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第2节　基因工程的基本操作程序
新课程标准 核心素养
1．阐明基因工程的原理和基本操作程序。2．针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。3．尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 1．科学思维——结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。2．科学探究——针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
知识导图
必备知识·夯实双基
一、目的基因的筛选与获取
1．目的基因
(1)概念：用于改变__受体细胞性状__或获得__预期表达产物__等的基因。
(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是__Bt抗虫蛋白基因__。
2．获取方法
特别提醒：引物是依据目的基因的已知序列设计而成的，其提供3′端，以便DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸连接。
二、基因表达载体的构建
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中__稳定存在__，并且可以__遗传__给下一代。
(2)使目的基因能够__表达__和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图]
3．基因表达载体的构建
首先用一定的__限制酶__切割载体，使它出现一个切口，然后用__同种__限制酶或__能产生相同末端__的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用__DNA连接酶__将目的基因片段拼接到载体的切口处。
三、将目的基因导入受体细胞
1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内__维持稳定__和__表达__的过程。
2．目的基因导入受体细胞的方法
(1)目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
Ⅰ．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入__子房__中。
Ⅱ．在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借__花粉管通道__进入__胚囊__。
②农杆菌转化法
Ⅰ．农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染__双子叶__植物和__裸子__植物；农杆菌的Ti质粒上的__T－DNA__能够整合到所侵染细胞的__染色体DNA__上。
Ⅱ．转化方法：将目的基因插入农杆菌__Ti质粒的T－DNA__中，让农杆菌侵染植物细胞。
(2)目的基因导入动物细胞
①常用方法：__显微注射__法。
②常用受体细胞：__受精卵__。
(3)目的基因导入微生物细胞
①方法：用__Ca2＋__处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。
四、目的基因的检测与鉴定
1．分子水平检测
(1)通过__PCR__等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。
(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行__抗原—抗体__杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。
2．个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验基础
(1)PCR原理：利用了__DNA的热变性__原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的__大小和构象__等有关。
2．实验步骤
→用__微量移液器__在微量离心管内依次加入PCR反应体系配方中的各组分，并离心
↓
→设置好相关参数，将微量离心管放入__PCR仪__中进行反应
↓
→根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，并加入适量__核酸染料__混匀
↓
→将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，插入合适大小的梳子，以形成__加样孔__，待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内
↓
→将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)的混合液缓慢注入凝胶的加样孔内(留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物)
↓
→接通电源，进行电泳。待指示剂前沿迁移接近__凝胶边缘__时，停止电泳
↓
→
┃┃学霸记忆__■
1．基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的筛选与获取；(2)基因表达载体的构建；(3)将目的基因导入受体细胞；(4)目的基因的检测与鉴定。
2．PCR反应液中需要提供DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
3．PCR反应中每次循环一般可分为变性、复性、延伸三步。
4．基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子以及标记基因等。
5．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法。
6．将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2＋处理法)。
7．分子水平的检测：检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中；检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
8．目的基因的检测与鉴定也可以在个体生物学水平进行鉴定。
┃┃活学巧练__■
1．从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。(√)
2．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。(×)
3．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。(×)
4．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。(√)
5．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。(×)
6．可通过PCR等技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。(√)
思考：
1．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。
提示：在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。
2．在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？
提示：第3轮
3．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。
提示：能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。
4．将目的基因导入动物的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？
提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。
课内探究·名师点睛
知识点?
目的基因的获取
1．目的基因
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因。
2．获取方法
(1)从基因文库中获取。
(2)利用PCR技术扩增。
(3)通过化学方法人工合成。
3．PCR反应
(1)条件
①模板：DNA母链(目的基因所在的DNA片段)。
②酶：耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。
③两种引物：分别与两条模板链相结合。
④原料：四种脱氧核苷酸。
(2)过程
过程 说明 图解
变性 温度上升到90℃左右，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
　　(3)结果
上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
知识贴士
关于引物
①概念：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度一般为20～30个核苷酸。
②作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，见下图：
③
┃┃典例剖析__■
典例1　下列有关PCR技术的叙述，错误的是(　B　)
A．PCR技术的原理是DNA半保留复制
B．变性过程中破坏的是磷酸二酯键
C．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的
D．延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸等，无需添加ATP
解析：PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，A正确；变性过程是目的基因DNA受热变性后解聚为单链，破坏的是氢键，B错误；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的，C正确；延伸过程中需要模板DNA、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等，无需添加ATP，D正确。
┃┃变式训练__■
1．用PCR扩增下面的DNA片段：
5′－GACCTGTGAATC……CATACGGGATTG－3′
3′－CTGGACACTTCG……GTATGCCCTAAC－5′
供选择的引物有：①5′－GACCTGTGGAAGC－3′、②5′－CATACGGGATTG－3′、③5′－GTATGCCCTAAC－3′、④5′－CAATCCCGTATG－3′共四种，应选择(　D　)
A．①②　 B．②③
C．③④　 D．①④
解析：用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端→3′端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5′端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5′端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5′端的碱基序列是5′－GACCTGTGAATC和5′－CAATCCCGTATG，故对应的引物为①5′－GACCTGTGGAAGC－3′和④5′－CAATCCCGTATG－3′，故选D。
知识点?
基因表达载体的构建
1．目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．地位：基因工程的核心步骤。
3．基因表达载体的组成
4．过程
知识贴士
启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
(1)启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，与终止子一样都位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止。
(2)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
┃┃典例剖析__■
典例2　在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是(　B　)
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子
②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止
④所有基因表达载体的构建是完全相同的
⑤必须在细胞内进行
A．②③⑤ B．①④⑤
C．①②⑤ D．③④
解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心内容，一个表达载体的组成，除了目的基因外，还有启动子、终止子和标记基因等，①错误；启动子是RNA聚合酶的结合位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子控制着转录的结束，③正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误；基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤错误。②③正确，①④⑤错误。故选B。
┃┃变式训练__■
2．下图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是(　D　)
A．图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA
C．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
D．用PstⅠ和HindⅢ酶切，可以保证重组DNA序列的唯一性
解析：图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，会打开一个切口，故有2个游离的磷酸基团，A错误；在构建重组质粒时，不能用BamHⅠ切割外源DNA，因为BamHⅠ会破坏目的基因，B错误；操作中获取目的基因时会用到PstⅠ，但甲中该酶会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，C错误；用PstⅠ和HindⅢ酶切，可以避免自身环化，保证重组DNA序列的唯一性，D正确。
知识点?
目的基因导入受体细胞
1．导入的方法
受体细胞类型 方法 说明 特点
植物细胞 农杆菌转化法 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达 经济、有效，适合于双子叶植物和裸子植物
花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达 简便、经济，我国科学家独创
动物细胞 显微注射法 目的基因片段受精卵的核内→将受精卵移植到雌性动物的输卵管或子宫内→使受精卵发育成转基因动物 将目的基因导入动物细胞的最有效的方法
微生物细胞 Ca2＋处理法(感受态细胞法) Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程 简便、经济、有效
2．目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别
(1)图中a细胞减数分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。
(2)图中b在进行细胞减数分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
知识贴士
在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。
┃┃典例剖析__■
典例3　农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是(　B　)
A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体DNA上
C．T－DNA D．农杆菌的拟核
解析：目的基因进入受体细胞后，要能正常表达，就必须插入受体细胞染色体DNA上。
┃┃变式训练__■
3．下列有关将目的基因导入受体细胞的叙述，正确的是(　A　)
A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法
B．原核生物有繁殖快、遗传物质少等特点，可用于生产各种有生物活性的蛋白质
C．基因枪法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法
D．可将含有目的基因的植物病毒作为载体导入Ca2＋处理后的大肠杆菌细胞
解析：原核生物的细胞中没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，故生产的蛋白质可能没有生物活性；将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术；植物病毒只侵染植物细胞。
知识点?
目的基因的检测与鉴定
1．目的基因的检测与鉴定
2．不同分子检测原理的异同
(1)检测目的基因是否插入受体DNA中、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则，只是被检测的物质不同，一个是转基因生物的基因组DNA，一个是转基因生物细胞内的mRNA。
(2)进行翻译水平的检测，通常以目的基因表达产物(蛋白质)作抗原，制备相应抗体，检测转基因生物的蛋白质，利用抗原与抗体特异性结合的原理。
(3)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
知识贴士
基因工程操作过程中碱基互补配对现象
基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象；第一步筛选与获取目的基因，用人工合成、PCR获取或基因文库获取，三种常用方法都涉及碱基互补配对；第二步基因表达载体的构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体，第四步利用分子杂交的方法检测(DNA、mRNA)，也都存在碱基互补配对现象。
┃┃典例剖析__■
典例4　转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是(　A　)
A．检测抗虫基因是否导入——农杆菌转化法
B．检测抗虫基因是否转录——PCR技术
C．检测抗虫基因是否翻译——抗原—抗体杂交
D．检测抗虫蛋白生物功能——抗虫接种实验
解析：农杆菌转化法是将抗虫基因导入植物细胞的方法，不能用于检测目的基因是否导入受体细胞，A错误；可用PCR技术检测抗虫基因是否转录出mRNA，B正确；检测目的基因是否翻译成蛋白质，常用抗原—抗体杂交，C正确；检测抗虫蛋白生物功能，可在个体水平上进行抗虫接种实验，D正确。
┃┃变式训练__■
4．在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是(　A　)
A．通过观察害虫吃棉叶是否死亡
B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带
C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带
D．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带
解析：A项属于个体生物学水平的鉴定，不是分子检测。B、C两项为分子检测，利用分子杂交技术，观察目的基因及目的基因转录形成的mRNA能否与DNA探针进行杂交形成杂交带；D项也为分子检测内容，利用抗原—抗体杂交的原理，检测基因表达产物能否与特定抗体形成杂交带。
知识点?
