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【备考2024】一轮新人教版生物学学案
第十单元　生物技术与工程
第2讲　微生物的培养技术及应用
考点1　微生物的基本培养技术
一、培养基的配制
1．概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2．营养组成
(1)一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等。
(2)需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加维生素
霉菌 一般将培养基调至酸性
细菌 一般将培养基调至中性或弱碱性
厌氧微生物 提供无氧的条件
3．种类
(1)按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。
(2)按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。
二、无菌技术
1．概念：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
2．关键：防止杂菌污染。
3．目的：获得纯净的微生物培养物。
4．消毒与灭菌的比较
比较项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理、化学或生物等方法 仅杀死物体表面或内部一部分微生物　　 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体
化学药物消毒法 操作空间、操作者的衣物和手等
紫外线消毒法 接种室、接种箱或超净工作台
灭菌 强烈的理化方法　　 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子　　 湿热灭菌法 培养基、容器等
干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具等
灼烧灭菌法 接种工具等
5．其他操作
(1)做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
(2)为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
6．实例——酵母菌的纯培养
1．无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？(选择性必修3　P10“旁栏思考”)
提示：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
2．操作时，接种环通过灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是什么？(选择性必修3　P13“文字信息”)
提示：将聚集的菌体逐步稀释以便获得不连续的单个菌落。
3．在接种酵母菌的培养基上，若观察到了不同形态的菌落，则分析可能是由哪些原因引起的？(选择性必修3　P13“探究·实践”)
提示：若观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或无菌操作不规范等原因引起的。
4．日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？(选择性必修3　P14“概念检测”)
提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的含水量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温储存通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
1．在培养细菌时，要将培养基调至中性或弱酸性。 (×)
提示：在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性。
2．蛋白胨中含有糖、维生素和有机氮等营养物质。 (√)
3．玻璃器皿、金属用具等可以采用干热灭菌。 (√)
4．微生物的纯培养步骤为配制培养基→接种→灭菌→分离和培养等。 (×)
提示：微生物的纯培养步骤为配制培养基→灭菌→接种→分离和培养等。
5．待灭菌后的培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。 (√)
6．微生物的纯培养物指的是未被杂菌污染的微生物。 (√)
7．酵母菌纯培养的马铃薯葡萄糖培养基上的葡萄糖也可用蔗糖代替。 (√)
1．倒平板操作中，平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是______________
_____________________________________________________________________。
提示：防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上(污染培养基和破坏菌落)和防止培养基水分过快蒸发
2．纯培养时，须使用固体培养基，原因是________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：固体培养基上细菌分裂产生的子代个体不易分散，从而形成菌落
1．培养物、纯培养物、纯培养辨析
培养物 接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体
纯培养物 由单一个体繁殖所获得的微生物群体
纯培养 获得纯培养物的过程
2．平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环，待其冷却后才能蘸取菌液，以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一次的划线不要与第一次的划线相连。
(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如表：
第一次操作 每次划线之前 划线结束
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
1．某同学为探究已纯化的菌株能否分解纤维素，他将此菌株接种在纤维素分解菌选择培养基上，一段时间后，培养基上出现了菌落，该同学认为此菌株能分解纤维素，但其他的同学并不认同他的观点，你认为他们的理由是什么？
提示：实验缺少空白对照；操作不规范。
2．某同学在利用稀释涂布平板法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？为了防止杂菌污染，有同学建议加入抗生素，你觉得可以吗？并说明理由。
提示：最可能的原因是菌液浓度过高(土壤溶液稀释不够)。不可以，因为抗生素不但能杀灭杂菌，而且也可以杀灭目的菌，因此在培养基上不可以加入抗生素。
考查无菌技术
1．(2022·湖北选择性考试)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(　　)
A．动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B．微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
D　[动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养不能加入抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。]
