资源简介

(共37张PPT)
二、基因表达载体的构建（核心工作）
获得了足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？
不能，因为目的基因很难在受体细胞中稳定存在。
1.基因表达载体的作用
①使目的基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代
②使目的基因在受体细胞中能够表达和发挥作用
2.基因表达载体的组成
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
便于重组DNA的筛选
DNA聚合酶结合位点
保证目的基因能在受体细胞中自我复制
供目的基因插入载体中
2.基因表达载体的组成
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。
启动子和终止子都是有特殊序列结构的DNA片段
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
诱导型启动子
激活或抑制目的基因表达
2.基因表达载体的组成
启动子与终止子分别位于目的基因的首尾端，
作用：起始和终止转录过程。
起始密码子与终止密码子分别位于mRNA分子的首尾端，
作用：起始和终止翻译过程。
2.基因表达载体的组成
区别启动子、终止子、起始密码子、终止密码子
3.基因表达载体的构建过程
限制酶
限制酶
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
DNA
连接酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
限制酶切割位点
质粒
重组
DNA分子
3.基因表达载体的构建过程
限制酶
限制酶
DNA
连接酶
质粒
重组
DNA分子
第1步：
用同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段。
第2步：
用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。
拓展：“单酶切”与“双酶切”构建基因表达载体
用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段
构建基因表达载体
1.单酶切
a
b
c
d
a、b、c、d四个黏性末端相同。
限制酶切割
DNA连接酶连接
启动子
方向
目的基因转录方向
思考：单酶切有什么缺点？
单酶切有什么缺点？
缺点1：
在DNA连接酶的作用下，质粒被重新环化
a
b
c
d
限制酶切割
DNA连接酶连接
DNA连接酶连接
单酶切有什么缺点？
缺点2：
在DNA连接酶的作用，
目的基因被环化。
a
b
c
d
限制酶切割
DNA连接酶连接
DNA连接酶连接
单酶切有什么缺点？
缺点3：
在DNA连接酶的作用，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。
a
b
c
d
限制酶切割
DNA连接酶连接
反向连接重组DNA
a
b
c
d
限制酶切割
DNA连接酶连接
缺点1
缺点2
缺点3
思考：如何克服以上缺点？
单酶切的缺点
反向连接重组DNA
质粒重新环化
目的基因被环化
2.双酶切
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段
构建基因表达载体
限制酶a切割
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
DNA连接酶连接
a
b
c
d
黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。
2.双酶切
限制酶a切割
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
DNA连接酶连接
a
b
c
d
质粒不会重新环化
目的基因
不会被环化
优点1
优点2
优点3
目的基因与质粒
不会发生反向连接
1.构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
2.选择哪些限制酶切割质粒和含目的基因的DNA片段
使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、含目的基因的DNA片段。
1.区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子：启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
2.图解限制酶的选择原则
核心归纳
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
基因表达载体
受体细胞
导入
转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
动物
植物
原核生物
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
方法1
花粉管通道法
我国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞。
用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
花粉管通道法
子房注射
花柱滴加
在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
方法2
农杆菌转化法(常用)
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
①农杆菌
农杆菌细胞内含Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA
(可转移的DNA) 转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的DNA上。
Ti质粒
T-DNA
农杆菌
Ti质粒
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
植物细胞
导入植物细胞
表现出新性状的植物
将目的基因插入染色体DNA中
农杆菌转化法
②农杆菌转化法原理
__________插入Ti质粒的________中形成重组Ti质粒
重组Ti质粒转入__________
导入植物细胞
目的基因插入植物细胞的________________中
目的基因在植物细胞中稳定存在并__________
表达
目的基因
T-DNA
农杆菌
染色体DNA
农杆菌转化法
两次拼接、两次导入
①两次拼接
第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
一
二
农杆菌转化法
两次拼接、两次导入
②两次导入
第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)：将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
一
二
不同的受体植物，转化的具体方法有区别：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片__________________，然后________________，并_____________；
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
b.可以将_______直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
2.将目的基因导入动物细胞
①导入动物细胞通常选择受精卵
②导入方法：
受精卵
注射器
固定吸管
显微注射仪
显微注射法
3.将目的基因导入原核生物细胞
导入方法
Ca2+处理
大肠杆菌细胞
细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态
将重组的基因表达载体导入
原核生物作为受体细胞的优点：
繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作
胰腺
提取筛选
胰岛素mRNA
胰岛素cDNA
逆转录
重组
质粒
质粒
导入
大肠杆菌
mRNA
胰岛素原
胰岛素
加工
用原核生物生产胰岛素示意图
三、将目的基因导入受体细胞
受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
原核细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
常用
四、目的基因的检测与鉴定
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上
是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
筛选和获取目的基因
获取质粒、噬菌体等载体
构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
基因工程的基本操作流程图
筛选和获取目的基因
1.利用PCR获取和扩增目的基因
2.人工合成目的基因
3.通过构建基因文库获取目的基因
第一步：目的基因的筛选与获取
构建基因表达载体
1.用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段
2.用DNA连接酶连接
第二步：基因表达载体的构建
基因表达载体的构建方法不完全相同
目的基因、标记基因、启动子、终止子
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
1.导入植物细胞：花粉管通道法；农杆菌转化法
2.导入动物细胞：显微注射法
3.导入原核细胞：用Ca2+处理受体细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞的方法也不完全相同
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
1.分子水平检测
①检测目的基因是否导入（PCR等技术检测）
②检测目的基因是否转录（PCR等技术检测）
③检测目的基因是否翻译（抗原-抗体检测）
2.个体水平检测
第四步：目的基因的检测与鉴定
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
总结：
目的基因的筛选和获取
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
构建基因表达载体
将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物);
目的基因的检测与鉴定
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。

展开更多......

收起↑