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早期剥夺所致大鼠抑郁样行为
与海马BDNF mRNA表达变化
一、早期剥夺所致大鼠抑郁样行为
与海马BDNF mRNA表达变化
期刊：《心理学报》 2010年第6期 总第695-703页
作者：江雪华 张敏 陆大祥 韦佳 戚仁斌
摘要：
目的：为探讨早期剥夺对大鼠行为与海马脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA表达的影响
方法：液体消耗试验、穿梭箱试验、酶联免疫法、
原位杂交法、统计学分析
结论:早期剥夺可导致大鼠生长减慢，表现出快感缺失的抑郁样行为，早期剥夺能下调成年大鼠海马BDNFmRNA的表达。
一、早期剥夺所致大鼠抑郁样行为与海马BDNF mRNA表达变化
前 言
研究背景：
1.(Cirulli, Berry, & Alieva, 2003)生命早期应激事件与成年期抑郁症发生密切相关，儿童期受虐待或被忽视、丧亲、长期与父母分离等早期创伤性经历是导致成年期抑郁症易感性增加的高风险因素之一，但临床研究无法为两者间的因果关系提供足够的证据。
2.(Pryce et al., 2005) 基于临床研究的发现，利用生命早期应激建立动物模型，将有助于探索成年期抑郁症发生的病因学与神经生物学机制。
3.BDNF——脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)属于神经营养素家族，是神经可塑性的分子标记物。神经可塑性假说是近年来继单胺耗竭假说、5-HT1A受体敏感性假说之后提出的又一抑郁症病理生理机制假说。临床研究提示，BDNF表达与含量变化是导致抑郁症发病与抗抑郁治疗发挥疗效的重要因素。
一、 早期剥夺所致大鼠抑郁样行为
与海马BDNF mRNA表达变化
提出问题及目的：
采用易获得的SD大鼠，建立早期剥夺模型，
问题：
①早期剥夺是否对SD大鼠的行为与海马BDNF mRNA表达产生影响，
②探讨这些影响是否存在性别差异，
③探讨对海马不同区域的BDNF mRNA表达的影响是否存在差异。
目的：为进一步探索早期剥夺导致大鼠神经可塑性的改变奠定基础，为干预和应对生命早期应激所诱发的成年期抑郁症提供实验依据。
大鼠海马区解剖示意图
海马主要包括齿状回颗粒细胞层、CA1、 CA2 和CA3的锥体细胞层，位于中额叶，发出神经纤维投射到额叶皮质、杏仁核等与情感有关的脑区，是调节应激反应 的重要脑区。
冠状面
矢状面
横断面
一、早期剥夺所致大鼠抑郁样行为
与海马BDNF mRNA表达变化
实验过程：
1.实验动物：
健康怀孕SD大鼠8只室温21±2°C条件下饲养，相对湿度为40%~70%,每天保证12h光照(7:00-19:00), 大鼠自由饮水摄食，四周环境清洁、安静。在孕鼠生产的当天，记为出生后0天(postnatal day 0, PND0),对每窝新生幼鼠进行挑选，剔除不健康的幼鼠，每窝保留12只幼鼠，雌雄各半。
将8窝新生大鼠随机分成两组，每组4窝：正常对照组(non-handling, NH)和早期剥夺组(ED)。正 常对照组的4窝幼鼠常规饲养。早期剥夺组的4窝幼鼠在PND1-14,每天8:00-12:00将单只幼鼠从窝内取岀，放置于lOcmxlOcmx 10cm的黑色塑料盒内，在室温下(21°C))孤养4h,然后放回母鼠窝内。8 窝幼鼠在 PND21 断乳，分笼常规饲养。
两组幼鼠按窝别、性别与体重随机各挑选16只，雌雄各半，每周称量体重，剩余幼鼠供其它实验使用。
一、早期剥夺所致大鼠抑郁样行为
与海马BDNF mRNA表达变化
2.试剂与仪器
①ZH-DSX2型大鼠穿梭箱
②BIO-RAD Model 550 Microplate reader酶标仪
③BX51显微镜
④大鼠BDNF酶联免疫试剂盒
⑤大鼠 BDNF原位杂交检测试剂盒
3.方法
液体消耗试验、穿梭箱试验、酶联免疫法（检测海马BDNF含量）、
原位杂交法（检测海马BDNF的表达）、统计学分析
（一）两组大鼠体重随时间变化的趋势分析
方差分析结果表明，正常对照组与早期剥夺组大鼠体重之间有显著差异。