2．(2022·江苏扬州模拟)根据相关规定，每毫升合格的牛奶中细菌总数不超过50 000个。某兴趣小组利用恒温水浴锅对新鲜牛奶进行消毒后，进行细菌总数测定，主要步骤如图所示。相关叙述不正确的是(　　)
A．步骤①中用巴氏消毒法对新鲜牛奶进行消毒，可以减少营养物质的损失
B．步骤②对牛奶进行梯度稀释可以使聚集的微生物分散，便于在培养基表面形成单菌落
C．步骤③中牛肉膏蛋白胨培养基要先高压蒸汽灭菌再调pH，以防止高温影响pH的稳定
D．实验结束时培养基上的菌落可能不止一种，若平均菌落总数少于50个则表明消毒合格
C　[80 ℃、30 s～1 min处理新鲜牛奶属于巴氏消毒法，采用短时高温处理的目的是尽量减少牛奶中营养物质的损失，A正确；步骤②将牛奶进行梯度稀释的目的是使聚集在一起的微生物分散，便于能在培养基表面形成单个菌落，B正确；牛肉膏蛋白胨培养基配制时应先调pH再灭菌，C错误；由于生牛奶中的微生物可能不止一种，而牛肉膏蛋白胨培养基属于天然培养基，细菌、真菌等均可生长，因此，在实验中，培养基上可能不止出现一种菌落，依据样品液稀释了1 000倍，接种液体积为1 mL，计算推测若平均菌落总数少于50个，则表明消毒后每毫升牛奶中细菌总数不超过50 000个，消毒合格，D正确。]
考查微生物的纯培养技术
3．(2022·山东菏泽二模)野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，如图为纯化某氨基酸营养缺陷型大肠杆菌突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，A、B、C表示操作步骤，D、E为菌落。下列叙述正确的是(　　)
A．图中①②④为基本培养基，③为完全培养基
B．A操作可提高基因突变和染色体变异的突变率，增加突变株的数量
C．B操作可用涂布器蘸取菌液均匀地涂布在②表面
D．经C过程原位影印及培养后，可从④中挑取D进行纯化培养
D　[野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，读图可知，图中①②④为完全培养基，③为基本培养基，A错误；大肠杆菌没有染色体，紫外线可以提高基因突变的频率，B错误；B操作是将菌液滴加到培养基表面，再用涂布器将菌液均匀的涂布在②表面，C错误；从图中可看出，D在基本培养基中无法生长，在完全培养基中可生长，说明D是氨基酸缺陷型菌落，故经C过程影印及培养后，可从④培养基中挑取D菌落进行纯化培养，D正确。]
4．(2022·广东佛山二模)广东特产陈皮具有理气健脾、燥湿化痰之功，其所含黄酮类物质起重要作用，而黑曲霉(一种无害霉菌)可以引起其含量的变化。为了研究黑曲霉对不同年份陈皮黄酮类成分的影响，某研究小组从江门市新会区收集一批陈皮样品进行实验。回答下列问题：
(1)对于前期培养的黑曲霉，可利用__________________法得到单菌落，并通过显微镜检测鉴定，获得纯的目标菌种，收集它的孢子制备悬浮液。
(2)分别称取8克陈化2年、6年、10年的陈皮样品粉末平铺于培养皿，用紫外线对样品进行正反面照射各30 min。用紫外线照射样本的目的是____________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)将经紫外线照射过的每种年份的陈皮样品都分为两组，一组各加入1 mL无菌水，分别标记为XH2 0、XH6 0、XH10 0，另一组各加入__________________，不同年份的样品分别标记为XH2、XH6、XH10，陈皮为黑曲霉的生长提供____________________等营养成分。置于恒温恒湿条件下培养一段时间后，取不同接种天数的样品检测黄酮类成分的含量，实验结果如表所示。据表分析，实验结果表明：____________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
编号 第5天 第7天 第9天 第11天 第13天
XH2 8.32 8.77 9.74 13.11 14.33
XH2 0 7.42 7.39 7.36 7.68 7.98
XH6 8.72 9.73 9.91 10.93 10.82
XH6 0 8.33 8.82 8.63 8.82 9.15
XH10 9.24 10.95 12.48 14.26 12.61
XH10 0 10.27 9.84 9.35 9.51 9.54
[解析]　(1)稀释涂布平板法和平板划线法均可获得单菌落，据此，对于前期培养的黑曲霉，为获得单菌落，可利用稀释涂布平板法或平板划线法获得，并通过显微镜检测鉴定菌落特征，获得纯的目标菌种，收集它的孢子制备悬浮液。(2)用紫外线照射样本的目的是消毒，杀灭陈皮样品中的细菌(微生物)进而保证实验用的材料上的菌种均来自我们的接种物。(3)为保证等量原则，另一组各加入1 mL黑曲霉孢子悬浮液，不同年份的样品分别标记为XH2、XH6、XH10。陈皮中含有有机物，能为黑曲霉的生长提供碳源、氮源(无机盐)等营养成分。表中数据显示，黑曲霉对不同年份陈皮的黄酮类成分含量均有促进作用；且黑曲霉对陈化2年的陈皮黄酮类成分含量促进作用最大；而且表现出随着接种天数延长，黑曲霉对黄酮类成分含量的促进作用先增强后有所减弱。
[答案]　(1)平板划线(或稀释涂布平板)　(2)消毒，杀灭陈皮样品中的细菌(微生物)　(3)1 mL黑曲霉孢子悬浮液　碳源、氮源(无机盐)　黑曲霉对不同年份陈皮的黄酮类成分含量均有促进作用；黑曲霉对陈化2年的陈皮黄酮类成分含量促进作用最大；随着接种天数延长，黑曲霉对黄酮类成分含量的促进作用先增强后放缓
考点2　微生物的选择培养和计数
一、选择培养基
二、微生物的选择培养
1．土壤取样
铲取土样，将样品装入纸袋中
2．等比稀释
将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
3．涂布平板
4．培养观察
(1)待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
(2)在涂布有合适浓度菌液的平板上可以观察到分离的单菌落。
三、微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)计数原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)计数标准：为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
(3)计数方法：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
(4)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计结果一般用菌落数表示。
2．显微镜直接计数法
(1)计数原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)优点：是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．该实验中的选择培养基对分解尿素的细菌具有选择作用。若要判断选择培养基是否起到了筛选的作用，对照组应如何设置？(选择性必修3　P19“探究·实践”)
提示：用完全培养基接种后在相同条件下同时培养。
2．统计菌落种类和数目时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定。若培养时间不足或培养时间太长，分别会导致什么结果？(选择性必修3　P19“探究·实践”)
提示：遗漏菌落的种类和数目。菌落粘连影响计数、培养基表面干燥脱水、微生物衰败，菌落特征不易观察。