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验原理
(1)DNA片段的扩增：利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)电泳鉴定：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
2．操作步骤
(1)加样：按照PCR反应体系的配方将所有组分加入微量离心管中，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管底部。
(2)反应：将微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应(可参照下表内容进行设置)。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min / /
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
　　(3)制胶：根据待分离DNA片段的大小，制备琼脂糖凝胶。一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。制好的凝胶放入电泳槽中，加电泳缓冲液，以没过凝胶1mm为宜。
(4)点样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
(5)电泳：待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
(6)观察：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
3．注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
┃┃典例剖析__■
典例5　在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述错误的是(　D　)
A．该载体最可能为环形DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的酶切位点最短相距约200bp
D．限制酶切割时会导致作用位点的氢键和肽键断裂
解析：当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度约为800bp的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时则产生长度约为600bp和200bp的两种DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距约200bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点的磷酸二酯键，D错误。
┃┃变式训练__■
5．对禽流感的确诊，先用PCR技术将标本基因大量扩增，然后利用基因探针，测知待测标本与探针核酸的碱基异同。如图P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置，甲、乙、丙、丁是四份送检样品在测定后的电泳标记位置，哪份标本最有可能被确诊为禽流感(　C　)
A．甲 B．乙
C．丙 D．丁
解析：据图分析，图中P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置，甲、乙、丙、丁是四份送检样品在测定后的电泳标记位置，其中丙的电泳位置与P最接近，因此最有可能被确诊为禽流感。
指点迷津·拨云见日
一、细胞内DNA复制与PCR反应的比较
项目 体内DNA复制 PCR反应
不同点 时期 细胞有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期 体外随时进行
场所 活细胞内 微量离心管内
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
解旋 在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开 加热至90℃以上时，双链全部解开，不需解旋酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链 在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成 分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72℃左右
特点 边解旋边复制，半保留复制 体外迅速扩增
循环次数 受生物体自身控制 30多次
产物 完整DNA DNA片段
相同点 原料 4种脱氧核苷酸(A、G、C、T)
复制原理 严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制
模板 以DNA母链为模板
引物 都需要分别与两条模板链相结合的两种引物
┃┃典例剖析__■
典例6　PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是(　C　)
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④　 B．①②
C．①③　 D．②④
解析：PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：一是PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸；二是PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
二、DNA分子杂交技术
(1)原理：碱基互补配对原则。
(2)基因探针：用放射性同位素或荧光物质标记的目的基因。
(3)检测受体细胞是否含目的基因的具体过程：
┃┃典例剖析__■
典例7　下图为DNA分子杂交技术的应用，请分析后判断下图中两个物种亲缘关系更近的是(　A　)
解析：杂合双链区越长，说明两物种DNA中碱基序列相似度越高，而物种间碱基序列相似度越高，则其亲缘关系越近。通过分析比较可以看出物种甲和物种乙形成的杂合双链区最长，故两者的亲缘关系最近。
解疑答惑
?从社会中来 P76
提示：转基因抗虫棉抗虫的机制是抗虫基因(Bt基因)来源于苏云金杆菌，Bt基因表达的蛋白质具有杀虫活性。当害虫食用转基因抗虫棉花的时候，同时摄入Bt基因产生的抗虫蛋白，当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。培育转基因抗虫棉的步骤有目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
?旁栏思考1 P79
提示：用PCR不能直接扩增mRNA，DNA聚合酶识别的是双链DNA，mRNA为单链结构。应首先逆转录获得cDNA才能进行PCR。
?旁栏思考2 P80
提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。
?到社会中去 P83
1．提示：这是一个开放性的问题，需要查找资料来回答。随着田间监测数据的更新及新的科研论文发表，每年获得的证据是不一样的。要注意搜集科学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。
2．提示：科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
(1)基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。
(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。
?练习与应用 P83
一、概念检测
1．(1)√
(2)×　提示：构建重组质粒要用到限制酶(用来在特定位点进行切割)和DNA连接酶(用来连接目的基因和载体)，不需要核酸酶。
(3)×　提示：目的基因成功导入受体细胞后不一定会表达，还需要进行检测和鉴定。
2．D　提示：延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种脱氧核苷酸。
二、拓展应用
1．提示：可能在自交繁殖过程中存在转基因的沉默或丢失现象。
2．提示：(1)psy和crlⅠ基因、pmi基因将目的基因送入受体细胞。
(2)不能，限制酶会将目的基因切断，破坏目的基因。
(3)维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β－胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β－胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β－胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。
?探究·实践 P84
结果分析与评价
1．提示：观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
2．提示：如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
训练巩固·课堂达标
1．将目的基因导入大豆茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，常用的方法分别是(　C　)
A．显微注射法、农杆菌转化法 B．显微注射法、花粉管通道法
C．农杆菌转化法、显微注射法 D．花粉管通道法、显微注射法
解析：大豆是双子叶植物，农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物细胞常用的方法；显微注射法是将目的基因导入动物受精卵最常用的方法。
2．如图为形成cDNA的过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是(　D　)
A．催化①过程的酶是RNA聚合酶
B．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温
C．③过程需要解旋酶的作用
D．④过程需要冷却至50℃左右
解析：图中①过程为逆(反)转录，该过程需要逆转录酶(反转录酶)的催化，A错误；图中②⑤过程为DNA复制，这两个过程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤过程进行的温度是70～75℃，因此催化该过程的DNA聚合酶能耐高温，但催化②过程的酶可以不耐高温，B错误；③过程为高温解链，该过程不需要解旋酶，C错误；④为复性过程，需要冷却至50℃左右，D正确。
3．基因表达载体的构建所需要的条件是(　B　)
①同一种限制酶　②具有某些标记基因的质粒　③RNA聚合酶　④目的基因　⑤DNA连接酶　⑥启动子　⑦终止子
A．①②③④⑤⑥⑦　　 B．①②④⑤⑥⑦
C．②④⑥⑦ D．①②④⑤
解析：构建基因表达载体是将目的基因与有关载体拼接起来，故所需要的条件除了目的基因和具有某些标记基因的质粒外，还需要同一种限制酶和DNA连接酶，启动子和终止子。
4．(不定项)如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述，错误的是(　ABD　)
A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成由两个DNA片段连接形成的产物有两种
B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C．为了防止目的基因反向粘连和质粒自行环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞
解析：根据题意，目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，将含有目的基因的DNA用EcoRⅠ酶切，会得到目的基因片段；根据质粒的简图可知，将质粒用EcoRⅠ酶切，会得到与质粒周长等长的链状DNA；因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—质粒片段、质粒—质粒片段三种产物，A错误；DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误；EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，获取目的基因和切割质粒时，同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割，目的基因两端形成的末端不同，切割开的质粒两端形成的末端不同，再用DNA连接酶连接，可以防止目的基因反向连接和质粒自身环化，C正确；题图显示，在构建基因表达载体的过程中质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因都不会被破坏，因此能在含青霉素和四环素的培养基中生长的受体细胞不能表明目的基因已成功导入该细胞，D错误。第4节　蛋白质工程的原理和应用
新课程标准 核心素养
1．说出蛋白质工程崛起的缘由。2．概述蛋白质工程的基本原理。3．举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。 1．科学思维——尝试通过蛋白质工程技术，根据人类需要的蛋白质结构，设计或改造某一蛋白质的设计流程。2．社会责任——尝试运用逆向思维分析和解决问题。
知识导图
必备知识·夯实双基
一、蛋白质工程
1．概念
(1)基础：蛋白质分子的__结构规律__及其与__生物功能__的关系。
(2)手段：通过__基因改造__或__基因合成__，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。
(3)目的：获得满足人类的生产和生活需求的__蛋白质__。
2．理论和技术条件：__分子生物学__、__晶体学__以及__计算机__技术的迅猛发展。
二、蛋白质工程崛起的缘由
1．基因工程的实质：将一种生物的__基因__转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的__蛋白质__，进而表现出__新的性状__。
2．基因工程的不足：基因工程在原则上只能产生自然界中__已存在__的蛋白质。
3．天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合__特定物种__生存的需要，却不一定完全符合__人类生产和生活__的需要。
4．实例：玉米中赖氨酸的含量比较低，赖氨酸合成中两种酶的__氨基酸__被替换，就可以使玉米叶片和种子中游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。
三、蛋白质工程的基本原理
1．目标：根据人们对__蛋白质__功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
2．方法：__改造基因__或__合成基因__。
3．流程：预期蛋白质功能→设计预期的__蛋白质结构__→推测应有的__氨基酸__序列→找到相对应的__脱氧核苷酸__序列(基因)或合成新的__基因__→获得所需要的蛋白质。
四、蛋白质工程的应用
1．在医药工业方面的应用
(1)研发速效胰岛素类似物：科学家通过改造__胰岛素基因__使B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与29的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了__胰岛素的聚合__，研发出速效胰岛素类似物。
(2)提高干扰素的保存期：将干扰素分子上的一个
__半胱氨酸__变成__丝氨酸__，提高了干扰素的保存时间。
(3)改造抗体：将小鼠单克隆抗体上__结合抗原的区域__“嫁接”到人的抗体上，降低了诱发人体免疫反应的强度。
2．在其他工业和农业方面的应用
(1)改进酶的性能或开发新的工业用酶：利用蛋白质工程获得蛋白酶的多种__突变体__。
(2)改造某些重要的酶：利用蛋白质工程改造参与
__调控光合作用__的酶，以提高植物光合作用的效率。
┃┃学霸记忆__■
1．基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。
2．蛋白质工程并不是直接改造蛋白质分子的结构，而是通过基因操作来实现对天然蛋白质的改造。
3．蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
4．蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因改造或基因合成，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。
┃┃活学巧练__■
1．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。(×)
2．蛋白质工程能产生自然界中不存在的新型蛋白质分子。(√)
3．实施蛋白质工程的前提条件是了解蛋白质结构和功能的关系。(√)
4．基因工程遵循中心法则，而蛋白质工程不遵循。(×)
5．根据某多肽链的一段氨基酸序列，可以很容易地确定控制该肽链合成的基因的脱氧核苷酸序列。(×)
6．蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为人们对蛋白质复杂的高级结构没有完全认识。(√)
思考：
1．为什么蛋白质工程不是直接改造蛋白质而是通过基因改造和基因合成来完成？
提示：①任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质也是无法遗传下去的。②对基因进行改造比对蛋白质进行直接改造容易操作，难度小得多。
2．蛋白质工程的操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？
提示：基因工程操作程序的基本思路遵循中心法则，从DNA→mRNA→多肽→折叠产生蛋白质，基本上是生产出自然界中已有的蛋白质。蛋白质工程是按照相反的思路进行的，确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→基因中的碱基序列，可以创造自然界不存在的蛋白质。
课内探究·名师点睛
知识点?
