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1．(2023·山东卷，15)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是( D )
A．不含氮源的平板不能用于微生物培养
B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
解析： 不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。故选D。
2．(2023·山东卷改编，20)果酒的家庭制作与啤酒的工业化生产相比，共同点有( A )
A．都利用了酵母菌无氧呼吸产生酒精的原理
B．都需要在无氧环境供发酵菌种繁殖
C．发酵前都需要对原料进行灭菌
D．发酵结束后都必须进行消毒以延长保存期
解析： 二者均利用了酵母菌进行无氧呼吸产生酒精的原理，A正确；发酵前期，均需要一定的有氧环境，使酵母菌大量繁殖，B错误；果酒的家庭制作不需对原料进行灭菌，C错误；果酒的家庭制作不需要进行消毒，D错误。故选A。
(2023·浙江卷)阅读下列材料，完成下面3～4题。
小曲白酒清香纯正，以大米、大麦、小麦等为原料，以小曲为发酵剂酿造而成。小曲中所含的微生物主要有好氧型微生物霉菌、兼性厌氧型微生物酵母菌，还有乳酸菌、醋酸菌等细菌。酿酒的原理主要是酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖发酵产生酒精。传统酿造工艺流程如图所示。
3．小曲白酒的酿造过程中，酵母菌进行了有氧呼吸和无氧呼吸。关于酵母菌的呼吸作用，下列叙述正确的是( A )
A．有氧呼吸产生的[H]与O2结合，无氧呼吸产生的[H]不与O2结合
B．有氧呼吸在线粒体中进行，无氧呼吸在细胞质基质中进行
C．有氧呼吸有热能的释放，无氧呼吸没有热能的释放
D．有氧呼吸需要酶催化，无氧呼吸不需要酶催化
解析： 有氧呼吸产生的[H]在第三阶段与O2结合生成水，无氧呼吸产生的[H]不与O2结合，A正确；有氧呼吸的第一阶段在细胞质基质中进行，第二和第三阶段分别在线粒体基质和线粒体内膜中进行，无氧呼吸的两个阶段都在细胞质基质中进行，B错误；酵母菌有氧呼吸和无氧呼吸过程中释放的能量均大多以热能散失，但无氧呼吸是不彻底的氧化分解过程，大部分能量存留在酒精，C错误；有氧呼吸和无氧呼吸过程都需要酶的催化，只是酶的种类不同，D错误。故选A。
4．关于小曲白酒的酿造过程，下列叙述错误的是( D )
A．糖化主要是利用霉菌将淀粉水解为葡萄糖
B．发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测
C．若酿造过程中酒变酸，则发酵坛密封不严
D．蒸熟并摊晾的原料加入糟醅，立即密封可高效进行酒精发酵
解析： 由于酿酒酵母不能直接利用淀粉发酵产生酒精(乙醇)，故糖化过程主要是利用霉菌分泌的淀粉酶将淀粉分解为葡萄糖，以供发酵利用，A正确；发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测，若存在酒精，则酒精与酸性的重铬酸钾反应呈灰绿色，B正确；酿造过程中应在无氧条件下进行，若密封不严，会导致醋酸菌在有氧条件下发酵产生醋酸而使酒变酸，C正确；蒸熟并摊晾的原料需要冷却后才可加入糟醅，以免杀死菌种，且需要在有氧条件下培养一段时间，让酵母菌大量繁殖，此后再密封进行酒精发酵，D错误。故选D。
5．(2022·山东卷，14)青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是( D )
A．发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B．可用深层通气液体发酵技术提高产量
C．选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中
D．青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌
解析：青霉菌处于葡萄糖浓度不足的环境中会通过分泌青霉素杀死细菌；提供相同含量的碳源，葡萄糖溶液单位体积中溶质微粒较多，会导致细胞失水，发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖(或：由题知青霉菌在葡萄糖含量不足时，可杀死细菌，并保证自身能量供应，因此不用葡萄糖为碳源有利于青霉菌代谢产青霉素)。乳糖是二糖，可被水解为半乳糖和葡萄糖，是青霉菌生长的最佳碳源，可以被青霉菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，A正确；青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；选育出的高产青霉素菌株经扩大培养纯化后，才可接种到发酵罐中进行工业化生产，C正确；为了防止细菌、其他真菌等微生物的污染，获得纯净的青霉素，发酵罐仍需严格灭菌，D错误。
6．(2022·广东卷，21)研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1 146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
回答下列问题：
(1)研究者先制备富集培养基，然后采用 高压蒸汽灭菌　法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28 ℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养，除了稀释涂布平板法，还可采用 平板划线　法。据图分析，拟杆菌新菌株在以 纤维素　为碳源时生长状况最好。
(2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是 某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)　。(答一点即可)
(3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是 拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行　。
(4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有 耐低温　。
