂布平板操作步骤
③培养观察：倒置平板，30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
(2)微生物的数量测定方法
①显微镜直接计数法
(2)微生物的数量测定方法
②间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
根据图示问答以下问题：
Ⅰ.为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。
Ⅱ.为什么用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低？
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
30～300
Ⅲ.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234个(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)，那么稀释倍数为106的试管中细菌的浓度是 个/mL，稀释倍数为10的锥形瓶中细菌的浓度为
个/mL，所以每克样品中的细菌数是 个。
2.34×103
2.34×108
2.34×109
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
(1)实验原理
脲酶
尿素
3～8
30～300
稀释涂布平板
30～37
菌落数目稳定
(2)实验流程
(3)实验结果分析与评价
对照的培养皿
中无菌落生长
对照的培养皿
中有菌落生长
30～300
本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：
__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该细菌能够分解尿素
4.分解纤维素的微生物的分离
(1)分离方法与原理
(2)纤维素分解菌的培养基成分及鉴定原理
纤维素
刚果红
红色
复合物
(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。(　　)
(2)平板划线法接种时，每一次划线前都要挑取菌种。(　　)
(3)需要将一个未接种的培养基放在相同的条件下培养，以检验培养基的灭菌是否合格。(　　)
×
√
√
(4)菌液的稀释度足够高时，培养基表面会获得单菌落。(　　)
(5)适于平板计数的菌落数范围为40～300。(　　)
(6)用稀释涂布平板法计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。(　　)
(7)用稀释涂布平板法计数时，平板上的一个菌落就是一个细菌。(　　)
×
√
√
×
1．(选择性必修3 P18相关信息)血细胞计数板常用于相对______的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数；细菌计数板常用于相对_____的细菌等的计数。
2．(选择性必修3 P18正文)统计某一稀释度下平板上的菌落数的要求是______________________________________________________。
较大
较小
统计3个菌落数在30～300之间的平板，计算菌落数的平均值
3．(选择性必修3 P19)“测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。”测定土壤中不同的微生物(如真菌、放线菌)使用的稀释度一样吗？举例说明。________________________________________________________________。
不一样。测定真菌一般用1×102、1×103和1×104倍稀释；测定放线菌一般用1×103、1×104和1×105倍稀释
4．(选3 P20拓展应用T2)在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌的原因是_______________________________________________________
________________________________________________________________
由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率高于普通环境
1．选择培养基的制作方法
2．两种纯化细菌的方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞
主要步骤 平板划线操作 系列稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
平板 示意图
3.微生物的分离与计数实验中对照组和重复组的设置及作用
(1)两种对照组的设置及作用
①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用：为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置至少3个平板作重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。
【典例6】某研究小组从黄色短杆菌(能合成L 亮氨酸)中筛选L 亮氨酸缺陷型(不能合成L 亮氨酸)突变菌株，实验流程如下图所示。回答下列问题：
(1)培养基灭菌常用的方法是_________________。
高压蒸汽灭菌法
(2)过程①的接种方法是_________________。过程②接种时，先将灭菌后的金丝绒与培养皿A中的菌落接触一次，然后像盖印章一样将菌种连续接种到培养皿B和C的培养基表面，这种接种方法便于将来比较培养皿B、C中菌落的差异，原因是_______________________________________。
　培养皿B、C中的菌种接种位置相同
稀释涂布平板法
(3)培养皿A、B、C中的培养基都要使用固体培养基，原因是______________________________。若培养皿B的培养基中含有L 亮氨酸，培养皿C的培养基中不含L 亮氨酸，培养一段时间后菌落生长情况如图所示，研究人员应该从培养皿________(填“B”或“C”)中选取目的菌落。
便于观察菌落特征和分离目的菌株
B
【典例7】尿素容易保存，是目前使用量较大的一种化学氮肥，尿素分子并不能直接被农作物吸收，只有被尿素分解菌分解成氨之后才能被植物利用。下图是从土壤中分离、计数尿素分解菌的过程，有关分析正确的是(　　)
A．若②过程稀释了10倍，则乙锥形瓶里盛有9 mL无菌水
B．③的接种方法可用平板划线法或稀释涂布平板法
C．a、b、c培养基可以用牛肉膏蛋白胨培养基
D．若①②过程稀释了10倍，a、b、c培养基上的菌落数依次为57、58、56个，则10 g土样中的尿素分解菌数量为5.7×109个
18ML
尿素为唯一氮源
每克土样：(57÷0.1)×106＝5.7×108(个)
106
D
1．[2015·江苏，T31(2)]在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是____________________________________________________
___________。
培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响
分离效果
2．[2017·全国Ⅰ，T37(2)]为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是___________________________________
_________________________________________________________________。
3．在实验中，研究者每隔24 h统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止___________________________________。
因培养时间不足导致遗漏细菌数目
尿素
其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