蛋白质工程
1．对蛋白质工程的2点说明
(1)改造对象：通过改造控制蛋白质合成的基因的结构来改造某种蛋白质的结构。
①任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。
②对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作，难度要小得多。
(2)蛋白质工程中经过处理得到的新基因与基因突变得到的新基因有较大差别：基因突变的新基因中含有不编码蛋白质的序列，而蛋白质工程中的新基因则没有。
2．蛋白质工程的基本流程
┃┃典例剖析__■
典例1　目前科学家通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是(　B　)
①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列
③蓝色荧光蛋白基因的合成
④表达出蓝色荧光蛋白
A．①②③④　　　　 B．②①③④
C．②③①④ D．④②①③
解析：蛋白质工程的基本流程是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→表达出相应的蛋白质，故正确顺序应该是②①③④。
┃┃变式训练__■
1．下图表示蛋白质工程的操作过程，相关说法不正确的是(　C　)
A．a、b过程分别是转录、翻译
B．蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作
C．蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术
D．蛋白质工程中可能构建出一种全新的基因
解析：a过程是以DNA的一条链为模板合成mRNA的转录过程，b过程是以mRNA为模板合成具有一定氨基酸顺序的多肽链的翻译过程，A项正确；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，因此蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作，B、D项正确；蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，C项错误。
知识点?
蛋白质工程与基因工程的区别与联系
比较项目 蛋白质工程 基因工程
区别 起点 预期的蛋白质功能 目的基因
过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→获得需要的蛋白质 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
目标 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 生产非天然的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质
联系 ①都在生物体外对基因进行操作；②蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
知识贴士
“二看法”判断基因工程和蛋白质工程
一看对基因的操作方法—
二看合成的蛋白质种类—
┃┃典例剖析__■
典例2　蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，有广阔的发展前景。下列关于蛋白质工程的描述，正确的是(　C　)
A．因为需要对蛋白质直接改造，所以操作更难
B．因为蛋白质不能遗传，所以蛋白质工程的产物不能大量生产
C．蛋白质工程也需要设计出相应的基因
D．蛋白质工程在各个领域有广泛应用
解析：蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，是在分子水平上对基因分子直接进行操作，A项错误；分子水平上对基因分子直接进行操作使其遗传物质发生改变，可以遗传给下一代，B项错误；蛋白质工程对基因分子直接进行操作，需要推测出应有的氨基酸序列，设计出相应的基因，C项正确；蛋白质工程的发展并不成熟，仍需一段时间提升，其目前并不能在各个领域广泛应用，D项错误。
┃┃变式训练__■
2．下列关于蛋白质工程的叙述，正确的是(　A　)
A．通过对基因结构的定点改造实现对玉米中赖氨酸合成过程中的关键酶结构的改造属于蛋白质工程
B．将人的胰岛素基因导入大肠杆菌细胞内，使大肠杆菌生产人的胰岛素的技术属于蛋白质工程
C．蛋白质工程不需要构建基因表达载体
D．通过蛋白质工程改造后的蛋白质的特性不能遗传给子代
解析：通过对基因结构的定点改造实现对玉米中赖氨酸合成过程中的关键酶结构的改造属于蛋白质工程，A项正确；将人的胰岛素基因导入大肠杆菌细胞内，使大肠杆菌生产人的胰岛素的技术属于基因工程，B项错误；在蛋白质工程中，改造后的基因需要导入受体细胞内才能表达出相应的蛋白质，故需要构建基因表达载体，C项错误；蛋白质工程的实质是对基因进行改造，从而实现对蛋白质的改造，改造后的蛋白质的特性可遗传给子代，D项错误。
指点迷津·拨云见日
区分蛋白质组计划、蛋白质工程与酶工程
人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域另一项重大的科学命题，是研究细胞中基因编码的全部蛋白质的组成、结构、修饰及其功能的国际合作计划。
目前科学家对大多数蛋白质的高级结构的了解还很不够，要设计出更加符合人类需要的蛋白质还需要经过艰辛的探索。人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋白质工程的有力推动和理论支持。
酶工程就是指酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。如固定化酶技术、加酶洗衣粉、嫩肉粉等。
通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存在酶的合理、充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子进行改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。
┃┃典例剖析__■
典例3　T4溶菌酶在高温时易失去活性。研究人员对编码T4溶菌酶的基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位的异亮氨酸变成半胱氨酸，该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。下列相关叙述正确的是(　D　)
A．T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和数目发生了改变
B．T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程，自然界中的酶都可通过蛋白质工程进行改造
C．蛋白质工程与中心法则的流程方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质
D．若高温等使蛋白质的空间结构发生改变，则蛋白质的功能也会受影响
解析：由题意可知，T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的肽链的氨基酸序列发生了改变，氨基酸的数目没有改变，A项错误；T4溶菌酶的化学本质是蛋白质，对其进行改造属于蛋白质工程，在自然界中绝大多数酶的化学本质是蛋白质，但也有少数酶的化学本质是RNA，化学本质是RNA的酶不能通过蛋白质工程进行改造，B项错误；蛋白质工程与中心法则的流程方向相反，其流程是从预期蛋白质的功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，C项错误；蛋白质的功能由蛋白质的结构决定，蛋白质的空间结构发生改变，蛋白质的功能也会受到影响，D项正确。
解疑答惑
?从社会中来 P93
提示：科学家解析了多管水母绿色荧光蛋白的晶体结构，并利用计算机进行辅助设计，在此基础上再采用定点突变的技术将绿色荧光蛋白发光基团正下方的第203位的苏氨酸替换为酪氨酸，从而获得了一种新的绿色荧光蛋白的衍生物——黄色荧光蛋白。
?旁栏思考 P93
提示：人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域重大的国际合作科研项目。2001年，国际人类蛋白质组组织宣布成立。2003年，该组织正式提出启动两项重大国际合作项目：一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是由美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。“人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔重大国际科研协作计划。它的目标是通过对肝脏蛋白质高通量、规模化的研究，解析肝脏蛋白质在生理、病理过程中的功能意义，为重大肝病的预防、诊断、治疗和新药的研发提供重要的科学依据。2010年，该计划“两谱、两图、三库”的目标初步实现。我国科学家完成了人类肝脏蛋白质组表达谱和修饰谱，绘制了蛋白质相互作用连锁图和定位图。“三库”则是建立符合国际标准的肝脏标本库、发展规模化抗体制备技术并建立肝脏蛋白质抗体库和建立完整的肝脏蛋白质组数据库。人类蛋白质组计划取得的成果有力推动了蛋白质工程的发展，为它提供了重要的理论支持。2014年6月，中国人类蛋白质组计划启动。
?思考·讨论 P94
1．提示：每种氨基酸都有对应的密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将教材中氨基酸序列的编码序列查出来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多种密码子编码的，因此相应的碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出32种，可以根据学过的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据密码子推出mRNA序列[GCU(或C或A或G)UGGAAA(或G)GAA(或G)UUU或(C)]，再根据碱基互补配对原则推出脱氧核苷酸序列[CGA(或G或T或C)ACCTTT(或C)CTT(或C)AAA(或G)]。
2．提示：确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。
?异想天开 P95
提示：理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。利用改造后的动物细胞、微生物细胞等可以生产人类需要的蛋白质，但这些蛋白质往往都是自然界中已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出来的、自然界中不存在的蛋白质。主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对大多数蛋白质的高级结构和蛋白质在生物体内如何行使功能了解得还不够，很难设计出一个全新的而又具有功能的蛋白质。即使设计并获得了一个全新的蛋白质，它的生理生化特性、用它生产的蛋白质食品的安全性等都需要长期深入的研究。
?到社会中去 P96
提示：酶用作工业催化剂，比无机催化剂具有更大的优越性，主要体现在以下几个方面。由于酶促反应能在常温、常压和中性pH条件下进行，因此可以节省大量的能源和设备投资；生产过程中不会造成严重的污染，符合环境保护的要求；生产过程简单、效率高，产品质量好，生产成本低。因此，酶制剂在工业领域得到了广泛的应用。近年来，通过引进国外先进设备、优良菌种以及开发新型酶制剂，我国酶制剂产业保持了较快的增长态势，品种越来越丰富，产品的市场竞争力也在不断提升。2016年，我国工业酶制剂年产量达120万吨，年增长率保持在10%左右。在全球范围内，我国酶制剂的市场份额已占到了30%左右，我国进入酶制剂生产大国的行列。在酶制剂产业中，蛋白质工程被广泛用于开发酶的新品种或改进酶的性能，如提高酶的热稳定性，增加某些被用作去污剂的酶的去污效率等。
?练习与应用 P96
一、概念检测
1．(1)×　提示：基因决定蛋白质，蛋白质工程也需要对基因进行操作。
(2)×
(3)√
2．D　提示：蛋白质工程的最终目的是改造现有的蛋白质，或者制造一种全新的蛋白质，以满足人类的需求。
3．A　提示：蛋白质工程目前可操作的直接对象为基因。
二、拓展应用
提示：这项工作属于蛋白质工程的范畴。引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是基因的碱基序列发生了变化。如果要将改造后的T4溶菌酶应用于生产实践，还有很多工作需要做。例如，由于改造后酶的空间结构发生了变化，因此它的一些基本特性需要重新明确，包括它能耐受的温度范围、催化反应的最适温度、酶活力的大小等；需要建立规模化生产该酶的技术体系，评估生产成本等。
训练巩固·课堂达标
1．蛋白质工程崛起的缘由是(　C　)
A．天然蛋白质使生物适应环境
B．天然蛋白质均为自然界中存在的种类
C．天然蛋白质不能够完全满足人类生产和生活的需要
D．天然蛋白质的结构和种类是长期自然选择的结果
解析：蛋白质工程崛起的缘由：基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，而这些天然蛋白质却不一定能够完全满足人类生产和生活的需要。
2．从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是(　C　)
A．合成编码目的肽的DNA片段
B．构建含目的肽DNA片段的表达载体
C．依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D．筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
解析：紧扣蛋白质工程的流程(基本途径)进行分析。由题可知，多肽P1为抗菌性和溶血性均较强的多肽，要设计出抗菌性强但溶血性弱的多肽，即在P1的基础上设计出自然界原本不存在的蛋白质，用蛋白质工程技术可以实现。蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。故要想在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是依据P1的氨基酸序列设计出多条模拟肽，然后进行改造，从而确定抗菌性强但溶血性弱的多肽的氨基酸序列。
3．猪胰岛素用于降低人体血糖浓度的效果并不明显，原因是猪胰岛素分子中有一个氨基酸与人的不同。为了使猪胰岛素能够用于临床治疗糖尿病，利用蛋白质工程对猪胰岛素分子设计的最佳方案是(　A　)
A．对猪胰岛素进行一个不同氨基酸的替换
B．将猪胰岛素和人胰岛素进行拼接组成新的胰岛素
C．将猪和人的胰岛素混合在一起治疗糖尿病
D．根据人的胰岛素设计制造一种全新的胰岛素
解析：由于猪胰岛素分子中只有一个氨基酸与人的胰岛素不同，所以只需替换这一个不同的氨基酸即可。虽然根据人胰岛素分子设计一种全新的胰岛素也可以用于临床治疗，但是在分子设计和胰岛素的生产方面都存在很多的困难，所以并不是最佳方案。
4．(不定项)下列属于蛋白质工程成果的是(　ABC　)
A．改造酶的结构，提高酶的热稳定性
B．生产出鼠—人嵌合抗体
C．将t－PA分子中的天冬酰胺替换为谷氨酰胺
D．将人的胰岛素基因整合到大肠杆菌体内生产胰岛素
解析：将人的胰岛素基因整合到大肠杆菌体内生产胰岛素，属于基因工程的成果。本章整合
网络构建·素养展示
章末解题·释疑解惑
复习与提高 P98
1．提示：(1)①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶。②为了避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同种酶)切割目的基因所在片段和质粒。③切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择。
(2)加入DNA连接酶。
(3)该质粒便于进行双重筛选。标记基因AmpR基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于LacZ基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒(没有连接目的基因的质粒)的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。
