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第36讲 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题
第十二单元 生物技术与工程
课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具
2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测、鉴定等步骤
3.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质
4.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用而改善了人类的生活品质
课标要求 5.举例说出日常生活中的转基因产品，探讨转基因技术在应用过程中带来的影响
6.举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题，分析说明我国为什么不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
7.举例说明历史上生物武器对人类造成了严重的威胁与伤害，认同我国反对生物武器及其技术和设备的扩散
基因工程的概念:
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
1.别名:
2.原理:
3.操作对象:
4.操作水平:
5.结果:
重组DNA技术
基因
分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
考点一 重组DNA技术的基本工具
1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
AATTC—
G—
AATT—
黏性末端的写法:
(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”: 原核生物中存在限制酶的意义是什么？
原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
(2)源于选择性必修3 P74“拓展应用”:限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
2. DNA连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端
黏性末端
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
4. DNA聚合酶的作用
DNA连接酶 DNA聚合酶
作用实质 化学本质 不 同 点 模板
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成与模板链互补的DNA链,形成新的双链DNA分子
基因工程
DNA复制
只能催化单个核苷酸连接到已有的核酸片段3’末端羟基上, 形成磷酸二酯键
催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
相同点
作用对象
作用结果
3. 载体
环状双链DNA分子
噬菌体
有一个至多个
自我复制
受体DNA
标记
基因工程中使用质粒的特点:
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过__________的；这些质粒上常有特殊的标记基因，便于_______________________；
人工改造
重组DNA分子的筛选
图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则: 如图甲中可选择 ，而不选择 。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:
质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择 。
PstⅠ
SmaⅠ
SmaⅠ
图解限制酶的选择原则
(3)确保出现相同黏性末端原则:
通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中 ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择 两种限制酶。
PstⅠ
PstⅠ和EcoRⅠ
【检测】(2022·青岛市高三期中) 下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是( )
注: Y为C或T，R为A或G。
限制酶名称　 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
Bam HⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
Eco RⅠ C↓AATTC Sau 3AⅠ ↓GATC
Hin dⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
A.Hin dⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B.Sau 3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.Bam HⅠ和Sau 3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
D
HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC
【检测】第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是( )
A.构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和
　Sau3AⅠ切割目的基因和质粒
B.图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，
含有2个游离的磷酸基团
C.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物
D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
目的基因和质粒可正向连接和反向连接，产生两种重组DNA
转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋
C
考点二 基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
(核心)
将目的
基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因: 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞　 　或获得预期　　 　　等的基因。
(2)筛选合适的目的基因的方法
①从相关的已知　　　　　　　的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用　 　　　　和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成　 　　。
②利用　 　扩增目的基因
③从基因文库中获取
性状
表达产物
结构和功能清晰
序列数据库
目的基因
PCR
b.借助 用化学方法直接人工合成。
DNA合成仪
a.逆转录法合成目的基因。
　　源于选择性必修3 P77“相关信息”: Bt 抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈　 　，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
酸性
PCR是________________的缩写，是一项根据________________的原理，在_____提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对______________________进行大量复制的技术；
2.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR的概念:
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
目的基因的核苷酸序列
①全称:
②原理:
③操作环境:
④目的:
⑤优点:
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外(PCR扩增仪/PCR仪)
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
(2)DNA复制所需的基本条件:
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（体外用耐高温的DNA聚合酶）
（体外用高温代替）
（2种,一对）
引物是一小段能与__________的一段碱基序列_________的______________
DNA母链
互补配对
短单链核酸
3’
5’
DNA母链
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
引物的作用
引物使DNA聚合酶能够从引物的3’ 端开始连接脱氧核苷酸。
(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
5’-
-3’
5’
-3’
-5’
3’-
引物
引物
子链延伸
子链延伸
引物是决定PCR特异性的关键。
3’-
-5’
(3)PCR的条件:
耐高温的DNA聚合酶
引物
4种脱氧核苷酸