解析：(1)培养基通常采用高压蒸汽灭菌法(或湿热灭菌法)进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析图可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。(2)深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)，故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。(3)拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。(4)深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，保证拟杆菌的正常生命活动所需，才能高效降解多糖。
7．(2022·全国甲卷，37)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题：
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是 石油　。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成 DNA、RNA和蛋白质(合理即可)　(答出2种即可)等生物大分子。
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是 N0·2n　。
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是 在平板Ⅰ和平板Ⅱ的甲孔中均滴加A菌液，在平板Ⅰ和平板Ⅱ的乙孔中均滴加等量的B菌液，培养相同时间，观察透明圈大小(分解石油的能力越强，透明圈越大)　。
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是 菌株A　，理由是 菌株A在无NH4NO3的培养基上可以生长繁殖，而菌株B在无NH4NO3的培养基上不能生长繁殖，且菌株A分解石油的能力较强(合理即可)　。
解析：(1)石油中含有含碳有机物，可以作为碳源。菌体内的含氮生物大分子有蛋白质和核酸。(2)在资源和空间不受限制的阶段，细菌呈“J”形增长。若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后A细菌的数量是N0·2n。(3)由题表可知，Ⅰ平板培养基，菌株AB都可生长，可用来比较A和B菌株分解石油的能力大小；Ⅱ平板缺少氮源，可用来比较此条件下两种菌株分解石油能力的大小，可据此设计实验。(4)据表格信息可知，菌株A在无NH4NO3的培养基上可以生长繁殖，而菌株B在无NH4NO3的培养基上不能生长繁殖，而且Ⅰ平板中，A的透明圈大于B的，能说明A菌株分解石油能力强于B菌，因此对于贫氮且被石油污染的土壤来说，治理石油污染应该选用菌株A。
8．(2021·全国乙卷)工业上所说的发酵是指微生物在有氧或无氧条件下通过分解与合成代谢将某些原料物质转化为特定产品的过程。利用微生物发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下。
回答下列问题：
(1)米曲霉发酵过程中，加入大豆、小麦和麦麸可以为米曲霉的生长提供营养物质，大豆中的_蛋白质__可为米曲霉的生长提供氮源，小麦中的淀粉可为米曲霉的生长提供_碳源__。
(2)米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，大量分泌制作酱油过程所需的酶类，这些酶中的_蛋白酶__、_脂肪酶__能分别将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分，如将蛋白质分解为小分子的肽和_氨基酸__。米曲霉发酵过程需要提供营养物质、通入空气并搅拌，由此可以判断米曲霉属于_异养好氧__(填“自养厌氧”“异养厌氧”或“异养好氧”)微生物。
(3)在发酵池发酵阶段添加的乳酸菌属于_原核生物__(填“真核生物”或“原核生物”)；添加的酵母菌在无氧条件下分解葡萄糖的产物是_酒精和二氧化碳__。在该阶段抑制杂菌污染和繁殖是保证酱油质量的重要因素，据图分析该阶段中可以抑制杂菌生长的物质是_酒精、乳酸、食盐__(答出1点即可)。
解析：(1)大豆中含有丰富的蛋白质，可为微生物的生长繁殖提供氮源。小麦中的淀粉可以为微生物的生长繁殖提供碳源。(2)米曲霉在发酵过程中产生的蛋白酶能将蛋白质分解为小分子的肽和氨基酸，产生的脂肪酶能将脂肪分解为甘油和脂肪酸，使发酵的产物具有独特的风味。米曲霉发酵时需要利用现有的有机物且需要氧气，说明其代谢类型是异养好氧型。(3)乳酸菌没有核膜包被的细胞核，属于原核生物。酵母菌属于兼性厌氧型微生物，既可以进行有氧呼吸，也可以进行无氧呼吸，无氧呼吸的产物是酒精和二氧化碳。在发酵池中酵母菌产生的酒精能抑制杂菌的生长，乳酸菌产生的乳酸使发酵液呈酸性也能抑制杂菌的生长，同时往发酵池中添加的食盐也能抑制杂菌的生长。
9．(2021·广东卷)中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜(甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖)为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。
回答下列问题：
(1)为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为_唯一碳源__，并不断提高其浓度，经多次传代培养(指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养)以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用_稀释涂布平板__的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有_诱变育种、基因工程育种__等。(答出两种方法即可)
(2)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是_盐浓度为60_g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制__。(答出两点即可)