(4)白色。限制酶切割质粒时，使LacZ基因被破坏，含重组质粒的大肠杆菌不含LacZ基因，所以X－gal不会分解产生蓝色物质，菌落呈现白色。
2．提示：(1)逆转录病毒是载体，能将外源基因Oct3/4、Sox2、c－Myc和Klf4送入小鼠成纤维细胞中。
(2)可以设置对照组。将转入外源基因和没有转入外源基因的细胞分别培养在相同的培养基中，并确保其他培养条件相同。如果只有转入外源基因的细胞转化成了iPS细胞，就可以证明iPS细胞的产生不是由于培养基的作用。
(3)可以依次去掉1个基因，将其他3个基因转入小鼠成纤维细胞中，然后通过与转入4个基因的小鼠成纤维细胞的诱导情况进行比较，来推测缺失的那个基因对诱导iPS细胞的影响，进而判断每个基因作用的相对大小。(其他合理答案均可)
(4)不会引起免疫排斥反应，因为在诱导转化的过程中细胞的遗传物质没有发生变化，理论上产生的还是“自体”细胞。iPS细胞拥有分化为各种细胞的潜能，因此存在分化成肿瘤细胞的风险。
3．提示：(1)从亲缘关系的远近来看，固氮相关基因可能更容易在水稻根系微生物中稳定存在和表达，进而使其具有固氮的能力。(其他合理答案均可)
(2)此题不要求有唯一的答案，学生可从便捷性、安全性、经济性等角度进行分析，言之成理即可。例如，从便捷性角度认为能固氮的水稻新品种更值得推广；或从转基因安全性角度认为能固氮的水稻根系微生物更值得推广等。
直击高考·真题体验
1．(2022·山东卷，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　B　)
A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析：低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
2．(2019·北京卷)甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株，再将二者杂交后得到F1，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种。以下对相关操作及结果的叙述，错误的是(　D　)
A．将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞
B．通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定
C．调整培养基中植物激素比例获得F1花粉再生植株
D．经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体
解析：基因工程中需在体外先将目的基因与带有标记基因的载体结合，再将其导入受体细胞，A项正确。在个体生物学水平上，可通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定，B项正确。在花粉离体培养过程中，合理调整培养基中生长素和细胞分裂素的比例，可使愈伤组织再分化，获得F1花粉再生植株，C项正确。经花粉离体培养获得的若干再生植株一般为单倍体，D项错误。
3．(2019·江苏卷)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是(　D　)
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
解析：基因工程菌中含目的基因，能通过繁殖遗传给子代，A项不符合题意。经组培获得的转基因植株的细胞中都含目的基因，能够遗传给子代，B项不符合题意。培育得到的转基因奶牛的细胞中都含目的基因，故能遗传给子代，C项不符合题意。由题干信息可知，进行题述基因治疗时只有淋巴细胞含目的基因，生殖细胞不含目的基因，故不能遗传给子代，D项符合题意。
4．(2022·广东卷，22)“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对__引物__，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞__，终止子的作用是__终止转录，使转录在需要的地方停下来__。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是__二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长__，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了__废物的资源化__，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于__不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳__，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
解析：(1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的3′端延伸子链。(2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
5．(2022·湖南卷，22)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是__氨基酸序列多肽链__，物质b是__mRNA__。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是__密码子的简并__。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有__从基因文库中获取目的基因__、__通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成__和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是__DNA双链复制__。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的__种类__(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是__提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏__。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路：__取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间__。
解析：(1)据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并，即一种氨基酸可能有几个密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
6．(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT－PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是__逆转录酶(反转录酶)__，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的__特异性核苷酸序列__来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是__退火(复性)__。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明__曾感染新冠病毒，已康复__(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明__已感染新冠病毒，是患者__。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是__获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)__。
解析：(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT－PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(90～95℃)、复性(55～60℃)、延伸(70～75℃)，故其中温度最低的一步是复性。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭已康复，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。(4)基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建(基因工程的核心)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)。
7．(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是__④②③①__(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是__Taq酶(热稳定DNA聚合酶)__。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、__延伸__三步，其中复性的结果是__Taq酶从引物起始进行互补链的合成__(或：引物通过碱基互补配对和单链DNA结合)。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与__两条单链DNA__特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指__一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术__。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
解析：(1)PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。(2)在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶(热稳定DNA聚合酶)，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是Taq酶从引物起始进行互补链的合成(引物通过碱基互补配对和单链DNA结合)。(3)DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。(4)据分析可知，PCR(多聚酶链式反应)技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
8．(2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种__限制性内切核酸(或限制)__酶，它通过识别特定的__核苷酸序列__切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′—羟基与5′—磷酸间形成__磷酸二酯键__；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__DNA单链__；TaqDNA聚合酶的作用是催化__以DNA为模板的DNA子链的延伸__。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__②④__(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是__B__。
A．5′—AACTATGCG－－－－－－－AGCCCTT—3′
B．5′—AATTCCATG－－－－－－－－CTGAATT—3′
C．5′—GCAATGCGT－－－－－－－TCGGGAA—3′
D．5′—TTGATACGC－－－－－－－－CGAGTAC—3′
解析：(1)EcoRI是一种限制性内切核酸酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。(2)DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3′—羟基和5′—磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；TaqDNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA子链的延伸。(3)引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。(4)对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoRI剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5′端应该是AATTC，3′端是GAATT，故选B。
9．(2021·广东卷)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有__从基因文库中获取、人工合成法__。(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有__盐析法、酶解法或高温变性__。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备__感受态__细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有__抗原—抗体杂交技术__。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是__有的酶失活而使反应中断__。在分子水平上，可以通过改变__基因的碱基序列__，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性以及对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
10．(2020·山东卷，25题)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是__限制性内切核酸酶和DNA连接酶__,__重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为__转化__。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了__RNA聚合酶与启动子的识别和结合__，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列__不发生__ (填：“发生”或“不发生”)改变，原因是__编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子__。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(WxmRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经__逆转录(或反转录)__过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是__引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)__。
(4)各品系WxmRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为__品系3__，原因是__品系3的WxmRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强__。
解析：(1)将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出Wx基因的cDNA。(4)识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。
