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(共42张PPT)
第36讲 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题
第十二单元 生物技术与工程
课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具
2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测、鉴定等步骤
3.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质
4.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用而改善了人类的生活品质
课标要求 5.举例说出日常生活中的转基因产品，探讨转基因技术在应用过程中带来的影响
6.举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题，分析说明我国为什么不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
7.举例说明历史上生物武器对人类造成了严重的威胁与伤害，认同我国反对生物武器及其技术和设备的扩散
常用方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法:
花粉管通道法:
——显微注射法:
——Ca2+处理法:
【注意】将目的基因导入受体细胞，导入的是含目的基因的重组DNA分子, 而不是直接导入目的基因。
导入受精卵
导入体细胞或受精卵
导入受精卵
导入原核细胞
3.将目的基因导入受体细胞
(1)农杆菌转化法的过程:
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现出新性状的植物
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
植物组织培养
【小结】目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到植物细胞的DNA中→表达
构建基因表达载体
Ti质粒
目的基因
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入植物细胞染色体DNA中
植物细胞
植物组织培养
表现出新性状的植株
⑤农杆菌转化法流程图
该过程经过___次拼接、_____次导入
①第一次拼接
_______________________________________
②第二次拼接
_______________________________________
_______________________________________
③第一次导入
_______________________________________
④第二次导入
_______________________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上(非人工操作)
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞(非人工操作)
(见大本表格)
(2)将目的基因导入动物细胞
—— 显微注射法
受体细胞:
受精卵
(因为受精卵容易表现出全能性)
(3)将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法a.受体细胞:常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛b.原核生物的优点:繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。c.一般过程:Ca2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态将重组的基因表达载体导入其中Ca2+的作用:使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(订正)这种细胞称为感受态细胞【思考】当真核生物的基因(如胰岛素基因)导入原核生物为受体细胞时:
1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？
2.以上情况如何解决？
3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？
4.以上情况如何解决？
真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白。
使用cDNA作为目的基因
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工
人工体外再加工
或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
【拓展】利用转基因大肠杆菌生产胰岛素(看懂图)
【思考】标记基因筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？
不一定，导入的还可能是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，因此仅凭标记基因有无，无法完全确定转基因生物是否培育成功。
4.目的基因的检测与鉴定
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；
①目的:
②检测内容及方法:
【思考1】怎样检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因？
方法: PCR技术
①若有扩增产物，表明转入目的基因
②若没有，表明没有成功转入目的基因
结果与结论:
具体操作方法: 提取转基因生物细胞中所有的DNA, 根据目的基因特点设计特定引物，进行PCR，看是否扩增出目的基因。
【思考2】怎样检测目的基因是否转录出mRNA
具体操作方法: 提取转基因生物细胞中所有的mRNA, 逆转录成cDNA, 根据目的基因特点设计特定引物，进行PCR，看是否扩增出目的基因的cDNA。
①若有扩增产物，表明转录出mRNA
②若没有，表明没有转录出mRNA
结果与结论:
方法: PCR技术
【思考3】怎样检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原-抗体杂交。
①若有杂交带出现，表明目的基因已翻译;
②若没有杂交带出现，表明目的基因没有翻译。
结果与结论:
具体操作方法: 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。
4.目的基因的检测与鉴定
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；
①目的:
②检测内容及方法:
个体检测的目的: 检测是否具有抗性及抗性程度。
注意对照原则: 对照组为非转基因植物;
实验组为转基因植物, 其他条件一致。
【检测】利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是( )
A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和
引物b扩增的结果
B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互
　补的碱基
C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却
　至50 ℃左右
D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变
　产物AD
D
②过程是子链延伸的过程，该过程需要利用AB上链和CD下链之间的互补配对来实现子链的延伸过程。
【检测】(2022·山东高三联考) 戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗的过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是( )
A.过程①需要的酶是RNA聚合酶，
原料是A、U、G、C
B.重组基因表达载体上的启动子
需来源于戊型肝炎病毒
C.过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中
　DNA分子的生理状态
D.过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
D
逆转录酶，
原料是四种脱氧核苷酸
大肠杆菌细胞的启动子
Ca2＋处理法
考点三 DNA的粗提取与鉴定
1. 实验原理
①原理: 利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在　 　　　　　　方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的性质: DNA不溶于　 　，但某些蛋白质溶于　 　；DNA能溶于2 mol·L－1的　 　　　　。
③DNA的鉴定: 在一定温度下，DNA遇　 　　试剂会呈现 。
物理和化学性质
酒精
酒精
NaCl溶液
二苯胺
蓝色