3．为从富含纤维素的土壤中分离出有分解纤维素能力的高产菌株，将样品稀释涂布到鉴别培养基之前，可通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度。选择培养基应以纤维素作为唯一的碳源。选择培养能够“浓缩”目的菌，分析其原因。(选择性必修3　P20“拓展应用”)
提示：目的菌能够以纤维素为碳源大量繁殖，而其他细菌不能以纤维素为碳源，无法正常生活。
1．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。 (×)
提示：选择培养基可以筛选分离出某种微生物。
2．脲酶催化尿素分解产生NH3。 (√)
3．对细菌进行计数时，可以用平板划线法。 (×)
提示：对细菌计数可以采用稀释涂布平板法或显微镜直接计数法。
4．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。 (√)
5．刚果红与纤维素形成红色复合物，可以通过是否产生透明圈来分离纤维素分解菌。 (√)
6．用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 (√)
1．利用稀释涂布平板法进行微生物数量测定时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目要少，这是因为________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
2．在进行土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的相关实验时，甲同学从对应1×106倍稀释的培养基中筛选出大约200个菌落，但是其他同学在同样稀释度下只筛选出大约90个菌落，若甲同学的结果有问题，则可能的原因是_______
_____________________________________________________________________。
提示：培养基被杂菌污染或培养基中混入了其他含氮物质或土壤样品不同
3．将纯化后的纤维素分解菌接种在含有刚果红的培养基上，然后将平板置于恒温培养箱中培养适宜时间，这些平板上透明圈最大的单菌落中的纤维素分解菌分解纤维素的能力不一定是最强的，原因是_______________________________
_____________________________________________________________________。
提示：判断纤维素分解菌分解能力的强弱，最准确的是透明圈直径与菌落直径的比值
1．两种纯化细菌的方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞
主要步骤 平板划线操作 系列稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
平板示意图
能否用于计数 不能计数 可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
2．统计菌落时所用两种计数方法的比较
比较项目 活菌计数法(稀释涂布平板法) 显微镜直接计数法
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数； V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞的死活
结果 比实际值小 比实际值大
3．选择培养基四种常见制备方法或实例
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
1．鉴定菌株间遗传关系时，常将待测菌株的菌丝体接种于同一培养基内，若两菌丝体间长出“拮抗线”，说明二者的遗传关系较远(图1)。借助此原理，快速筛选出一株与平菇、杏鲍菇菌株遗传关系较远的融合菌株X，请在图2中绘制模式图，标注接种菌丝体位置，注明菌株类型，并大致画出拮抗线的位置。
图1　菌株间的拮抗现象(右图为左图的模式图)
图2
提示：
2．酿酒皮渣堆积过程中会积累醋酸菌和某些兼性厌氧型乳酸菌，向培养基中加入无菌碳酸钙粉末，使培养基不透明，菌落生长时其周围会出现透明圈。现用筛选平板(培养基)初筛醋酸菌时，发现醋酸菌和乳酸菌在平板上形成的菌落形态很相似，很难区分。请设计一个实验方案，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌。即简要写出实验思路和预期结果及结论。
实验思路：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
预期结果及结论：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
提示：将平板置于无氧环境下培养，观察菌落和透明圈大小。　若菌落继续生长且透明圈增大，则为乳酸菌；若菌落不能继续生长且透明圈不再增大，则为醋酸菌。
微生物的选择培养
1．(2021·山东等级考)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是(　　)
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
B　[根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲菌可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A正确；乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C正确；可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标可以是菌落周围深蓝色圈的大小，D正确。]
2．(2022·全国乙卷)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题。
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有__________________________(答出两点即可)。
(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是________；用菌株C生产S的最适碳源是___________________。
菌株C的生长除需要碳源外，还需要______________________(答出两点即可)等营养物质。
(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是_____________
_____________________________________________________________________。
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：____________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是___________(答出一点即可)。