11．(2021·河北卷)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理(例如，收集植物组织器官异地妥善储存)，可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__基因组文库__。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__限制酶和DNA连接酶__。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是__便于目的基因的筛选和鉴定__。
(3)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__农杆菌转化法__。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是__避免目的基因在自然界中的扩散__。
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__耐性__(填“耐性”或“富集能力”)；据图2可知，对转基因植株的__茎叶__进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是__YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水__。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于__杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用__(写出两点即可)。
解析：(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。(3)农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T－DNA可转移并插入到受体细胞染色体DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。(4)根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。(5)YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。第1节　重组DNA技术的基本工具
新课程标准 核心素养
1．简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。2．认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3．进行DNA的粗提取与鉴定。 1．科学思维——模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。2．社会责任——关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生了基因工程。
知识导图
必备知识·夯实双基
一、基因工程的概念
1．操作场所：__生物体外__。
2．操作技术：__转基因__等技术。
3．操作结果：赋予生物新的__遗传特性__，创造出更符合人们需要的新的__生物类型__和生物产品。
4．操作水平：__DNA分子__水平。
二、DNA重组技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(又称限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源：主要来自__原核生物__。
(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定__核苷酸序列__，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__断开。
(3)结果：产生__黏性末端__或__平末端__。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__。
(2)种类[填表]
　　种类比较　　 E．coliDNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 __大肠杆菌__ __T4噬菌体__
特点 只能连接__黏性末端__ 既可以连接黏性末端，又可以连接__平末端__
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)质粒
①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于__真核细胞的细胞核__或__原核细胞拟核DNA__之外，并具有__自我复制__能力的环状双链DNA分子。
②质粒适于作基因运载体的特点
Ⅰ．质粒分子上有一个至多个__限制酶切割__位点，供外源DNA片段插入其中。
Ⅱ．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中__进行自我复制__，或__整合到受体DNA上__，随
__受体细胞DNA__同步复制。
Ⅲ．人工改造的质粒常带有__标记基因__，便于__重组DNA分子的筛选__。
(2)噬菌体、动植物病毒等。
三、DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
(1)__DNA__不溶于酒精，__蛋白质__溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于__2mol/L的NaCl__溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇__二苯胺__试剂会呈现蓝色。
2．实验步骤
(1)称取30g洋葱，切碎，加入10mL研磨液，充分研磨。
↓
(2)漏斗中垫__纱布__，将研磨液过滤到烧杯中，__4__ ℃处理，取上清液。
↓
(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的__酒精__溶液，静置2～3min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。
↓
(4)取两支20ml的试管编号A、B，各加入2mol/L的__NaCl__溶液5mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4mL的__二苯胺试剂__。混匀后，将试管置于__沸水__中加热5min。
↓
(5)结果观察：A试管__不变蓝__，B试管__变蓝色__。
┃┃学霸记忆__■
1．基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。
2．DNA重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。
3．限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。
4．E．coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。
5．质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。
6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
8．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。
9．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
┃┃活学巧练__■
1．基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。(√)
2．DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。(×)
3．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。(×)
4．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。(√)
5．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。(×)
6．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。(√)
思考：
1．为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？
提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
2．限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？
提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E．coliDNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。
3．细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。
(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
4．如何检测(重组)质粒是否导入受体细胞？
提示：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。
课内探究·名师点睛
知识点?
限制性内切核酸酶(限制酶)—“分子手术刀”
1．作用特点
①切割外源DNA，对自身的DNA不起作用，从而达到保护自身的目的。
②专一性：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
2．作用结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。
①黏性末端：错位切，在识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开，产生的是黏性末端，如下图。
②平末端：平切，沿着识别序列的中心轴线切开，产生的是平末端，如下图。
3．限制酶的识别序列和切割末端的判断
(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如右图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。
(2)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割，但同样能相互连接。
┃┃典例剖析__■
典例1　下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是(　A　)
A．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列
B．限制酶的活性受温度、pH的影响，总有一个最合适的条件
C．限制酶能破坏相邻脱氧核苷酸之间的化学键
D．限制酶不只存在于原核生物中，其合成场所是核糖体
解析：限制酶只能够识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列，不能识别RNA分子的核糖核苷酸序列，A项错误；同其他的酶一样，限制酶同样受温度和pH的影响，而且具有发挥最大催化效率的最适温度和最适pH，B项正确；限制酶催化的是特定部位磷酸二酯键的断裂，属于水解反应，C项正确；限制酶主要从原核生物中分离纯化，也有来自真核生物的，其本质是蛋白质，在核糖体上合成，D项正确。
┃┃变式训练__■
1．限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列应该为(　D　)
A．BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互补序列为—AATT—
B．BamHⅠ和HindⅢ；末端互补序列为—GATC—
C．EcoRⅠ和HindⅢ；末端互补序列为—AATT—
D．BamHⅠ和BglⅡ；末端互补序列为—GATC—
解析：A项中BamHⅠ切割出来的末端序列为—GATC—，EcoRⅠ切割出来的末端序列为—AATT—，两者不能互补黏合；B项中HindⅢ切割出来的末端序列为—AGCT—，与BamHⅠ切割出的末端序列不能互补黏合；同理可推出C项所示两种限制酶所切割出来的末端也不能互补黏合，只有D项所示两种限制酶所切割出来的末端才能互补黏合。
知识点?
与DNA分子相关的几种酶的分析
1．限制酶与DNA连接酶的比较
项目 限制酶 DNA连接酶
不同点 作用 使特定部位的磷酸二酯键断裂 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键
应用 用于提取目的基因和切割载体 用于基因表达载体的构建
关系
2．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
种类 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 催化形成磷酸二酯键
不同点 模板 不需要模板 需要以DNA的一条链为模板
作用过程 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键
作用结果 形成完整的DNA分子 形成DNA的一条链
用途 基因工程等 DNA复制
　　3．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶、解旋酶的作用部位图解
(1)作用于磷酸二酯键的酶：限制酶(a断开)、DNA连接酶(a形成)和DNA聚合酶(a形成)、DNA水解酶(a断开)。
(2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶。
知识贴士
氢键的形成是由于分子间的作用力，其断裂与重新形成均与限制酶、DNA连接酶无关。
┃┃典例剖析__■
典例2　下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是(　B　)
A．将单个核苷酸加到某个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
B．将断开的2个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键
C．连接2条DNA链上碱基之间的氢键
D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末端进行连接
解析：DNA连接酶和DNA聚合酶都能催化2个脱氧核苷酸分子之间形成磷酸二酯键。但DNA连接酶是在2个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将2个DNA片段连接成重组DNA分子；DNA聚合酶是将单个的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。
┃┃变式训练__■
2.1972年伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。下列相关叙述正确的是(　B　)
A．不同的DNA分子必须用同一种限制酶切割，才能产生相同的黏性末端
B．DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键
C．当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是平末端
D．限制酶和DNA连接酶的作用部位不同
解析：有些限制酶的识别序列不同，但可以产生相同的黏性末端，A项错误；DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键，B项正确；当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，C项错误；限制酶和DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，D项错误。
知识点?