(3)研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中_氧气(O2或溶解氧)__可能是高密度培养的限制因素。
(4)菌株H还能通过分解餐厨垃圾(主要含蛋白质、淀粉、油脂等)来生产PHA，说明其能分泌_蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等__。
解析：(1)根据题意分析，该实验的目的是提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，结合微生物的代谢需求，其液体培养基应该以蔗糖作为唯一碳源 。并不断提高其浓度，经多次传代培养(指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养)以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用稀释涂布平板的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。 此外，选育优良菌株的方法还有诱变育种、基因工程育种等。(2)已知，菌株H具有嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，因此当培养基盐浓度为60 g/L，pH为10时，菌株H可正常持续发酵60 d以上，而盐浓度为60 g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制，故该系统不需要灭菌。(3)分析题意，扩大培养时，营养物浓度、温度、pH等条件适宜，而发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中氧气不足，使菌种进行无氧呼吸产生乙醇，即氧气(O2或溶解氧)是限制高密度培养的重要因素。(4)根据酶的专一性可知，菌株H之所以能通过分解主要含蛋白质、淀粉、油脂等的餐厨垃圾来生产PHA，是因为其能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
10．(2021·湖南卷)大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12～38 kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。回答下列问题：
(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶　。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以_纤维素__为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于_选择__培养基。
(2)配制的培养基必须进行灭菌处理，目的是 为了杀死培养基中的所有微生物(微生物和芽孢、孢子)　。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是_不接种培养(或空白培养_)__。
(3)简要写出测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数的实验思路_将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1_mL涂布到若干个平板(每个稀释度至少涂布三个平板)，对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数__。
(4)为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37 ℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株_C__，理由是_接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大___。
菌株 秸秆总重(g) 秸秆残重(g) 秸秆失重(%) 纤维素降解率(%)
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
解析：(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上进行培养；培养基从功能上分类可分为选择培养基和鉴别培养基，故该培养基从功能上分类属于选择培养基。(2)配制的培养基常用高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)，即将培养基置于压力100 kPa、温度121 ℃条件下维持15～30分钟，目的是为了杀死培养基中的所有微生物(微生物和芽孢、孢子)。为检测灭菌效果可对培养基进行空白培养，即将未接种的培养基在适宜条件下培养一段时间，若在适宜条件下培养无菌落出现，说明培养基灭菌彻底，否则说明培养基灭菌不彻底。(3)为测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数，常采用稀释涂布平板法，在适宜的条件下对大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌进行纯化并计数时，对照组应该涂布等量的无菌水。将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1 mL涂布到若干个平板(每个稀释度至少涂布三个平板)，对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数。(4)测定酶活力时可以用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。由表格可知，在适宜的条件下，C菌株在相同的温度和时间下，秸秆失重最多，纤维素降解率最大，说明该菌株的纤维素分解菌产生的纤维素酶活力最大。第2课时　微生物的选择培养和计数
知识点一　选择培养基与鉴别培养基
基础知识·双基夯实
1．概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2．实例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基以_尿素为唯一氮源__。
3．原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
活 | 学 | 巧 | 练