[解析]　(1)对所需的玻璃器皿进行灭菌，玻璃器皿常用的灭菌方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌等。(2)由实验结果可知，与以制糖废液为碳源相比，以葡萄糖为碳源时菌株C的细胞干重最大，说明最适于菌株C生长的碳源是葡萄糖；而以制糖废液为碳源时，用菌株C生产S的产量高于以葡萄糖为碳源时的产量，说明最适于生产S的碳源是制糖废液。微生物的生长一般都需要水、碳源、氮源和无机盐，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、水等营养物质。(3)分析题中表格可以看出在以淀粉为碳源的培养基中，菌株C不能生长，原因可能是菌株C中缺少分解淀粉的酶，不能利用淀粉。(4)要测定生产S的最适制糖废液的浓度，实验自变量为制糖废液的浓度，可分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度，即为生产S的最适碳源浓度。(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，既有利于减少污染、节省原料，又能降低生产成本。
[答案]　(1)高压蒸汽灭菌、干热灭菌　(2)葡萄糖　制糖废液　氮源、无机盐、水　(3)缺少淀粉酶　(4)分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度即为生产S的最适碳源浓度　(5)减少污染、节省原料、降低生产成本
微生物的计数
3．(2022·山东济宁模拟)嗜冷细菌在－15～20 ℃下能够正常生长，其产生的大量胞外耐高温的脂肪酶和蛋白酶会分解脂肪和蛋白质，从而造成牛奶腐败变质。为测定某牛奶样品中嗜冷细菌的数目，某生物小组做了如图所示实验，下列有关说法错误的是(　　)
注：培养皿旁的数字代表菌落数目。
A．牛奶样品中不一定含有嗜冷细菌生长繁殖所需的所有营养成分
B．估算1 mL牛奶样品中嗜冷细菌的活菌数为3.9×105个
C．刚挤出的鲜牛奶冷藏一段时间后进行高温杀菌处理，牛奶就不会腐败变质了
D．可从嗜冷细菌中获得抗冻基因用于抗冻作物品种的培育
C　[嗜冷细菌在－15～20 ℃下能够正常生长，牛奶样品中主要含有碳源、氮源等，但不一定含有嗜冷细菌生长繁殖所需的所有营养成分，如生长因子等，A正确；计数时应选择30～300的菌落数进行计算，据图可知，1 mL牛奶样品中嗜冷细菌的活菌数为(36＋39＋42)÷3×103÷0.1＝3.9×105个，B正确；牛奶等液体制品的消毒常采用巴氏消毒法，采用高温杀菌处理对牛奶进行消毒处理时会破坏牛奶的营养物质，C错误；可从嗜冷细菌中获得抗冻基因，将其作为目的基因导入作物体内，用于抗冻作物品种的培育，D正确。]
(教师用书独具)
(2022·河北衡水一模)反硝化细菌能在无氧环境中将硝酸盐转化为氮气(2NO＋10e－＋12H＋→……→N2O→N2)，在处理工业污水、治理水体富营养化中具有重要作用。科研人员想从一污水处理厂的活性污泥中筛选分离出耐高温(42 ℃)的反硝化细菌(目的菌)，用于提升温度较高的工业污水的脱氮效率，具体流程如图所示(BTB培养基初始pH＝6.8，BTB是酸碱指示剂，酸性条件下为黄色，中性条件下为绿色，碱性条件下为蓝色)：
(1)BTB培养基灭菌后待平板凝固，应倒置放在超净台上，目的是___________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)将污泥样品梯度稀释后，使用________(填工具)将样液均匀涂布在BTB培养基上，放在________环境中培养2～3天后，挑选显________色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。
(3)将纯菌株接种在液体培养基上培养一段时间，若在培养瓶顶部检测到N2O，即可鉴定为目的菌。不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌，原因是
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)C/N(碳氮含量比)对反硝化效率有一定的影响。科研人员测得不同C/N条件下目的菌对硝酸盐的去除率，结果如图所示：
科研人员提出，在利用目的菌株处理工业污水时，需要适当向污水中投放少量淀粉，据图分析这样做的主要目的是_______________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)为计数微生物的数量，一位同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的土壤样液0.1 mL，培养后菌落数分别为155、160、176、149个，则每毫升原土壤样液中上述微生物数量为________。
[解析]　(1)BTB培养基灭菌后待平板凝固，应倒置放在超净台上，这样做的目的是防止皿盖上的水珠落入培养基，同时也能避免培养基中的水分过快的挥发。(2)利用稀释涂布平板法纯化菌株时，接种工具是涂布器，根据反硝化过程的产物可知，反硝化细菌能在无氧环境中将硝酸盐转化为氮气，为了筛选出耐高温的反硝化细菌，需要将接种后的平板放在无氧、42 ℃环境中培养2～3天，反应过程中消耗培养基中的H＋，因此会导致菌落周围呈弱碱性，菌落周围培养基呈蓝色。故需要挑选显蓝色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。(3)因为其他微生物也能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低，因此不能用硝酸盐降低作为检测指标，而应该用反硝化作用的最终产物N2O作为检测指标。(4)结合实验数据可知，C/N影响目的菌对硝酸盐的去除率且随着该比值的增大，能提高对污水中硝酸盐的去除率，实验结果显示在C/N＝7时效果最好，因此在利用目的菌株处理工业污水时，向污水中投放少量淀粉的目的是适当提高污水中的C/N，从而提高目的菌对污水中硝酸盐的去除率。(5)由实验数据推知每毫升原土壤样液中上述微生物数量为(155＋160＋176＋149)÷4÷0.1×106＝1.6×109个。
[答案]　(1)防止皿盖上的水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快的挥发　(2)涂布器　无氧、42 ℃　蓝　(3)其他微生物也能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低　(4)适当提高污水中的C/N，从而提高目的菌对污水中硝酸盐的去除率　(5)1.6×109
1．核心概念
(1)(选择性必修3 P9)培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)(选择性必修3 P10)消毒：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
(3)(选择性必修3 P10)灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
(4)(选择性必修3 P12)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。　(5)(选择性必修3 P16)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．结论语句
(1)(选择性必修3 P16)土壤中的某些细菌能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。
(2)(选择性必修3 P18)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
(3)(选择性必修3 P18)同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
1．(2021·北京等级考)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下述操作不正确的是(　　)
A．对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌
B．使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C．用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布
D．观察菌落的形态和颜色等进行初步判断
C　[为避免杂菌污染的干扰，需对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌，A正确；葡萄球菌需从人体皮肤的微生物中分离，为避免杂菌污染，故需要使用无菌棉拭子从皮肤表面取样，B正确；棉拭子上的微生物需要用平板划线法在培养基上进行接种，C错误；根据微生物在固体平板培养基表面形成菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别，D正确。]
2．(2021·山东等级考)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是(　　)
A．乙菌的运动能力比甲菌强
B．为不影响菌的运动需选用液体培养基
C．该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D．穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
B　[从图中可以看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说明了乙菌的运动能力比甲菌强，A正确；实验所用培养基应为固体培养基，B错误；该实验可以根据黑色沉淀的多少初步比较细菌产生硫化氢的能力，但不能测定产生硫化氢的量，C正确；微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。]
3．(2020·江苏高考)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素分解菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
B　[倒平板后无须间歇晃动，A错误；图中Ⅰ区、Ⅱ区的细菌数量太多，Ⅲ区的细菌数量较少，可从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；Ⅲ区中存在单菌落，该实验结果能达到菌种纯化的目的，C错误；刚果红能与纤维素形成红色复合物，但不能和纤维素水解后的纤维二糖、葡萄糖等形成红色复合物，因此菌落周围的纤维素被降解后，不能被刚果红染成红色，D错误。]
4．(2022·全国甲卷)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题。
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成__________________________(答出两种即可)等生物大分子。
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是________。
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是________，理由是________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。(2)由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌的增殖呈“J”形曲线增长，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后A细菌的数量是N0·2n。(3)分析表格数据可知，实验的结果是在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路是在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。(4)在平板Ⅱ(无氮源的培养基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。
[答案]　(1)石油　DNA、RNA、蛋白质　(2)N0·2n　(3)在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力　(4)A菌株　A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
(教师用书独具)
(2020·全国卷Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
无菌水　甲　 　乙　　　　甲
请回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用____________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是_______________(答出一点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：____________
_____________________________________________________________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即________________。
[解析]　(1)实验过程中，对盛有水或培养基的摇瓶进行灭菌时，常采用高压蒸汽灭菌法。据题图分析可知，乙培养基为固体培养基，与甲培养基相比，其特有的组分Y物质应是凝固剂琼脂。甲、乙培养基均只允许能利用物质S作为氮源和碳源的微生物生长，因此均为选择培养基。(2)据题意，假设至少将摇瓶M中的菌液稀释X倍，才能保证稀释后的100 μL菌液中细菌细胞数不超过200个，初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，则稀释之前100 μL菌液中有2×106个细菌，可得2×106×(1/X)＝200，则X＝104，因此至少应将摇瓶M中的菌液稀释104倍。(3)在筛选过程中，若培养基中S浓度过高，可能会导致细胞失水，进而抑制菌株的生长。(4)将含有能降解S的细菌的淤泥加入无菌水中，进行适当稀释后，取适量的菌液，利用稀释涂布平板法涂布到乙培养基上，在适宜条件下进行培养，一段时间后，统计菌落数，即可估算出淤泥中能降解S的细菌细胞数。(5)本实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供的营养物质是水、碳源、氮源和无机盐。
[答案]　(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104　(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐
课时分层作业(三十五)　微生物的培养技术及应用
1．(2022·辽宁沈阳二模)下列关于无菌操作的叙述，错误的是(　　)
A．倒平板和接种操作都需在酒精灯火焰旁进行，以防杂菌污染
B．用划线法接种时，如果有五个划线区域，则接种环至少灼烧五次
C．适当喷洒石炭酸或煤酚皂溶液，再用紫外线照射可加强消毒效果
D．高压蒸汽灭菌时，需要用棉塞塞住盛有培养基的锥形瓶口并包上牛皮纸
B　[酒精灯火焰旁存在无菌区，倒平板和接种操作都要在酒精灯火焰旁进行，以防杂菌污染，A正确；用划线法接种时，接种及划线前后都要灼烧接种环，因此接种环灼烧次数比划线次数多1次，B错误；适当喷洒石炭酸或煤酚皂溶液，再用紫外线照射可加强消毒效果，C正确；培养基通常采用高压蒸汽灭菌，灭菌前需要用棉塞塞住锥形瓶口，包上牛皮纸，用皮筋勒紧，D正确。]