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1．载体的功能
(1)作为运载工具将目的基因转运到宿主细胞内。
(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2．常用的载体——质粒
(1)存在场所：细菌、真菌等生物的细胞质。
(2)本质：环状DNA分子。
(3)特点：含有标记基因。
(4)载体必须具备的条件
①能在受体细胞内稳定保存并大量复制。
②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。
③具有某些标记基因，以便进行筛选。
④载体应对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
知识贴士
基因工程中的载体与载体蛋白的区别
基因工程中的载体 载体蛋白
来源 细菌的质粒、噬菌体、动植物病毒 细胞膜上的蛋白质
作用 将目的基因转移到宿主细胞中，并能在宿主细胞中对目的基因进行大量复制 运载要进出细胞的某些物质
┃┃典例剖析__■
典例3　作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是(　A　)
A．能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D．对受体细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择
解析：作为载体必须能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个至多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的鉴定和选择，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便受体细胞能进行正常的生命活动，D错误。
┃┃变式训练__■
3．下列关于质粒运载体的说法，正确的是(　A　)
①使用质粒运载体是为了把目的基因导入受体细胞并使之在受体细胞中稳定存在
②质粒运载体只能与目的基因重组后进入细胞
③质粒运载体可能是根据细菌或者病毒的DNA改造的
④质粒运载体的复制和表达也遵循中心法则
⑤质粒运载体只有把目的基因整合到受体细胞的DNA中才能表达
⑥没有限制酶就无法使用质粒运载体
A．①④⑥　　　　　 B．②③④
C．①②⑤ D．③④⑥
解析：使用质粒运载体是为了把目的基因导入受体细胞，并使目的基因在宿主细胞中稳定保存，①正确；质粒运载体本身也可以进入细胞，不是与目的基因重组后才能进入细胞，②错误；质粒运载体可能是根据细菌DNA改造的，而病毒没有质粒，③错误；质粒运载体的复制和表达也遵循中心法则，这是基因工程设计的原理之一，④正确；质粒运载体将目的基因导入受体细胞并稳定存在即可表达，不一定要把目的基因整合到受体细胞的DNA中才能表达，⑤错误；质粒是环状DNA分子，将目的基因与质粒重组需要使用限制酶，因此没有限制酶就无法使用质粒运载体，⑥正确，综上所述①④⑥正确，故选A。
知识点?
DNA的粗提取与鉴定
1．实验材料的选取
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。选取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。
2．方法步骤
(1)粗提取DNA
(2)鉴定DNA
试管编号 A(对照组) B(实验组)
步骤1 2mol·L－1的NaCl溶液5mL 2mol·L－1的NaCl溶液5mL
步骤2 不进行任何处理 加丝状物或沉淀物
步骤3 加4mL二苯胺试剂，混匀 加4mL二苯胺试剂，混匀
步骤4 沸水浴5min 沸水浴5min
实验现象 溶液不变蓝色 溶液逐渐变为蓝色
实验结论 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
　　特别提醒：(1)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质和脂质。
(2)不用哺乳动物的血液作为实验材料，这是因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，不含DNA。
(3)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(4)沉淀DNA时必须用冷酒精。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，使DNA易形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
┃┃典例剖析__■
典例4　下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　B　)
A．该实验不能选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料
B．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它不溶于2mol·L－1的NaCl溶液
C．该实验中加入体积分数为95%的预冷酒精可用来析出DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热
解析：由于哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，因此不能作为提取DNA的材料，A正确；DNA可溶解在2mol·L－1的NaCl溶液中，B错误；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，因此提取DNA时，加入预冷的、体积分数为95%的酒精溶液可以除去蛋白质、析出DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会呈现蓝色，D正确。
┃┃变式训练__■
4．在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，甲、乙、丙、丁四个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均正确，但实验结果却不同。下列有关叙述不正确的是(　D　)
组别 实验材料 提取核物质时加入的溶液 去除杂质时加入的溶液 DNA鉴定时加入的试剂
甲 鸡血 蒸馏水 体积分数为95%的酒精溶液(25℃) 二苯胺
乙 菜花 蒸馏水 体积分数为95%的酒精溶液(冷却) 双缩脲试剂
丙 猪血 蒸馏水 体积分数为95%的酒精溶液(冷却) 二苯胺
丁 鸡血 蒸馏水 体积分数为95%的酒精溶液(冷却) 二苯胺
　　A．实验材料选择错误的组别是丙
B．沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁
C．甲组实验现象差的原因是25℃的酒精溶液对DNA的凝集效果差
D．乙组实验不成功仅因为在鉴定时加入了双缩脲试剂
解析：鸡血、菜花细胞中都含有DNA，而猪是哺乳动物，其成熟的红细胞中不含DNA，A项正确；甲、乙、丁的实验材料中都含有DNA，但乙为植物，将植物细胞放入蒸馏水中时，植物细胞不会吸水涨破，且DNA应该用二苯胺鉴定，而不能用双缩脲试剂鉴定，因此沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁，但因为25℃的酒精溶液对DNA的凝集效果差，所以甲组蓝色浅，B、C项正确，D项错误。
指点迷津·拨云见日
选择限制酶的方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。
知识贴士
不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
┃┃典例剖析__■
典例5　利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点分别如下图所示(已知这三种限制酶切割产生的黏性末端不同)。下列分析错误的是(　D　)
A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
解析：构建重组DNA时，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A项正确；分析图甲，HindⅢ的酶切位点在第二个EcoRⅠ的酶切位点的左侧，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B项正确；P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为链状DNA分子，因每条DNA单链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C项正确；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可正向连接或反向连接，不止能产生一种重组DNA，D项错误。
解疑答惑
?从社会中来 P70
提示：用到的“分子工具”：限制性内切核酸酶、DNA连接酶、载体。限制性内切核酸酶的特征：准确切割DNA分子，得到所需要的目的基因。DNA连接酶的特征：能将目的基因连接到载体上。载体的特征：能将目的基因导入受体细胞中。
?旁栏思考1 P71
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是其在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，限制酶就是一种防御性工具。当外源DNA入侵时，原核生物会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，从而保护自身的作用。
?旁栏思考2 P72
提示：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E．coliDNA连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到的，称为T4DNA连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯键(在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成)，那么，二者的差别主要表现如下：
(1)DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。
此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。
?思考·讨论 P73
1．提示：“剪刀”代表限制酶，“透明胶条”代表DNA连接酶。
2．提示：如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选择不对(也可能是其他原因)。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一定要具有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端；否则黏性末端不同，碱基就无法配对。
3．提示：不能。真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。
?探究·实践 P74
结果分析与评价
1．提示：观察提取的DNA颜色：如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
二苯胺法鉴定：二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新提取。
2．提示：本实验提取的DNA粗制品中有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3．提示：本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
进一步探究
提示：DNA纯化常用方法：将DNA黏稠物再溶解，继续用物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3min，使DNA充分溶解，以免损失。用3～4层纱布进行过滤(或离心)，滤去杂质，收集含有DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入50mL预冷的体积分数为95%的乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现DNA丝状物。
此外，还有许多其他方法。例如，添加质量分数为25%的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，使蛋白质变性后与DNA分开。随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24∶1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液。可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚处理后，离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白质变性存在于酚层中，这时可用分液漏斗或吸管等仪器将二者分开。
?练习与应用 P74
一、概念检测