雌雄大鼠体重均持续增长，在不同时间(PND22、29、36、43、50、 57 与 64)差异显著，时间与两组间的交互作用显著。
趋势对比研究发现，随大鼠逐渐生长，虽然早期剥夺组大鼠体重有所增长，正常对照组增长幅度显著高于早期剥夺组。
性别与两组间交互作用不显著。
正常对照组与早期剥夺组体重随时间的变化
NH:正常对照组； ED:早期剥夺组
一、 早期剥夺所致大鼠抑郁样行为与海马BDNF mRNA表达变
实验方法及结果
交互作用
一、 早期剥夺所致大鼠抑郁样行为与海马BDNF mRNA表达变化
实验方法及结果
（二）方法：
1.液体消耗试验：
在大鼠PND36进行液体消耗试验，之后每周进行1次，共进行5次，检测大鼠的快感缺乏。
大鼠称量体重，禁食禁水23h后，进行糖水/纯水消耗试验：
每只大鼠同时给予事先称重的两瓶水，一瓶 1%蔗糖水，一瓶纯水，60min后，取走两瓶进行称重，
计算每只大鼠的糖水消耗(g)、相对糖水消耗 ［糖水消耗(g)/体重(g)xl00%］、糖水偏爱［糖水消耗 (g)/(糖水消耗(g)+ 纯水消耗(g))xlOO%］
1.1液体消耗试验——糖水摄入量
方差分析 结果表明，两组大鼠糖水摄入量之间有显著差异,正常对照组糖水摄入量高于早期剥夺组。
大鼠在不同时间(PND36、43、50、 57与64)糖水摄入量差异显著，雄性与雌性大鼠糖水摄入量有显著差异, 雄性大鼠糖水摄入量多于雌性大鼠。
趋势分析表明，正常对照组雄性、早期剥夺组雌性与雄性大鼠糖水摄入量表现出随时间减少的趋势，其中早期剥夺组雌性大鼠糖水摄入最少。
但时间与两组间、性别与
两组间交互作用不显著。
1.2液体消耗试验——相对糖水摄入量
方差分析结果表明，两组大鼠相对糖水摄入量差异不显著。
大鼠在不同时间相对糖水摄入量差异显著，随着大鼠体重的增长，大鼠的相对糖水摄入量表现出随时间逐渐下降的趋势。
时间与两组间交互作用显著,
雄性与雌性大鼠相对糖水摄入量有显著差异，
随大鼠生长，雄性大鼠的相对糖水摄入量表现出低于雌性大鼠的趋势。
性别与两组间交互作用不显著。
相对糖水消耗 ：糖水消耗(g)/体重(g)xl00%
交互作用显著
1.3液体消耗试验——糖水偏爱
方差分析结果表明，正常对照组与早期剥夺组大鼠糖水偏爱差异显著，
正常对照组的糖水偏爱显著高于早期剥夺组。
糖水偏爱随时间变化无 显著差异，
雄性与雌性大鼠糖水偏爱差异不显著,
时间、性别与两组间交互作用不显著。
糖水偏爱：糖水消耗 (g)/(糖水消耗(g)+ 纯水消耗(g))xlOO%
2.穿梭箱试验
①大鼠12w龄时，按窝别与性别在正常对照组和早期剥夺组大鼠中随机挑选对电击反应较为一致的大鼠进行实验，每组8只，雌雄各半，检测大鼠的习得性无助。
②物理环境：试验时室内为暗光，均在 14:00-17:00之间进行，以避免昼夜节律对大鼠行为的影响。
③穿梭箱为长方形盒 (50cmx23cmx23cm),中央用一带门(7cmx5cm)隔板分成两室，大鼠可通过门在两室穿梭，箱底部为可通电的铜栅栏(间隔0.5cm), 一室接通电源为电击区，另一室则为安全室，可通过开关切换两室的电击(电击区和安全区可以进行切换)，顶部有一声源。
试验过程
试验过程
实验分为训练和测试两部分:
训练时对大鼠进行100次不可逃避的足底电击(0.5mA, 2s,间隔40±15s),大鼠被电击后能迅速穿过中央隔板上的门进入安全区，即为正确的穿梭反应，大鼠进入安全区后，通过开关切换, 使安全区成为电击区，再次进行电击，如果大鼠不 再穿梭至安全区，则在一定时间间隔(40±15s)后再次进行电击，记录大鼠在100次不可逃避的足底电击后的穿梭反应次数。
测试（48h后进行），每只大鼠接受100次以声音(12s)为条件刺激的足底电击(间隔40±15s),每次声音响10s后，
①给予大鼠2s的电击，大鼠在声音响10s内进入安全区为主动逃避行为；
②在被电击后进入安全区为被动逃避行为；
③在被电击后不能进入安全区为逃避失败。（即判为“习得性无助”）
记录每只大鼠的主动逃避行为、被动逃避行 为与逃避失败次数, 将100次电击分成10x10次进行统计。
2.1穿梭箱试验——被动逃避行为
图5所示为被动逃避行为次数随电击次数的变化趋势，随电击次数增加, 大鼠被动逃避行为次数差异显著。