4．对细菌计数时往往会产生实验误差，稀释涂布平板法计数的值比实际值________，原因是_____________________________________________
_______________；
显微计数法计数的结果比实际值________，原因是___________________
______________________________________。
偏小
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的
偏大
　显微镜下无法
只是一个菌落
区分细胞的死活，计数时包括了死细胞
5．我国的卫生标准是每1 000 mL饮用水中大肠杆菌不得超过3个，在培养基上每1 000 mL合格饮用水形成的菌落数却大于了3个，原因是_________________________________________________________。
饮用水中还有其他细菌，形成的菌落数远大于3个
6．接种结束后，将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养的目的是____________，未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明_____________________________________________
______________。
形成对照
培养基灭菌不彻底(或培养基被污染了或需要
重新制备)
7．某同学计划统计污水池中目的菌的总数，他选用1×104、1×105、1×106倍稀释的稀释液进行平板划线，每种稀释液都设置了3个培养皿，从设计实验的角度看，还应设置的一组对照实验是___________________，此对照实验的目的是________________________。
未接种的空白培养基
检验培养基灭菌是否合格
乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另外2个相差悬殊，结果的重复
性差
8．[2018·全国Ⅰ，T37(4)]甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是_________________________________________________________________
_______。
9．已知“改良MC琼脂培养基”中含有碳酸钙，遇酸溶解而使培养基变得透明；“孟加拉红琼脂培养基”中含氯霉素，可抑制绝大多数细菌的生长。对乳酸菌进行计数时应选择上述__________________________培养基，用________________________法接种，挑选出具有透明圈的菌落进行计数。如果每个平板均接种了0.1 mL样品并培养，接种的4个平板菌落数分别是210、230、470、190，则样品中菌种的数量为________个/mL。平板划线法一般不用于活菌计数的原因是_____________________________________
________________________。
改良MC琼脂
稀释涂布平板
2 100
得到的菌落多数不是单一菌落，
菌落数远小于活菌数
1.（2022广东卷T21）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。回答下列问题：
（1）研究者先制备富集培养基，然后采用_____________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用_________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以______为碳源时生长状况最好。
（2）研究发现，将采集的样品
置于各种培养基中培养，仍有很
多微生物不能被分离筛选出来，
推测其原因可能是（答一点即可）
________________。
高压蒸汽灭菌
平板划线
纤维素
某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活）
1.（2022广东卷T21）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。回答下列问题：
（3）藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是________________。
（4）深海冷泉环境特殊，推测
此环境下生存的拟杆菌所分泌的
各种多糖降解酶，除具有酶的一
般共性外，其特性可能还有
________________。
拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行
耐低温
2.（2022广州市一模T21）番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的，具有较强的侵染力和破坏力。番茄青枯病可通过以根际促生菌作为描抗微生物抵御青枯雷尔氏菌进行生物防治。因此，发掘新的高效能描抗青枯病病原菌的促生微生物具有重要意义。回答下列问题。
（1）进行样本采集及描抗细菌菌株分离纯化时，应采集某地番茄青枯病发病果园中 _____（填“健康”或“患病”）植株根际土壤，在番茄青枯病发病果园中取样的原因是 ________________________ 。先称取1 g土壤添加到盛有 ______ 的三角瓶中均匀振荡后，置于恒温水浴15min。经分离培养后，挑取单菌落进行划线纯化。
（2）进行描抗细菌的分离筛选时，为比较不同根系微生物纯化菌液对青枯病病原菌的描抗作用效果，科研人员配制了含有青枯病病原菌的平板，在含青枯病病原菌平板上滴加 ____________ ，在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察并比较抑菌圈的大小，措抗作用越强则 _________ 。
健康
拮抗微生物数量多针对性强
无菌水
不同根系菌液
抑制菌圈越大
2.（2022广州市一模T21）番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的，具有较强的侵染力和破坏力。番茄青枯病可通过以根际促生菌作为描抗微生物抵御青枯雷尔氏菌进行生物防治。因此，发掘新的高效能描抗青枯病病原菌的促生微生物具有重要意义。回答下列问题。
（3）通过对描抗细菌产酶活性进行测定，筛选出4株菌株，随后进行青枯病预防实验。现有番茄幼苗、4种菌液、青枯菌菌液、无菌水等。请设计实验比较菌株的预防效果______（写出实验思路）。
将生长状况相同且良好幼苗平均分为 5 等分，标注 1-5 组，每组设三个平行组。
1 组喷洒无菌水和青桔菌液，2-5 组分别喷洒等量的四种菌液，后喷洒青枯菌菌液，培养一段时间观察比对生长及患病情况。
3.（2022深一模T21）豆豉是一种以大豆为原料的传统发酵食品，在我国有2000多年的制作和食用历史。其中，广东省阳江的豆豉以其松化、醇香、鲜美的独特风味而享誉盛名，其制作工艺流程如图。回答下列问题：
（1）制曲的目的是让黑豆上长满曲霉等微生物。为了弄清微生物的具体种类，需从曲料（制曲阶段黑豆表面部分）中分离、纯化微生物，常用的接种方法有_______________________（答出两种方法即可），纯化所得的优良菌种常用甘油管藏法进行长期保存。
（2）黑豆蒸熟或煮熟后更容易制曲，从蛋白质结构角度分析，其原因是________。
拌盐阶段需控制食盐的用量，其原因是________（答出两点即可）。
稀释涂布平板法、平板划线法
高温使蛋白质分子空间结构变得伸展、松散，肽键暴露，容易被蛋白酶水解
加盐过多，会影响口味，
加盐太少，不足以抑制杂菌污染
3.（2022深一模T21）豆豉是一种以大豆为原料的传统发酵食品，在我国有2000多年的制作和食用历史。其中，广东省阳江的豆豉以其松化、醇香、鲜美的独特风味而享誉盛名，其制作工艺流程如图。回答下列问题：
（3）豆豉风味的形成与腐乳类似，据此推测豆豉的鲜美口味主要在________阶段形成。
（4）小作坊制作的豆豉中，有时出现肉毒菌毒素，从而引起食物中毒。为避免肉毒菌等有害杂菌的污染，现代工业化的豆豉生产在制曲阶段可采取的措施有________。
对操作工具严格灭菌处理，
定期检查生产情况，
接种优良菌种
后期发酵

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