1．C　提示：DNA连接酶的作用是连接两个DNA分子片段，既能连接黏性末端，也能连接平末端，形成磷酸二酯键。DNA聚合酶的作用是将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
2．A　提示：基因工程中使用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等。
二、拓展应用
1．提示：细菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA，是因为细菌在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
2．提示：(1)限制酶XbaⅠ。因为限制酶XbaⅠ切割B片段产生的黏性末端与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的黏性末端相同。
(2)识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
训练巩固·课堂达标
1．下列叙述符合基因工程概念的是(　B　)
A．在细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，赋予生物新的遗传特性
B．将人的干扰素基因与质粒重组后导入大肠杆菌，获得能产生人的干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后，其DNA整合到细菌DNA上
解析：基因工程又叫重组DNA技术，是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程不能在生物细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，A不符合基因工程的概念；将人的干扰素基因与质粒重组后导入大肠杆菌，获得能产生人的干扰素的菌株，B符合基因工程的概念；用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株，属于诱变育种，C不符合基因工程的概念；自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌，并将自身DNA整合到细菌DNA上，属于基因重组，D不符合基因工程的概念。
2．下列关于限制性内切核酸酶(限制酶)的叙述，正确的是(　C　)
A．均来源于原核生物
B．识别序列均由6个核苷酸组成
C．特异性表现在识别和切割两个方面
D．也可识别RNA分子的特定核苷酸序列
解析：限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A错误；大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，B错误；限制酶能识别特定的核苷酸序列，并切割特定核苷酸之间的磷酸二酯键，C正确；限制酶可识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，不能识别RNA分子的特定核苷酸序列，D错误。
3．下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是(　B　)
A．图①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精
B．图①和图③都需要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，便于DNA的析出并保持其结构完整
C．若图③操作后接图②操作，则DNA会留在滤液中
D．若图④操作后接图②操作，则DNA会留在纱布上
解析：DNA不溶于酒精，95%的冷酒精凝集效果最佳，所以图①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白质可溶于酒精，以便除去溶于酒精的杂质，提取含杂质较少(或较纯净)的DNA，A正确；图①玻璃棒沿逆时针方向搅拌，目的是提取出含杂质较少的DNA，图③玻璃棒沿逆时针方向搅拌，目的是加速细胞吸水破裂，B错误；图③操作是加入蒸馏水，破碎细胞，图②操作是过滤，获取含DNA的滤液，使DNA留在滤液中，C正确；图④操作是去除滤液中杂质，析出DNA，图②操作是过滤，将DNA留在纱布上，D正确。
4．(不定项)以下关于基因工程的操作工具，说法错误的是(　ABD　)
A．限制酶可以切割DNA和RNA
B．DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来
C．载体的作用是将目的基因导入受体细胞使之稳定存在并表达
D．切割质粒的限制酶均能特异性地识别6个核苷酸
解析：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割位点上切割DNA分子，A错误；DNA连接酶的作用是将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接起来，B错误；载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达，C正确；大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，D错误。第3节　基因工程的应用
新课程标准 核心素养
1．举例说出基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面的应用。2．认同基因工程的应用价值。3．关注基因工程的进展。 1．生命观念——举例说出植物基因工程、动物基因工程的成果及其给人类带来的影响。2．社会责任——用基因工程培育优良品种或细胞产品，造福人类。
知识导图
必备知识·夯实双基
一、基因工程在农牧业方面的应用
1．转基因抗虫植物
(1)技术方法：从某些生物中分离出具有__抗虫功能__的基因，将它导入作物中，培育出具有抗虫性的作物。
(2)实例：抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。
2．转基因抗病植物
(1)技术方法：将来源于__病毒、真菌等__的抗病基因导入植物中，培育出转基因抗病植物。
(2)实例：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。
3．转基因抗除草剂植物
(1)技术方法：将__降解或抵抗某种除草剂__的基因导入作物，可培育抗除草剂的作物品种。
(2)实例：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。
4．改良植物的品质
(1)技术方法：将__必需氨基酸含量多的蛋白质__编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。
(2)实例：转基因玉米中赖氨酸的含量比对照高30%。
5．提高动物的生长速率
(1)技术方法：将__外源生长激素__基因导入动物体内，提高动物的生长速率。
(2)实例：转基因鲤鱼。
6．改善畜产品的品质
(1)技术方法：将__肠乳糖酶__基因导入奶牛基因组。
(2)实例：乳汁中乳糖含量大大降低的转基因奶牛。
二、基因工程在医药卫生领域的应用
1．技术方法
(1)对微生物或动植物的细胞进行__基因改造__，使它们能够生产药物。
(2)利用乳腺生物反应器生产药物：将__药用蛋白__基因与乳腺中特异表达的基因的__启动子__等调控元件重组在一起，通过__显微注射__导入哺乳动物的受精卵中，培育出的转基因动物通过__分泌乳汁__生产所需要的药物。
(3)培育移植器官：在器官供体的基因组中导入某种__调节因子__抑制__抗原决定__基因的表达或设法除去__抗原决定__基因，然后再结合__克隆__技术，培育出不会引起__免疫排斥__反应的转基因克隆器官。
2．实例：重组人干扰素、促红细胞生成素、抗凝血酶、血清白蛋白等。
三、基因工程在食品工业方面的应用
1．技术方法：利用基因工程菌生产食品工业用__酶__、__氨基酸__和__维生素__等。例如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过__工业发酵__生产凝乳酶。
2．实例：淀粉酶、脂酶、天冬氨酸和苯丙氨酸。
┃┃学霸记忆__■
1．将来源于某些病毒、真菌的抗病基因导入植物中，培育转基因抗病植物。
2．将外源生长激素基因导入鲤鱼，可提高鲤鱼的生长速度。
3．将药用蛋白基因导入大肠杆菌或酵母菌构建工程菌可生产药物。
4．将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组成表达载体导入哺乳动物的受精卵中可构建乳腺生物反应器。
5．在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后结合克隆技术，可培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆器官。
┃┃活学巧练__■
1．农业害虫不会对转基因抗虫作物产生抗性。(×)
2．培育转基因抗病植物的目的基因主要来源于病毒、真菌。(√)
3．基因工程中，要培育转基因植物和动物，选用的受体细胞都是受精卵。(×)
4．利用工程菌可生产人的胰岛素等某些激素。(√)
5．乳腺反应器就是把药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。(×)
思考：
1．为了生产药物，常把药用蛋白基因构建的表达载体导入大肠杆菌或酵母菌细胞中构建工程菌，选用细菌或酵母菌作为受体细胞的优点有哪些？
提示：细菌和酵母菌繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对少，生产能力大等。
2．在研制膀胱生物反应器时，应使药用蛋白基因在什么细胞中特异表达？它与乳腺生物反应器有什么相同和不同点？
提示：应使药用蛋白基因在膀胱上皮细胞中特异表达。相同点是收集药用蛋白较容易，且不会对动物造成伤害。不同点是乳腺生物反应器必须是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。
课内探究·名师点睛
知识点?
植物基因工程的应用
1．植物基因工程的应用
项目 外源基因类型 成果举例
抗虫转基因植物 抗虫基因：Bt抗虫蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因 抗虫的棉花、水稻、玉米
抗病转基因植物 ①抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因②抗真菌基因：几丁质酶基因、抗毒素合成基因 抗病毒的烟草、小麦、番茄、甜椒
抗逆转基因植物 抗逆基因：调节细胞渗透压基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因 抗盐碱和抗干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂的大豆
改良品质的转基因植物 优良性状基因：提高必需氨基酸含量的蛋白质编码基因、控制番茄成熟的基因、与花青素代谢有关的基因 高赖氨酸玉米、耐储存番茄、新花色矮牵牛
2．转基因植物中的目的基因
(1)目的基因都是来自其他生物的能表现出优良性状的外源基因，并不都是来自细菌、病毒等微生物，如抗冻蛋白基因来自鱼类。
(2)有的目的基因通过控制蛋白质的合成，直接控制生物的某些性状，这反映了基因与性状的直接关系；有的目的基因通过控制酶的合成来控制代谢，进而控制生物的性状，这体现的是基因和性状的间接关系。
(3)注意“抗虫”和“抗病”的区别，二者可以分别通过害虫接种和病毒(或真菌等)接种来进行个体水平的检测。
┃┃典例剖析__■
典例1　目前人类利用基因工程的方法成功培育出转基因抗虫棉，下列说法正确的是(　C　)
A．苏云金芽孢杆菌的Bt抗虫蛋白基因与质粒结合后直接进入棉花的叶肉细胞表达
B．抗虫基因导入棉花叶肉细胞后，可通过传粉、受精的方法，使抗虫性状稳定遗传下去
C．标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因
D．连续种植转基因抗虫棉不会改变棉铃虫的抗性
解析：重组质粒形成后需要通过农杆菌转化法等方法导入棉花的叶肉细胞；如果抗虫基因导入棉花叶肉细胞的细胞质中，转基因棉花的花粉中不含该基因，如果导入细胞核基因中，该转基因植株相当于杂合子，后代会发生性状分离；抗虫棉的选择作用使具有抗性突变的棉铃虫生存下来，经过长时间积累，棉铃虫的抗性会增强。
┃┃变式训练__■
1．北极比目鱼中有抗冻基因，该基因编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，下列有关叙述正确的是(　D　)
A．过程①是获取抗冻基因的过程，用到的酶只有限制酶
B．在重组质粒上，抗冻基因首端和末端一定具有启动子和终止子，启动和终止翻译的进程
C．过程②用到的质粒是农杆菌的Ti质粒，将重组质粒转入农杆菌的目的是筛选重组质粒
D．根据抗冻基因制作的DNA探针，可以用来检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在
解析：据题图可知，该转基因技术操作中，获取目的基因的方法是利用抗冻基因(目的基因)的mRNA逆转录合成cDNA，进而获取目的基因，需要的酶有逆转录酶和限制酶等，A项错误；目的基因首端和末端的启动子和终止子均是DNA片段，分别启动和终止转录的进程，B项错误；重组质粒转入农杆菌的目的是通过农杆菌转化法将目的基因导入番茄细胞中，C项错误；检测目的基因是否导入受体细胞、通常是用目的基因制作DNA探针进行检测，D项正确。
知识点?