两组大鼠被动逃避行为次数无显著差异。
雄性与雌性大鼠的被动逃避行为次数差异显著。雄性大鼠随电击次数增加被动逃避行为逐渐减少。
电击次数、性别与两组间交互作用不显著。
2.2穿梭箱试验——逃避失败
图6所示为逃避失败次数随电击次数的变化趋势，随电击次数增加，大鼠逃避失败次数差异显著。
趋势分析表明正常对照组雄性与雌性大鼠、早期剥夺组雌性大鼠逃避失败次数随电击次数增加逐渐减少，尤以正常对照组雄性大鼠表现最为突出。
早期剥夺组雄性大鼠逃避失败次数随电击次数增加逐渐减少的趋势不明显。
两组大鼠逃避失败次数无显著差异，雄性与雌性大鼠的逃避失败次数差异不显著。
电击次数、性别与两组间无显著交互作用
2.3穿梭箱试验——主动逃避
图7所示为主动逃避行为次数随电击次数的变化趋势，随电击次数增加，大鼠主动逃避行为次数差异显著。
趋势分析表明两组大鼠主动逃避行为次数随电击次数增加逐渐增多。
两组大鼠主动逃避行为次数无显著差异。
雄性与雌性大鼠的主动逃避行为次数差异不显著。
电击次数、性别与两组间无显著交互作用。
3.大鼠海马BDNF含量——酶联免疫法
方差分析结果表明两组大鼠海马BDNF含量差异显著。
早期剥夺组大鼠海马BDNF含量显著低于正常对照组，
雄性与雌性大鼠海马BDNF含量差异不显著。
性别与两组间交互 作用不显著。
穿梭箱试验结束后第二天，
大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，断头后冰块上取脑，分离海马，用生理盐水制成10%匀浆，4000rpm离心10min,取上清液，用酶联免疫法检测BDNF的含量。
4.检测海马BDNF的表达——原位杂交法
BDNF——脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)属于神经营养素家族，是神经可塑性的分子标记物。神经可塑性假说是近年来继单胺耗竭假说、5-HT1A受体敏感性假说之后提出的又一抑郁症病理生理机制假说。临床研究提示BDNF表达与含量变化是导致抑郁症发病与抗抑郁治疗发挥疗效的重要因素。
研究表明早期母爱剥夺对大鼠BDNF的表达有着急性与长期的影响，出生后第9天的Wistar雄性大鼠在经历母爱剥夺12h和24h 后，下丘脑BDNF mRNA表达显著下调，在母鼠回窝后12h恢复正常，雌性大鼠则无显著变化 。
经历母爱剥夺的大鼠在成年期海马BDNF表达显著下调。
原位杂交法流程图
两组各随机选取6只大鼠，雌雄各半
腹腔注射戊巴比妥钠麻醉
迅速以4%多聚甲醛固定，常规脱水，透明石蜡包 埋
厚度5nm,取其中1套切片
二氨基苯联胺(DAB )显色，脱水，二 甲苯透明，封片。
进行原位杂交，脱蜡至水，3%H2O2室温10min 去除内源性过氧化物酶，3%柠檬酸稀释的胃蛋白 酶消化，加地高辛标记的BDNF寡核酸探针杂交，封闭
滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC ，滴加生物素化过氧 化物酶
在海马部位连续切片
光镜观察以胞浆呈棕黄色为阳性细胞，用不含探针的杂交液作为阴性对照。在100 倍视野下用Image Pro-Plus显微图像分析系统，测定海马 CAI、CA2、CA3 与齿状回(DG) 阳性细胞的平均光密度值。
大鼠海马BDNF mRNA的表达
mRNA表达示意图
补充：DNA（核酸的一种），叫脱氧核糖核酸,自然界中绝大多数生物的遗传物质是DNA,它是一种高分子化合物,具有双螺旋的空间结构,其分子内部的碱基排序可以储存大量的遗传信息。
RNA是另一种核酸,叫核糖核酸。
mRNA叫信使RNA,是RNA 的一种,是由DNA转录生成的,也可以携带遗传信息。
双链DNA的遗传信息，通过转录传递到RNA上，由 RNA将信息通过翻译过程继续递到蛋白
质分子上，从而达到控制性状的目的。
大鼠海马BDNF mRNA的表达
CA1
CA3
CA2
齿状回
图所示为40倍视野下大鼠海马BDNF mRNA的表达，方差分析结果表明两组大鼠海马 BDNF CA1区和CA3区mRNA表达差异显著。
齿状回DG(Dentate gyrus)
大鼠海马BDNF mRNA的表达
早期剥夺组大鼠海马CA1区和CA3区BDNF mRNA表达显著低于正常对照组，