1.选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。( × )
2．可以筛选出石油降解菌的培养基为鉴别培养基。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？
提示：应从富含纤维素的环境中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
2．根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？
提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。
课内探究·名师点睛
1．选择培养微生物的四种方法及其实例
选择培养原理 具体处理 分离菌种
利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养 不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物
无氮培养基 分离自生固氮微生物
利用微生物(目的菌)对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者 石油作为唯一碳源的培养基 分离能消除石油污染的微生物
尿素作为唯一氮源的培养基 分离能分解尿素的微生物
在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长 加入青霉素等抗生素 分离酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌、放线菌的生长
加入高浓度的食盐 分离金黄色葡萄球菌
在高盐环境中 可分离耐盐菌，其他菌在高盐浓度下易失水而不能生存
在高温环境中 可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存
2.尿素分解菌的鉴定
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了NH3。NH3会使培养基的碱性增强，pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，则可初步说明该种细菌能够分解尿素。
3．鉴别培养基
(1)特点：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品。
(2)用途：鉴别不同种类的微生物(如可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌。若有，菌落呈现深紫色)。
典例1　选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是( D )
A．硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．异养细菌、放线菌、硝化细菌
D．自养细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
解析：不含有机物的培养基可以选择自养微生物，缺少氮元素的培养基可以选择固氮微生物，含尿素(不含其他氮源)的培养基可以选择能分解尿素的微生物。
能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌。原则上选择培养基只允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。
变式训练 (2023·锦州期末)大肠杆菌的含量是国家饮用水重要检测指标之一，如图所示，用滤膜法和伊红—亚甲蓝琼脂培养基(EMB培养基)测定水中大肠杆菌含量的大致流程为准备工作→用滤膜过滤待测水样→将滤膜转移到EMB培养基上→培养→观察并统计菌落数目。下列叙述正确的是( C )
伊红—亚甲蓝琼脂培养基配方
基础培养基　　　　　　　100 mL　20%乳糖溶液 2 mL　2%伊红水溶液 2 mL　0.5%亚甲蓝水溶液 1 mL　琼脂 1.5 g
A．EMB培养基从用途来分属于选择培养基
B．配方的基础培养基中除水外还必须含有无机盐和碳源
C．观察并统计菌落数目时，应选择培养基上的深紫色菌落进行计数
D．选用滤膜孔径的大小不会影响实验结果
解析：EMB培养基从用途来分属于鉴别培养基，A错误；配方的基础培养基中除水外还必须含有无机盐和氮源，乳糖可作为碳源，B错误；大肠杆菌在EMB培养基上可呈深紫色，并有金属光泽，观察并统计菌落数目时，应选择培养基上的深紫色菌落进行计数，C正确；选用滤膜孔径过大可能会导致实验结果比实际值偏小，D错误。
知识点二　微生物数量测定方法分析
基础知识·双基夯实
一、微生物的选择培养
1．菌液稀释
(1)将10 g土样加入盛有_90__mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，得到稀释10倍的菌液。
(2)取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，得到稀释102倍的菌液，依次等比稀释。
2．稀释涂布平板法的操作步骤
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
↓
取菌液：用移液枪取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面
↓
涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
↓
涂布平板：用涂布器将_菌液__均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
3．待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
4．结果：在涂布有合适浓度菌液的平板上观察到分离的单菌落。
二、微生物的数量测定
1．常用方法：_稀释涂布平板法__和显微镜直接计数法。
2．稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目
(1)为了保证结果准确，同一稀释度下，应至少设3个平板，一般选择菌落数在_30～300，适于计数__的平板进行重复计数，并取平均值。