动物基因工程的应用
项目 外源基因类型 成果举例
提高生长速率的转基因动物 外源生长激素基因 转基因绵羊、鲤鱼
改善畜产品品质的转基因动物 肠乳糖酶基因 乳汁中含乳糖较少的转基因牛
生产药物的转基因动物 药用蛋白基因＋乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件 乳腺生物反应器
作器官移植供体的转基因动物 外源的抑制抗原决定基因表达的调节因子或除去供体的抗原决定基因 无免疫排斥的转基因猪
┃┃典例剖析__■
典例2　转基因技术可以改良动物品种，生产人类需要的药用蛋白。下列符合生产药用蛋白的是(　D　)
A．养殖含生长激素基因鲑鱼
B．养殖能抗口蹄疫病毒的转基因兔
C．养殖含乳糖酶基因的转基因牛
D．从牛乳汁中获得人血清白蛋白
解析：养殖含生长激素基因的转基因鲑鱼只能获得生长更快的鲑鱼，A错误；养殖能抗口蹄疫病毒的转基因兔，只能获得具有能抗口蹄疫病毒能力的兔，B错误；养殖含乳糖酶基因的转基因牛，只能使牛乳汁中乳糖含量降低，C错误；从牛乳汁中获得人血清白蛋白，血清白蛋白可用于治疗失血性休克、脑水肿、肾病等，D正确。
┃┃变式训练__■
2．下列关于用转基因动物作器官移植供体的研究的叙述，不正确的是(　C　)
A．器官短缺和免疫排斥是目前制约人体器官移植的两大难题
B．猪的内脏构造、大小和血管分布与人的极为相似
C．灵长类动物体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒少于猪
D．无论以哪种动物作为供体，都需要在其基因组中导入某种调节因子以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因
解析：目前，人体移植器官短缺是一个世界性难题。要实现器官移植最大的难题是免疫排斥，A项正确。猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似，而且与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒要少得多，B项正确，C项错误。目前，科学家正尝试利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，D项正确。
指点迷津·拨云见日
乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较
名称 乳腺生物反应器 工程菌
含义 是指使外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系
基因结构 动物基因的结构与人类基因的结构基本相同 细菌和酵母菌等生物基因的结构与人类基因的结构有较大差异
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，产生的药物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物的受精卵 微生物细胞
导入目的基因的方式 显微注射法 感受态细胞法(Ca2＋处理法)
生产条件 不需严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞中提取
┃┃典例剖析__■
典例3　下列有关利用乳腺生物反应器与微生物生产药物的叙述，错误的是(　D　)
A．前者在乳汁中提取药物，后者在细胞中提取
B．两者都是基因工程在医药卫生领域的应用
C．前者合成的蛋白质可加工成熟，后者合成的蛋白质一般不能加工成熟
D．动物和微生物的基因结构与人体的基因结构均相同
解析：前者在乳汁中提取药物，后者在细胞中提取；乳腺生物反应器和微生物生产药物都是基因工程在医药卫生领域的应用；前者合成的蛋白质可加工成熟，工程菌一般是原核生物，合成的蛋白质一般不能加工成熟；真核生物基因的编码区有内含子和外显子之分，原核生物基因的编码区无内含子与外显子。
解疑答惑
?从社会中来 P87
提示：在农牧业方面生产转基因抗虫植物、转基因抗病植物、转基因抗除草剂植物、改良植物的品质、提高动物的生长速率、改善畜产品的品质。在医药卫生领域，除生产胰岛素外，还生产干扰素、抗凝血酶等药物。在食品工业方面，生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
?异想天开 P91
提示：可能会遭到他人歧视。这就需要人们调整自己的观念，适应科技、社会的发展、进步。(开放性问题，答案合理即可)
?到社会中来 P92
1．提示：截至2019年年底，我国批准发放过转基因耐储藏番茄、转基因抗虫棉、改变花色的转基因矮牵牛、转基因抗病辣椒、转基因抗病番木瓜、转基因抗虫水稻、转植酸酶基因玉米以及转基因耐除草剂大豆的生产应用安全证书；批准了转基因棉花、大豆、玉米、油菜、甜菜和番木瓜的进口安全证书，但我国进口的基本上是转基因棉花的纤维，其他进口转基因作物的用途仅限于用作加工原料；我国没有批准任何一种转基因粮食作物种子进口到我国境内商业化种植。
2．提示：根据实际情况回答。
?练习与应用 P92
一、概念检测
1．C　提示：生长激素基因在转录时需要RNA聚合酶，不需要解旋酶和DNA连接酶，A项错误；发酵产生的生长激素属于大肠杆菌的次生代谢物，B项错误；通过基因工程技术可以将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，并且能稳定的遗传，C项正确；大肠杆菌质粒标记基因中嘌呤与嘧啶含量相等，并且质粒为DNA，DNA中不含尿嘧啶，D项错误。
2．A　提示：用人工诱变获得青霉菌突变菌株大量生产青霉素，不属于基因工程的应用。
二、拓展应用
1．提示：(1)①限制酶、DNA连接酶　③矮牵牛　④转基因矮牵牛对草甘膦产生了一定的抗性。
(2)①对照组为非转基因矮牵牛。②理论上增加转入的外源EPSP合酶基因的数量，矮牵牛体内EPSP合酶的表达水平会升高，它对草甘膦的抗性会增强。思路：将不同拷贝数的EPSP合酶基因分别转入矮牵牛细胞中，培育转基因植株，比较它们对草甘膦抗性的差异。
2．提示：开放性题目，自由想象！例如，基因工程目前来说是对基因片段进行剪接和采取，但是也已经能够在一定程度上改变生物的基本性状。科学家们认为，在未来只要我们能够突破微观层面的操作，就能够对人类的基因从具体的氨基酸状态进行重组。如果真的做到这样，那么人类可就了不起了，因为我们能够再一次选择我们的基本状态。例如，我们可能并不是一个漂亮的人，但是可以通过基因技术进行重组再造。通过对特定基因的选择，可以决定人的性状突变，也就是说，未来完全可以做到人人都是俊男美女。只要掌握了基因工程技术，这一切都不是问题。
训练巩固·课堂达标
1.1987年，美国科学家将萤火虫的荧光素基因转入烟草植物细胞并获得高水平的表达。长成的烟草植株通体光亮，堪称自然界的奇迹。这一研究成果表明(　D　)
①萤火虫与烟草的DNA结构基本相同
②萤火虫与烟草共用一套遗传密码
③烟草体内合成了荧光素
④萤火虫和烟草合成蛋白质的方式基本相同
A．①③　 B．②③
C．①④　 D．①②③④
解析：萤火虫与烟草的遗传物质都是双链DNA，这是完成基因重组的基础，①正确；自然界的所有生物几乎都共用一套遗传密码，即无论在高等生物还是低等生物中，相同的密码子决定的氨基酸种类都相同，②正确；萤火虫的荧光素基因导入烟草细胞使得该植株通体光亮，可见荧光素基因在该植株中成功表达，③正确；基因的表达包括转录和翻译，最后合成出蛋白质，④正确。
2．科学家在牛的乳房生物反应器中获得了人的血清白蛋白，下列相关叙述不正确的是(　B　)
A．获得的人血清白蛋白具有生物活性
B．应当以牛的乳腺细胞作为受体细胞
C．可用显微注射法将目的基因导入受体细胞
D．受体细胞的性染色体组成是XX
解析：科学家在牛的乳房生物反应器中获得了人的血清白蛋白，说明牛体内含有人的血清白蛋白基因，合成的人血清白蛋白具有生物活性，A项正确；应当以牛的受精卵作为受体细胞，B项错误；采用显微注射法将目的基因导入动物受体细胞，C项正确；受体细胞应选择雌性受精卵，故其性染色体组成是XX，D项正确。
3．普通番茄细胞中含有PG基因，其能控制合成多聚半乳糖醛酸酶(简称PG)，PG能破坏细胞壁使番茄软化不耐贮藏。科学家将抗PG基因导入番茄细胞，培育出了抗软化、保鲜时间长的转基因番茄。下图表示抗PG基因的作用原理，回答下列问题：
(1)据图回答该转基因番茄具有抗软化、保鲜时间长的原理是__抗PG基因能阻止PG基因表达的翻译过程，使细胞不能合成PG__。
(2)为培育抗软化番茄，应采用__PCR__技术将抗PG基因进行体外扩增。在该技术的反应体系中除模板、引物、原料外，还需要加入__热稳定DNA聚合酶(Taq酶)__，这个基因的表达需要__启动子、终止子__等不可缺少的调控元件。
(3)将抗PG基因插入Ti质粒的__T－DNA__上构建基因表达载体，通过农杆菌转化法将抗PG基因导入番茄细胞，为检验抗PG基因是否成功导入，在个体生物学水平上应检测__转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短__。
(4)为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，应将抗PG基因导入__细胞质__(填“细胞核”或“细胞质”)。
解析：(1)据题图可知，抗PG基因转录成的mRNA能够与PG基因转录成的mRNA结合，阻止了PG基因表达的翻译过程，使细胞不能合成PG，不能破坏细胞壁而使转基因番茄抗软化且保鲜时间延长。(2)采用PCR技术将抗PG基因进行体外扩增；PCR过程所需要的条件有：模板(抗PG基因)、引物、原料(4种游离的脱氧核糖核苷酸)、热稳定DNA聚合酶；启动子和终止子是基因表达不可缺少的调控元件。(3)将抗PG基因插入Ti质粒的T－DNA上构建基因表达载体，通过农杆菌转化法将抗PG基因导入番茄细胞，为检验抗PG基因是否成功导入，在个体生物学水平上应检测转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短。(4)花粉中的雄配子几乎不含质基因，所以为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，应将抗PG基因导入细胞质。

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