早期剥夺组大鼠CA2区与齿状回BDNFmRNA表达低于正常对照组，但差异不显著。
雄性与雌性大鼠海马BDNF mRNA表达差异不显著，性别与两组间交互作用不显著。
CA2区与齿状回 BDNF mRNA表达则变化不显著，这一结果说明早期剥夺对海马不同区域的BDNF mRNA表达有不同的影响。
二、早期剥夺所致大鼠抑郁样行为与海马BDNF mRNA表达变化
讨论
经历早期剥夺的SD大鼠表现出一定的抑郁样行为。
1.早期剥夺组大鼠体重均显著轻于正常对照组，表现出体重增加减慢的趋势。
2.液体消耗试验中，在糖水可以直接获得的情况下, 早期剥夺组糖水摄入量与糖水偏爱均显著低于正常对照组，两组之间相对糖水摄入量差异不显著, 可能是由于早期剥夺组大鼠体重较轻所致，早期剥夺的SD大鼠具有快感缺乏的表现。
3.在穿梭箱试验中，仅在训练时，早期剥夺组大鼠的穿梭反应次数显著少于正常对照组，而在测试时，正常对照组与早期剥夺组大鼠的被动逃避行为、逃避失败与主动逃避行为次数均无显著差异，未表现出明显的习得性无助行为倾向。
二、早期剥夺所致大鼠抑郁样行为与海马BDNF mRNA表达变化
越来越多的证据表明生命早期应激可以下调海马BDNF的表达。
① Liu等报道母鼠减少对幼鼠舔舐和喂食行为会导致大鼠海马空间学习记忆能力下降，海马BDNF表达下调，海马 BDNF mRNA表达的变化在出生后第8天表现明显, 而在成年期并不显著。
②Roceri等则发现在出生后2-14天经历多次母婴分离的大鼠在出生后第17天海马BDNF表达上调。
生命早期应激如何改变海马BDNF的表达，BDNF的表达如何因年龄的增长、应激类型的不同或暴露应激的时间长短而表现出不同的变化，目前尚无定论。
二、早期剥夺所致大鼠抑郁样行为与海马BDNF mRNA表达变化之讨论
（一）大鼠种系的差别
在本实验中，早期剥夺导致SD大鼠表现出体重增长减慢和快感缺乏的抑郁样行为，但没有表现出习得性无助行为倾向，早期剥夺对大鼠行为的影响存在种系的差别。
①采用SD大鼠的研究中，在穿梭箱试验中，仅在训练时，早期剥夺组大鼠的穿梭反应次数显著少于正常对照组，而在测试时，正常对照组与早期剥夺组大鼠的被动逃避行为、逃避失败与主动逃避行为次数均无显著差异，未表现出明显的习得性无助行为倾向，这一结果与Wistar大鼠的实验结果相一致。
②采用Wistar 大鼠的研究中，经历早期剥夺的Wistar大鼠在自由饮用糖水时的糖水摄入量没有显著减少，而是在条件化压杆获得糖水的试验中，压杆次数显著减少, 获得奖赏的动机减弱。
③采用 Fischer大鼠的研究中，经历早期剥夺的雄性 Fischer大鼠的逃避失败次数显著高于正常大鼠， 具有习得性无助行为倾向。
因此基于生命早期应激建立的大鼠抑郁症模型的效度有待改善
二、早期剥夺所致大鼠抑郁样行为与海马BDNF mRNA表达变化之讨论
（二）性别差异未证实
在女性的一生当中，抑郁症的发病率高达5%~ 20%;
在男性的一生当中，抑郁症的发病率约为 3%~12%,
抑郁症的发病率存在一定的性别差异。
在本实验中，对早期剥夺所导致的SD大鼠抑郁样行为与海马BDNF mRNA表达下调是否存在性别差异也进行了比较，但结果表明早期剥夺对SD大鼠的这些影响不存在显著的性别差异。
二、早期剥夺所致大鼠抑郁样行为与海马BDNF mRNA表达变化之讨论
本文优点之处：采用了探针原位杂交法和分组试验多图分析的方法
小组读后反思：
1.样本量小，两组试验可能用的同一批大鼠，可信性不高。
2.原位杂交检测表达的结果只有数据比较，如果有检测结果图片展示更好。
3.既然表明大鼠早期剥夺是与大鼠CA2区与齿状回、CA1区和CA3区BDNFmRNA的表达存在相关性。但本研究只用到方差分析统计学方法重在突出差异显得单调，是否可加别的统计学方法(例如Logistic回归分析统计学方法)。
4.本研究讨论部分中，有关临床研究BDNF表达与含量变化是导致抑郁症发病与抗抑郁治疗发挥疗效的重要因素，属于临床范畴。本研究未对大鼠抑郁样行为进行详细陈述解释。
第二组汇报到此结束
谢谢！
期待大家对本文献的反思和评价，希望可以互相探讨。

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