DNA模板
注意: 复制的原料实为dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，其水解产生的能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP。
①DNA(目的基因)模板;
④分别与模板DNA相结合的两种引物;
②A、T、G、C4种脱氧核苷酸(实为dNTP);
③耐高温的DNA聚合酶(Taq酶);
⑤稳定的缓冲溶液(一般添加Mg2+);
⑥不同的温度: 因为变性、复性和延伸需要不同温度
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成　　 　　　的原料，又可为DNA的合成提供　 　。
(2)引物既可以是DNA单链，也可以为　　　　　。细胞内的DNA进行复制时，也需要　 　，一般为 片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　　　激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加　　　。
DNA子链
能量
RNA单链
引物
Mg2＋
Mg2＋
【易错提醒】PCR技术和DNA复制的比较
RNA
引物
DNA模板
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
①变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
②复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
③延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
(4)PCR反应过程
条件
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
缓冲溶液
（含Mg2+)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。
(5)PCR扩增产物的鉴定
(6)PCR扩增过程中的循环图示与规律
第1次扩增
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
1
1
一个DNA,一对引物(A与B)若干,通过PCR扩增1次:
总DNA数______个
2
第2次扩增
中长链-短链DNA____个
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
2
3
3
一个DNA,一对引物(A与B)若干,通过PCR扩增2次:
总DNA数______个
4
第3次扩增
短链-短链DNA______个
中长链-短链DNA____个
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
4
2
7
7
2
2n-2
2n-2n
2n-1
2n-1
一个DNA,一对引物(A与B)若干,通过PCR扩增3次:
总DNA数______个
8
2n
n次
短链-短链DNA____________个
中长链-短链DNA__________个
长链-中长链DNA__________个
含有引物A的DNA__________个
含有引物B的DNA__________个
2
2n-2
2n-2n
2n-1
2n-1
PCR扩增DNA规律:
一个DNA,一对引物(A与B)若干,通过PCR扩增n次:
总DNA数__________个
2n
第3次扩增的结果
长链
中长链
短链
【检测】一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次:
①子代DNA分子中, 等长链DNA分子数为:______个
②子代DNA分子中, 不等长链DNA分子数为:_______个
③子代DNA分子中, 含模板链DNA分子数为:_______个
④子代DNA分子中, 含引物A（或B）的DNA分子数为:______个
⑤复制过程中共需引物____________个
⑥第n次复制需要引物_________个
2n-2n
2n
2
2n-1
(2n - 1)×2
2n
[(2n - 1)×2]-[(2n-1 - 1)×2]
【拓展】PCR引物的设计
PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增高效性。
1.引物设计需考虑的两个因素
扩增
特异性
扩增
高效性
引物
特异性: 只扩增出目标DNA的特性
高效性: 单位时间内扩增产物的量
特异性太强，扩增效率就会下降
提高扩增效率，扩增特异性就会下降
2.引物设计的原则
①引物长度
一般在15-30碱基之间。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq 酶进行反应。过短特异性差。
②引物GC含量
一般在40%~60%之间，GC含量过高或过低都不利于引发反应。
【拓展】PCR引物的设计
2.引物设计的原则
③引物自身及引物之间不应存在互补序列
碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或引物之间配对结合，从而影响引物与模板的复性结合。
【拓展】PCR引物的设计
2.引物设计的原则
④退火温度
退火温度高，扩增特异性强，退火温度低, 扩增效率高。
如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。
【拓展】PCR引物的设计
2.引物设计的原则
⑤引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰
引物的5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入蛋白质结合DNA序列，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。
【拓展】PCR引物的设计
【检测】下图为某质粒限制酶的酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因与该质粒重组,则扩增的该基因的两端需要分别引入下列哪两种限制酶的识别序列 (　　)。
A.NdeⅠ和BamHⅠ　　　　B.NdeⅠ和XbaⅠ
C.XbaⅠ和BamHⅠ
D.EcoRⅠ和KpnⅠ
A
D项: 第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8
【检测】利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是( )
A.用PCR方法扩增目的基因时不必
知道基因的全部序列
B.设计引物时需要避免引物之间形
成碱基互补配对而造成引物自连
C.复性温度过高可能导致PCR反应
得不到任何扩增产物
D.第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA
片段所占的比例为15/16
D
要有一段已知目的基因
的核苷酸序列, 以便根据这一序列合成引物
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的: 使目的基因　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代
启动子
标记基因
复制的起始位点, 使DNA能完成自主复制
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质
位置
功能
【拓展】启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻的碱基
mRNA上三个相邻的碱基
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位, 驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
(3)构建过程
(2)用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，一定会形成符合要求的重组DNA分子吗？
不一定，载体和目的基因都可能出现自身环化或自身连接；载体与目的基因也可能会出现反向连接。
(3)如何避免上述问题？
同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体(使得目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端与载体另一端的黏性末端相同)
【思考】(1)切割载体和切割含有目的基因的DNA片段为什么要用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？
产生相同的黏性末端或平末端，以便通过DNA连接酶连接；
将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有:
质粒
目的基因
自身环化
目的基因自身环化
质粒自身环化
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接
反向连接
自身连接
【拓展】
①单酶切
单酶切的缺点:
质粒自身环化，目的基因自身环化
质粒与质粒自身连接，目的基因与目的基因自身连接
质粒与目的基因反向连接
a
b
a
b
②双酶切的优点:
防止质粒自身环化，防止目的基因自身环化
防止质粒与目的基因反向连接
载体与基因表达载体的区别
载体
相同点:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段
不同点: 基因表达载体在载体基础上增加了启动子, 目的基因, 终止子

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