(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，因为_当两个或多个细胞连在一起时__，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
3．利用显微镜进行直接计数
(1)工具：特定的细菌计数板或血细胞计数板。
(2)统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
特别提醒：显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，因此一般用来统计总菌数。但是，通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
活 | 学 | 巧 | 练
1.用平板划线法培养计数，应选择菌落数在10～100的平板。( × )
2．利用稀释涂布平板法统计菌落数目的理论依据是当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
1.为什么一般选择菌落数为30～300的平板进行计数？
提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。
2．稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
3．在稀释涂布平板法中，为何需至少涂布3个平板？
提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
4．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。(或：可以防止培养时间不足而导致遗漏菌落。)
课内探究·名师点睛
1．微生物数量测定方法
微生物数量测定的常用方法有稀释涂布平板法、显微镜直接计数法等。二者的比较如下表所示：
项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法(间接计数法)
原理 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计数一定容积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌
主要用具 显微镜、细菌计数板(或血细胞计数板) 培养基
计数数据 菌体本身 培养基上的菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 死菌、活菌都计算在内 操作较复杂，有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数 每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数 ÷涂布液体积
　　2.平板划线法与稀释涂布平板法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
分离单菌落的原理 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落
特点 可以分离得到单菌落，且操作简单，但不宜计数 可以分离得到单菌落，可以计数，但操作复杂
典例2　(2022·长春联考)平板划线法和稀释涂布平板法是纯化微生物的两种常用方法，下列描述正确的是( D )
A．都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面进行连续划线的操作
C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养
D．都是在固体培养基上进行的，都需要在酒精灯火焰旁进行接种
解析：平板划线法不需要进行梯度稀释，A、B均错误；稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液滴加到固体培养基的表面，然后用涂布器将菌液均匀涂布在培养基表面，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法都需要形成单菌落，都必须在固体培养基上进行接种，且均需无菌操作，都需要在酒精灯火焰旁进行接种，D正确。
稀释涂布平板法计数的几个注意事项
(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)要设置对照实验，且一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。
(3)计数时机：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
(4)用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
变式训练 下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法的描述不正确的是( C )
A．利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌
B．两种计数方法，其统计值与实际值相比，均有差异，但差异原因不同
C．两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
D．当菌落数目稳定时，一般选取菌落在30～300的且差异不大的平板进行计数
解析：显微镜直接计数法只能看到细菌，无法区分死菌和活菌，A正确；稀释涂布平板法计数中，当多个细菌连在一起时，平板上观察到的往往是一个菌落，故而统计值比实际值小，显微镜直接计数法不能区分死菌和活菌，故测定的微生物数量往往大于实际的活菌数，因此两种计数方法的统计值与实际值相比均有差异，但差异原因不同，B正确；稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征，而不是微生物的形态特征，显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征，C错误；当菌落数目稳定时，一般选取菌落在30～300的且差异不大的平板进行计数，D正确。
知识点三　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
基础知识·双基夯实
1．分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成_脲酶__。利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．操作步骤