2．(2022·山东淄博一模)下列有关培养基的叙述正确的是(　　)
A．筛选、培养硝化细菌的培养基中不能加入氮源
B．固体培养基中的琼脂能为微生物生长提供碳源
C．在进行微生物的富集培养时常选用液体培养基
D．培养基中加入刚果红可用于尿素分解菌的鉴定
C　[硝化细菌属于化能合成型自养微生物，因此制备培养硝化细菌的培养基不需要添加碳源，但需要添加氮源，A错误；固体培养基中的琼脂只是作为凝固剂，不能为微生物生长提供碳源，B错误；液体培养基可以增大菌体与培养基的接触面积，为菌株的生长和繁殖提供更多的营养和空间，所以在进行微生物的富集培养时常选用液体培养基，C正确；培养基中加入刚果红可用于纤维素分解菌的鉴定，D错误。]
3．(2022·海南等级考)为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述错误的是(　　)
A．采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本
B．培养细菌时，可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基
C．土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落
D．鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法
C　[采集植物园中土壤样本的原则之一是要随机采样，A正确；牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有细菌生长所需的碳源、氮源、水、无机盐等，可用于细菌的培养，B 正确；土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的细菌分散开，有助于在培养基表面形成单菌落，C错误；不同种类细菌的理化特性一般不同，鉴定细菌种类时，除根据菌落特征进行形态学鉴定外，还可以借助生物化学的方法进行鉴定，D正确。]
4．(2022·湖北襄阳三模)聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，它具有类似于合成塑料的理化特性，且废弃后易被生物降解，可用于制造无污染的“绿色塑料”。科学家从某咸水湖中获得生产PHA含量高的菌种流程如下：①取湖水→②接种在培养基上→③培养→④挑取单菌落，分别扩大培养→⑤检测菌体的数目和PHA的产量→⑥获得目标菌株。下列叙述正确的是(　　)
A．②可用稀释涂布平板法接种到含PHA较高的选择培养基上
B．④挑取菌落时，应挑取多个菌落以便于筛选PHA产量高的嗜盐细菌
C．扩大培养时，需要将接种后的培养基放入恒温箱倒置培养，以防杂菌污染
D．⑤中用显微镜直接计数法检测菌体的数目所得数值低于实际值
B　[嗜盐细菌能生产PHA，从咸水湖中寻找生产PHA的菌种，步骤②可用稀释涂布平板法接种到含盐量较高的选择培养基上，而不是接种到含PHA较高的选择培养基上，A错误；④挑取菌落时，应挑取多个菌落并分别测定嗜盐细菌的PHA含量，以便于筛选PHA产量高的嗜盐细菌，B正确；扩大培养常采用液体培养基，不需要倒置培养，C错误；显微镜直接计数法不能区分死菌和活菌，因此⑤中用显微镜直接计数法检测菌体的数目所得数值高于实际值，D错误。]
5．(2022·山东潍坊一模)金黄色葡萄球菌是一种常见的病原菌，在血平板(完全培养基中添加适量血液)上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。某研究小组通过稀释涂布平板法测定了某处土壤中金黄色葡萄球菌数量，相关说法不正确的是(　　)
A．从功能上分类，血平板属于选择培养基
B．在制作血平板时需要在平板冷却后加入血液，防止高温破坏血细胞
C．待涂布的菌液被培养基吸收后应倒置培养，防止水分过度蒸发
D．实验统计的菌落数往往比活菌的实际数目低
A　[据题干信息“金黄色葡萄球菌是一种常见的病原菌，在血平板(完全培养基中添加适量血液)上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色”，因此血平板属于鉴别培养基，A错误；为防止高温破坏血细胞，在制作血平板时需要在平板冷却后加入血液，B正确；涂布后的平板待菌液被培养基吸收后应倒置培养，防止水分过度蒸发，C正确；由于两个或多个菌落连在一起形成一个菌落，所以统计的菌落数比活菌的实际数目低，D正确。]
6．(2022·江苏苏州模拟预测)新疆的“生命营养液”是以多种天然食材为原料发酵而成。为从中分离到红曲菌(真菌)，现用无菌水将其稀释成浓度为10-1 g/mL、10-2 g/mL、10-3 g/mL的悬液，分别取0.1 mL稀释液涂布于含有氯霉素和四环素的PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板上，制备3个平行组。然后将PDA平板置于恒温培养箱培养，并连续7天统计平板上的菌落数。下列叙述正确的是(　　)
A．制备PDA培养基时，先高压蒸汽灭菌再调节pH
B．计数时平板上菌落过于密集，可多做几组平行组进行实验统计
C．恒温培养前，需在培养皿底部标明组别、培养日期和稀释度等
D．可大幅度提高“生命营养液”中氯霉素和四环素含量以抑制杂菌
C　[制备PDA培养基时，要先调节pH再高压蒸汽灭菌，防止调节pH过程中受杂菌污染，A错误；计数时平板上菌落过于密集，可稀释之后再进行计数，B错误；恒温培养前，需在培养皿底部标明组别、培养日期和稀释度等，便于进行实验统计和对比观察，C正确；氯霉素和四环素是针对细菌起作用的抗生素，且大幅度提高“生命营养液”中氯霉素和四环素含量会导致培养液渗透压升高，也会抑制红曲菌生长，D错误。]
7．(2023·广东东莞检测)我国科学家发现了一种来自密闭油藏的新型产甲烷古菌，其可直接将液态原油降解成气态甲烷。下列叙述错误的是(　　)
A．密闭油藏中的新型产甲烷古菌属于厌氧型微生物
B．用液态原油配制成的培养基可分离新型产甲烷古菌
C．宜选用液体培养基对新型产甲烷古菌进行扩大培养
D．平板划线法和稀释涂布平板法均可用于该菌的计数
D　[结合题意可知，新型产甲烷古菌来自密闭油藏，故推测其属于厌氧型微生物，A正确；由于新型产甲烷古菌是在油藏中发现的，说明其能够利用液态原油，故用液态原油配制成的培养基可分离新型产甲烷古菌，且为保证其纯度，宜选用液体培养基对新型产甲烷古菌进行扩大培养，B、C正确；平板划线法不能用于菌种的计数，D错误。]
8．(2023·广东佛山调研)下图为微生物的实验室培养的有关操作，相关叙述错误的是(　　)
　　　　③接种
A．步骤①中，需将接种工具灼烧至变红，以杀灭杂菌
B 步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远
C．图中接种方法的目的是使菌种逐渐稀释，经培养后获得单个菌落
D．接种后应将培养皿倒置培养，培养后可以根据结果进行微生物计数
D　[图1步骤①中，接种前灼烧接种环至变红，目的是杀灭接种环上可能引起污染的微生物，A正确；步骤②中，将接种工具冷却时不宜距酒精灯火焰太远，防止受到杂菌污染，B正确；所示的接种方法是平板划线法，目的是使接种的菌种逐渐稀释，经培养后获得由单个细菌繁殖而来的菌落，C正确；图示的平板划线法不能用于微生物的计数，D错误。]
9．(2022·广东广州模拟)在我们的日常生活中会产生大量的厨余垃圾，厨余垃圾极容易腐烂形成臭味和滋生大量的病菌，还会污染环境。研究人员设想将垃圾转变成良好的肥料，需要从厨余垃圾中分离纯化出高效分解垃圾的微生物。回答下列问题：
(1)分离纯化高效分解垃圾的微生物需要配制培养基，培养基的营养成分主要包括____________________等，对配制好的培养基常采用__________________法进行灭菌。灭菌是指使用强烈的理化方法杀死______________________，包括芽孢和孢子。