2. 实验步骤
DNA
95%
NaCl
①使用纱布过滤而不用滤纸过滤的目的是:
DNA会吸附在滤纸上, 用纱布可减少DNA的损失。
②低温放置几分钟的作用:
a.低温抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
b.抑制DNA分子运动，使DNA易形成析出；
④搅拌时应轻缓、并沿一个方向的目的:
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
③预冷的酒精溶液:
析出DNA
【检测】下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述正确的是( )
A.将研磨液加入切碎的洋葱，
充分研磨后过滤，要弃去上清液
B.图2所示实验操作中有一处明
　显错误，可能导致试管2中蓝
　色变化不明显
C.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色
B
要弃去沉淀物，收集上清液
试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分
NaCl溶液遇二苯胺试剂不会出现蓝色,而DNA遇二苯胺试剂出现蓝色
DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精
考点四 DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验基础
①PCR原理:利用了　　　　　　　原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳: DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷　 　的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过 来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的　 　　 　　等有关。
DNA的热变性
相反
大小和构象
琼脂糖凝胶电泳
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为300nm的_______下被检测出来。
染色
紫外灯
在碱性缓冲溶液中,DNA分子带负电,电泳时DNA从负极向正极迁移。
电源
+
电泳槽
琼脂糖凝胶
样品孔
缓冲液
—
大DNA片段
小DNA片段
Marker
样品1
样品2
2. DNA片段的扩增的实验步骤:
微量移液器
微量离心管
离心机
反应液
琼脂糖
核酸染料
加样孔
3.DNA片段电泳鉴定实验步骤:
核酸染料与凝胶中核酸结合，以便在紫外光下显示核酸条带
①加核酸染料的目的:
电泳缓冲液
加样孔
指示分子大小的标准参照物
①凝胶载样缓冲液中指示剂的作用:
可以作为电泳进度的指示分子, 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色调带)，则停止电泳。
电泳缓冲液
加样孔
指示分子大小的标准参照物
提示剂
紫外灯
注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行　　 　　处理。
(2)每吸取一种试剂后，移液器上的　 　都必须更换。
(3)电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越　 ，迁移速率越　 ，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越　 ，迁移速率越　 。
(4)该实验所需材料可以直接从公司购买,缓冲液和酶应分装成小份,并在 储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出, 放在冰块上
融化。
高压灭菌
枪头
大
慢
小
快
20℃
缓慢
（因为速溶会破坏缓冲液成分）
【思考1】如果未出现条带，可能原因是什么？
【思考2】如果出现不止一条条带，可能原因是什么？
漏加了PCR反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等
①引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或引物间容易聚合形成二聚体；
②复性温度过低；
③DNA聚合酶质量不好等；
(2)以病毒甲的H基因为模板，设计上游引物H1和下游引物H2，用一步法RT－PCR对目的基因进行扩增。PCR反应体系如下:
防止RNA酶降解病毒RNA，便于提取到完整的病毒H基因
【检测】对RNA病毒来讲，基因就是具有遗传效应的RNA片段。PCR技术可用于病毒基因检测，具有敏感性高、特异性强的特点。一步法RT－PCR是通过逆转录将RNA扩增得到大量DNA片段的技术。回答下列问题:
(1)提取RNA病毒甲的H基因时，提取液中需要加入盐酸胍以抑制RNA酶的活性，加入盐酸胍的目的是_________________________。
H基因 2.5μL
缓冲液等 5μL
4种脱氧核苷酸 0.5μL
上游引物H1 1μL
下游引物H2 1μL
①酶 1μL
双蒸H2O 14μL
上表中的①酶包括____________________________________。
在PCR仪上依次设置不同的循环温度参数: 45℃—45min，94℃—30s、55℃—45s、72℃—60s，多轮循环。其中处理72℃和45℃处理的目的分别是__________________________和
___________________________________________________。
逆转录酶和耐热的DNA聚合酶
使病毒H基因的RNA逆转录得到DNA片段
H基因的DNA片段子链延伸
(3)将一步法RT－PCR扩增后的产物进行电泳处理，结果如图所示。其中可能感染病毒甲的样品是____________________。
(4)一步法RT－PCR技术也可用于基因工程目的基因的检测与鉴定。该技术主要用于检测__________________________________。
2、3、4
目的基因是否转录出mRNA
考点五 基因工程的应用
抗虫功
能的基因
抗
病基因
降解或抵抗
1.基因工程在农牧业方面的应用
蛋白质编
码基因
花青素代谢相关的基因
外源生长激素基因
乳糖酶基因
乳汁
2.基因工程在医药卫生领域的应用
基因改造
显
微注射
抗原决定基因
克隆
免疫排斥
让转基因哺乳动物批量生产药物
①实例:
乳腺生物反应器或乳房生物反应器
②培育过程:
药用蛋白基因
乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件
基因表达载体
显微注射
受精卵
泌乳期分泌乳汁
转基因动物
药物
发育
③乳腺生物反应器的优点:
(1)产量高，产品可随乳汁分而排出体外。
(2)质量好，乳腺组织不仅具有按照遗传信息流向合成蛋白质的能量，而且具备全面的修饰和加工蛋白质的能力，如糖基化、羧化、磷酸化以及分子组装等，微生物和植物都不具备这种全面蛋白质后加工能力。
(3)成本低。
(4)从乳汁中易提取产品，操作比较简单。
让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达。
几乎所有细胞。
【思考1】为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？
【思考2】药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？
【思考3】研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？
将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组。
【思考4】膀胱生物反应器的优点:
①可以从动物一出生就可收集产物，不论动物的性别和是否正处于生殖期。
②从尿液中提取蛋白质比从乳汁中提取更简便、高效。
工程菌
牛凝乳酶的基因
基因
工程菌
3.基因工程在食品工业方面的应用
比较项目 乳腺(房)生物反应器 基因工程菌生产药物
基因结构
基因产物
受体细胞
导入方式
生产条件
产物提取
哺乳动物基因的结构与
人类基因的结构基本相同
细菌等生物的基因结构与人类基因结构有较大差异
与天然蛋白质完全相同
细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性
哺乳动物的受精卵
微生物细胞
显微注射法
Ca2+处理法
不需要严格的灭菌，温度等外界条件对其影响不大
需严格灭菌,严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
从动物乳汁中提取, 相对简单
(一般经过工业发酵后)从微生物细胞(或发酵液)中提取, 相对复杂
拓展比较
【检测】下列有关基因工程及其应用的相关叙述，不正确的是( )
A.基因工程育种能够定向改造生物性状
B.DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
C.可利用转基因细菌降解有毒有害的化合物
D.能够使植物体表达动物蛋白的育种方法是基因工程育种
B
双链DNA片段间

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