(1)土壤取样
土壤中的微生物主要分布在距地表3～8 cm的土壤层(酸碱度接近中性)，取样时用的铁铲和取样袋使用前都需要灭菌。
(2)样品的稀释
为保证获得菌落数为30～300的平板进行计数，可将稀释倍数为1×103～1×107的稀释液分别涂布到平板上培养。
(3)微生物的培养与观察
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d(放线菌一般在25～28 ℃的温度下培养5～7 d；霉菌一般在25～28 ℃的温度下培养3～4 d)。在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取_菌落数目稳定__时的记录作为结果。
活 | 学 | 巧 | 练
1.分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。( × )
2．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿的皿盖。( × )
3．利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数。( × )
合 | 作 | 探 | 究
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
(3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到了以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
平板菌落稀释度 平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
提示：(1)不可靠。为增强实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布至少3个平板，统计结果后计算平均值。
(2)不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，需重新实验，而不能简单地舍弃。
(3)105的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30～300，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108。
课内探究·名师点睛
1．实验设计流程
2．结果分析与评价
内容 现象 结论
有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染
选择培养基中菌落数偏高 被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高 培养基中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作 得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功
重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近
典例3　如图为土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验中样品稀释示意图。据图分析，下列叙述正确的是( C )
A．3号试管的稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要多
解析：分析题图可知，3号试管的稀释倍数为104倍，A错误；4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数不一定恰好为5号试管的10倍，B错误；5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(个)，C正确；在固体培养基上可能存在两个或多个菌体形成一个菌落的情况，因此用稀释涂布平板法得到的结果往往会比实际活菌数目少，D错误。
变式训练 分解尿素的微生物广泛存在于农田等土壤中，下列关于对分解尿素的微生物进行分离和计数的操作正确的是( C )
A．分解尿素的微生物含有脲酶，因此配制培养基时应选择包括尿素在内的多种物质作为氮源
B．培养基中添加酚红作为指示剂，培养后，培养基pH会降低，可使指示剂变红色
C．在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格
D．计数时，在同一稀释度下，任取3个平板对其中的菌落数进行统计，取其均值即可
解析：分解尿素的微生物含有脲酶，配制分解尿素的培养基时应以尿素作为唯一氮源；培养基中添加酚红作为指示剂，培养后，细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，培养基的碱性增强，pH升高，可使指示剂变红色；为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
不能理解“多次划线”与“逐步稀释分散成单菌落”的关系
平板划线法中通过“多次划线”操作，达到“逐步稀释分散成单个菌落”的结果。具体分析如下：
(1)通过每次划线稀释菌种，线条末端菌体数少于线条首端。
(2)每次划线前灼烧接种环，杀死接种环上的微生物，保证下一次划线的菌种来自上一次划线的末端。再次通过划线稀释菌种，依次类推，得到单个菌落。
典例4　下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的划线操作。下列叙述中错误的是( C )
A．甲图中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂菌液
B．甲、乙两图的操作中只有甲可以用于微生物的计数
C．乙图中接种环需要灼烧5次
D．乙图中连续划线的起点是上一次划线的末端
解析：甲图中采用了稀释涂布平板法，涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能涂菌液，A项正确；乙图的操作对应平板划线法，无法用于微生物的计数，B项正确；乙图平板中划了5个区域，因此操作过程中接种环需要灼烧6次，C项错误；乙图中每次划线的起点是上一次划线的末端，D项正确。
学 | 霸 | 记 | 忆
1.选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