(2)纯化分解垃圾的微生物的技术流程为样品采集→梯度稀释→分离纯化→鉴别培养→菌种鉴定，该过程利用了________________法进行菌株的分离纯化。接种后进行培养时，培养皿皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，因此，需要将培养皿倒置，原因是_____________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
若整个实验过程中没有受到杂菌污染，但培养基上却出现了多种特征的菌落，这说明____________________________________。
(3)为估算样液中的细菌数目，通过菌落计数后发现，稀释倍数高的一组估算结果往往________(填“大于”“小于”或“等于”)稀释倍数低的一组。将分离纯化出的高效分解垃圾的3种微生物制成菌剂，为测定这3种菌剂对厨余垃圾的实际降解能力，实验思路是：①将纤维素、淀粉、脂肪、蛋白质和水等，按照厨余垃圾的组分比例配制培养基；②将等量的3种菌剂分别与等量的培养基置于适宜的环境中进行混合培养；③________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)培养基的营养成分主要包括碳源、氮源、水和无机盐。对培养基需要采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。(2)纯化分解垃圾的微生物的技术流程为样品采集→梯度稀释→分离纯化→鉴别培养→菌种鉴定，该过程需要将培养液稀释后再接种，因此采用的是稀释涂布平板法接种。将培养皿倒置既可以防止皿盖上的水珠落入培养基上造成污染，又可以避免培养基表面的水分过快地挥发。不同菌体形成的菌落特征不同，若整个实验过程中没有受到杂菌污染，但培养基上却出现了多种特征的菌落，这说明有多种微生物都能分解厨余垃圾。(3)因为稀释倍数低的样液中菌体的数量太多而使得在涂布时更容易出现两个或多个细胞连在一起形成一个菌落的情况，从而导致菌落计数偏低，而稀释倍数高的菌液中由于菌体数目少，在涂布时，出现两个或多个细胞连在一起形成一个菌落的情况的机会更少，因此，稀释倍数低的组计算结果往往比稀释倍数高的组计算结果略低。实验目的是测定这3种菌剂对厨余垃圾的实际降解能力，因此因变量为培养基中各种成分的减少量，故实验的最后一步应为：培养相同时间后，测定各组培养基中各种成分的减少量(或各组培养基中各种成分的剩余量)。
[答案]　(1)碳源、氮源、水和无机盐　高压蒸汽灭菌　物体内外所有的微生物　(2)稀释涂布平板　将培养皿倒置既可以防止皿盖上的水珠落入培养基上造成污染，又可以避免培养基表面的水分过快地挥发　多种微生物都能分解厨余垃圾　(3)大于　培养相同时间后，测定各组培养基中各种成分的减少量(或各组培养基中各种成分的剩余量)
10．(2023·广东惠州检测)处理生活垃圾的有效方法之一是用微生物对其进行降解。下图表示筛选高效降解淀粉菌种的过程。相关分析正确的是(　　)
A．筛选所用培养基中的碳源应为牛肉膏和蛋白胨
B．将菌液接种到培养皿的方法是平板划线法
C．菌落①与菌落②透明圈大小不同的原因是其对碘的分解能力不同
D．扩大培养时用不加琼脂的液体培养基效果更好
D　[筛选所用培养基应以淀粉作为唯一的碳源，这样才能将降解淀粉的菌种筛选出来，A错误；由培养皿上的单个菌落可知，将菌液接种到培养皿的方法是稀释涂布平板法，B错误；由于培养基中的唯一碳源是淀粉，而淀粉遇碘液会变蓝，故菌落①与②周围透明圈的大小不同的原因可能是两个菌群对淀粉的分解能力不同，C错误；液体培养基可增大溶氧量，也能增加菌种与营养物质的接触面积，故扩大培养时用不加琼脂的液体培养基效果更好，D正确。]
11．(2022·江苏连云港模拟预测)利用黄粉虫肠道微生物对白色污染物进行生物降解，是一种绿色环保的处理工艺。图示是从黄粉虫肠道中分离、纯化微生物的过程，下列说法正确的是(　　)
A．配制固体培养基时，不需要在无菌的环境中进行
B．平板划线用的菌浓度应控制在300～3 000个/mL
C．平板上长出的菌落一定是分解PVC塑料的微生物形成的
D．在富集培养的培养基中含有牛肉膏和琼脂等成分
A　[配制固体培养基时，不需要在无菌的环境中进行，因为培养基配制好之后要进行高压蒸汽灭菌，A正确；在涂布时吸取的菌液不超过0.1 mL，平板上的菌落数应介于30～300个，涂布用的菌浓度应控制在300～3 000个/mL，平板划线法不能计数，对于平板划线用的菌浓度没有严格要求，B错误；在培养过程中如果某个环节操作不当，平板上就有可能会混有其他微生物生长出的菌落，C错误；富集培养时采用的是液体培养基，液体培养基中不含琼脂，D错误。]
12．(2022·河北唐山三模)二氯喹啉酸(QNC)是一种高选择性、激素类、低毒性除草剂，主要用于防治稻田稗草，持效期长，易于在土壤中积累而影响后茬作物的生长发育。某科研小组欲分离筛选出一株可降解除草剂QNC的菌株，鉴定并明确其降解特性，分离、培养流程如图a所示，回答下列问题：
图a
(1)在无机盐液体培养基中筛选降解菌株，需要以___________为唯一碳源。在培养中需要振荡处理，目的是
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)不同的微生物培养形成的菌落表现出不同的特征，可通过微生物的菌落特征来鉴定微生物，这些菌落特征包括______________________(答出两点即可)等。通过分离筛选得到一株能有效降解QNC的菌株15#，对培养的菌株15#进行计数时，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，其目的是____________________________________。统计获得的菌落数比实际的活菌数少，原因是______________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)为确定菌株15#的最适培养条件，科研人员探究接种量和不同氮源等因素对菌株15#降解QNC的影响，实验结果如图b、图c所示。
外源氮对QNC降解效率的影响(%)
图b
接种量对QNC降解效率的影响(%)
图c
①分析图b可以得出的结论有__________________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
②分析图c可知，菌株15#降解QNC效果最好的接种量为7%，当超过该接种量时，降解率呈下降趋势，原因可能是___________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)因为该科研小组欲分离筛选出一株可降解除草剂QNC的菌株，因此在无机盐液体培养基中筛选降解菌株，需要以QNC为唯一碳源。在培养中需要振荡处理，一方面使菌体与培养液充分接触，利于菌体获得更多的营养物质，另一方面使菌体与空气充分接触，有利于菌体的生长。(2)可根据菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征来鉴定微生物。对培养的菌株15#进行计数时，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，可知采用的计数方法是稀释涂布平板法，稀释的目的是确保获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故统计获得的菌落数比实际的活菌数少。(3)①图b中，尿素、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵是不同的氮源，由图可知，不同氮源对菌株15#降解QNC的影响不同；以蛋白胨为氮源时，菌株15#降解QNC的效果最好；不同氮源对菌株15#降解QNC的促进作用顺序为：蛋白胨>硝酸铵>氯化铵>尿素>硫酸铵。②超过该接种量时，即种群中的个体数过多，则菌体间的种内竞争激烈，导致营养物质不足，影响QNC降解率。
[答案]　(1)除草剂QNC　使菌体与培养液、空气充分接触，利于菌体获得更多的营养物质　(2)菌落的形状、大小、隆起程度和颜色　确保获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落　(3)①不同氮源对菌株15#降解QNC的影响不同；以蛋白胨为氮源时，菌株15#降解QNC 的效果最好；不同氮源对菌株15#降解QNC的促进作用顺序为：蛋白胨>硝酸铵>氯化铵>尿素>硫酸铵　②菌体间的种内竞争导致营养物质不足，影响QNC降解率
(教师用书独具)
1．(2022·山东济南二模)肠道菌群与人体健康存在密切关系，实验室常用硫乙醇酸盐流体培养基培养肠道菌群。硫乙醇酸盐流体培养基的主要成分包括胰酪蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、氯化钠、L 胱氨酸、硫乙醇酸钠、琼脂、刃天青等，其中L 胱氨酸、硫乙醇酸钠和葡萄糖均可防止因过氧化物的积累而对厌氧细菌产生毒害。培养基的上层、中层、下层部位可以分别提供有氧、弱氧至无氧的梯度环境。下列说法错误的是(　　)
A．厌氧细菌、兼性厌氧细菌和好氧细菌均可在硫乙醇酸盐流体培养基中生长
B．琼脂可以防止液体流动，减少二氧化碳和氧气扩散，有利于厌氧环境的形成
C．胰酪蛋白胨可为厌氧细菌提供氮源以及合成蛋白质必需的各种氨基酸
D．硫乙醇酸盐流体培养基需经高压蒸汽灭菌后使用，接种工作应在超净工作台内完成
C　[培养基的上层、中层、下层部位可以分别提供有氧、弱氧至无氧的梯度环境，故厌氧细菌、兼性厌氧细菌和好氧细菌均可在硫乙醇酸盐流体培养基中生长，A正确；培养基中加入琼脂可以防止液体流动，从而减少二氧化碳和氧气扩散，有利于厌氧环境的形成，B正确；胰酪蛋白胨可为厌氧细菌提供氮源，但不能提供合成蛋白质必需的各种氨基酸，C错误；培养基使用高压蒸汽灭菌，接种操作应在超净工作台内完成，D正确。]
2．(2022·河北石家庄模拟)苎麻的蛋白质含量高，年生物产量大，是畜牧业植物蛋白质饲料的重要来源。但苎麻含有大量木质纤维素，动物消化吸收困难。黑曲霉为真菌，在发酵过程中能产生纤维素酶、木质素降解酶等多种酶。为探究黑曲霉菌液对青贮料(苎麻与麦麸)进行混合发酵后营养成分、木质纤维素降解效果的影响，并寻求黑曲霉菌液最佳添加量。科研人员做了如下实验并得到相关结果：
对照CK 处理Ⅰ 处理Ⅱ 处理Ⅲ 处理Ⅳ
可溶性碳水化合物含量% 3.14 3.38 3.38 3.25 3.21
中性洗涤纤维含量% 41.95 37.49 34.47 34.42 34.85
酸性洗涤纤维含量% 22.38 18.90 17.78 17.83 17.84
酸性洗涤木质素含量% 16.85 15.04 14.48 14.92 14.56
注：CK：每千克青贮料中添加200 mL无菌水；
处理Ⅰ：每千克青贮料中添加50 mL黑曲霉菌液＋150 mL无菌水；
处理Ⅱ：每千克青贮料中添加100 mL黑曲霉菌液＋100 mL无菌水；
处理Ⅲ：每千克青贮料中添加150 mL黑曲霉菌液＋50 mL无菌水；
处理Ⅳ：每千克青贮料中添加200 mL黑曲霉菌液。
回答下列问题：
(1)纤维素酶可以把植物细胞壁的纤维素分解为____________________，从而降低青贮料中纤维素的含量。
(2)黑曲霉的PDA液体产酶培养基组成为：麸皮，豆粉饼，(NH4)2SO4，KH2PO4，MgSO4·7H2O；培养时需要通气振荡，由此可知黑曲霉的代谢类型为__________；豆粉饼可提供黑曲霉生长所需的________；若要分离高产纤维素酶的黑曲霉菌落，上述培养基中还需要添加________，且在培养基灭菌前将pH调至________(填“酸性”“中性”或“弱碱性”)。
(3)研究结果表明添加黑曲霉菌液可以有效改良青贮料的品质，理由是______
_____________________________________________________________________；
其中黑曲霉菌液最佳添加量为每千克青贮料中添加________mL黑曲霉菌液。
(4)上述实验中所用黑曲霉菌液浓度的计数方法为：用多层纱布过滤黑曲霉培养液得到孢子悬浮液，取1 mL用无菌水稀释10倍，取0.1 mL稀释液滴加至血细胞计数板计数，统计得到计数板中平均孢子数为56.8个，则黑曲霉培养液中孢子浓度为____________个·mL-1。
[解析]　(1)纤维素酶把纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖。(2)由黑曲霉的PDA液体产酶培养基组成中含有麸皮和豆粉饼可知黑曲霉同化类型为异养型；由培养时需要通气振荡可知黑曲霉的异化作用为需氧型，因此代谢类型为异养需氧型。豆粉饼可提供黑曲霉生长所需的氮源和碳源。若要分离高产纤维素酶的黑曲霉菌落则需要固体培养基，需要在上述液体培养基中添加琼脂。黑曲霉属于霉菌，培养霉菌的培养基需要将pH调至酸性。(3)由表中信息可知，与对照组(不添加黑曲霉菌液)相比，添加黑曲霉菌液的处理组青贮料的可溶性碳水化合物含量均上升，纤维素和木质素的含量均下降，说明添加黑曲霉菌液可以分解纤维素和木质素，改良青贮料的品质。综合考虑可溶性碳水化合物含量、中性洗涤纤维含量、酸性洗涤纤维含量、酸性洗涤木质素含量的变化，相比其他3组，处理Ⅱ组可溶性碳水化合物含量最高，该条件下中性洗涤纤维含量、酸性洗涤纤维含量、酸性洗涤木质素的总量最低(3种物质数量之和)，因此处理Ⅱ组为处理的最佳方案，由表中注解可知处理Ⅱ组的方案为每千克青贮料中添加100 mL黑曲霉菌液。(4)由题干信息中的计数方法可知：0.1 mL稀释液滴加至血细胞计数板计数，统计得到计数板中平均孢子数为56.8个，因此黑曲霉培养液中孢子浓度为56.8×104×10个·mL-1，即5.68×106个·mL-1。
[答案]　(1)纤维二糖和葡萄糖　(2)异养需氧型　氮源和碳源　琼脂　酸性　(3)与对照组相比，添加黑曲霉菌液的处理组青贮料的可溶性碳水化合物含量均上升，纤维素和木质素的含量均下降　100　(4)5.68×106
3．(2022·山东枣庄二模)自生固氮菌是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如图。已知步骤④获得的三个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。相关叙述正确的是(　　)
①　　 ②　 　③　　　 ④　　⑤
A．步骤②振荡20 min的目的是扩大菌种数量，属于选择培养
B．步骤④使用接种环划线接种，使用前需要灼烧灭菌
C．1 g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×106个
D．所用培养基应加入碳源、氮源、无机盐、水和琼脂
C　[步骤②需充分振荡的主要目的是使土壤中的微生物充分释放到无菌水中，A错误；由图观察可知，步骤④平板中的菌落分布均匀，故所用的接种工具是涂布器，接种方法是稀释涂布平板法，B错误；菌落统计时应选择菌落数为30～300之间的进行计数，故1 g土壤中平均自生固氮菌数约为(90＋95＋100)/3÷0.1×104＝9.5×106个，C正确；本实验需要分离自生固氮菌，自生固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，故所用培养基中不能加入氮源，D错误。]
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