3．为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
4．当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
5．稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( A )
①加尿素　②不加尿素　③加琼脂　④不加琼脂　⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦加硝酸盐　⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑧ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑦ D．①④⑥⑦
解析：要分离分解尿素的细菌应以尿素为唯一氮源，①正确、 ②错误；分离土壤中分解尿素的细菌用固体培养基，需加入琼脂，③正确，④错误；培养基中需要加碳源即葡萄糖，⑤正确，⑥错误；不需要其他氮源，故不加硝酸盐，⑦错误，⑧正确。故符合题意的有①③⑤⑧，A正确。
2．用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。原因是( C )
A．平板上的一个菌落就是一个细菌
B．菌落中的细菌数是固定的
C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D．此方法统计的菌落数一定与实际的活菌数相同
解析：用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，偶尔会来自两个或更多个活菌。
3．请分析以下材料，并回答问题：
材料一：硝化细菌是一类能进行化能合成作用的细菌，包括亚硝酸细菌和硝酸细菌两个菌群，这两个菌群通常生活在一起。亚硝酸细菌可将氨氧化成亚硝酸，硝酸细菌可将亚硝酸氧化成硝酸，氨和亚硝酸分别是亚硝酸细菌和硝酸细菌的唯一能源。
材料二：可利用以下两种选择培养基，通过振荡培养从土壤中分离得到较纯净的硝酸细菌和亚硝酸细菌。
1号选择培养基 2号选择培养基
(NH4)2SO4 NaNO2
NaCl MnSO4
FeSO4 Na2CO3
K2HPO4 K2HPO4
MgSO4 MgSO4
CaCO3 NaH2PO4
蒸馏水 蒸馏水
(1)2号培养基中主要起选择作用的物质是_NaNO2__；该培养基中亚硝酸细菌不能生长繁殖的主要原因是_缺乏亚硝酸细菌生长繁殖所需的唯一能源物质氨__。
(2)硝化细菌属于_好氧__(填“好氧”或“厌氧”)细菌。
(3)用1号培养基可分离得到较纯净的亚硝酸细菌，是因为NH达到一定浓度后会抑制硝酸细菌的生长繁殖。若要探究抑制硝酸细菌生长繁殖的NH浓度，可在2号培养基中加入_琼脂__和不同浓度的_(NH4)2SO4(或NH)__，制备多组培养基，利用_稀释涂布平板__法将等量稀释度相同且适宜的纯净硝酸细菌菌液分别接种于各组培养基中，培养一段时间后统计培养基中的_菌落__数。
解析：材料一是回答(1)(2)(3)的依据；对材料二的分析应从表中成分的分析着手。第3节　发酵工程及其应用
课标要求
1．概述发酵工程及其基本环节。
2．说明发酵工程在生产上有重要的应用价值。
核心素养
1．科学思维——发酵工程基本环节分析。
2．社会责任——认同发酵工程是在传统发酵技术的基础上发展起来的，它实现了发酵食品、药物等的工业化生产，极大地改善了人们的生活。
知识点一　发酵工程的基本环节
基础知识·双基夯实
发酵工程一般包括_菌种的选育__，扩大培养，培养基的配制、_灭菌__，接种，__发酵__，产品的分离、提纯等方面。
1．选育菌种：性状优良的菌种可以从_自然界__中筛选出来，也可以通过_诱变育种__或_基因工程育种__获得。
2．扩大培养：工业发酵罐的体积很大，接入的菌种总体积也较大，因此在发酵之前还需要对菌种进行_扩大培养___。
3．配制培养基：在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。培养基的配方要经过_反复试验__才能确定。
4．灭菌：发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。因此，_培养基__和_发酵设备__都必须经过严格的灭菌。
5．接种：扩大培养的菌种和灭菌后的__培养基__加入发酵罐中。大型发酵罐有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制。
6．发酵罐内发酵：在发酵过程中，要随时检测培养液中的_微生物数量__、 _产物浓度__等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的_营养组分__，要严格控制_温度__、_pH__和溶解氧等发酵条件。
7．分离、提纯产物：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用_过滤__、_沉淀__等方法将菌体分离和干燥得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的_提取__、_分离__和_纯化__措施来获得产品。
活 | 学 | 巧 | 练
　　1.发酵工程利用的菌种都是从自然界中筛选出来的。( × )
2．发酵工程的中心环节是选育菌种。( × )
3．发酵工程中要对培养基进行灭菌，发酵设备不用灭菌。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.利用酵母菌进行酒精发酵过程中为什么要“先通气后密封”？
提示：“通气”的目的是使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，“密封”的目的是使酵母菌进行酒精发酵产生酒精。
2．啤酒生产中，发酵是重要环节，发酵后期，如果密封不严，会使啤酒变酸，你知道这是发生了什么变化吗？
提示：醋酸菌是一种好氧菌，若发酵罐密封不严，酒精就会在醋酸菌的作用下被氧化产生乙醛，最后变为乙酸。
课内探究·名师点睛
1．对发酵工程概念的理解
原理 发酵原理和工程学原理
所用生物 常规菌种、基因工程改造的“工程菌”菌种、诱变育种获得的菌种等
过程
实质 利用微生物进行产品生产
产物 通过微生物的大量繁殖获得所需产品、次生代谢物和菌体本身
　　2.发酵工程基本环节分析
典例1　某高校采用下图所示的发酵罐进行葡萄酒主发酵过程的研究，下列叙述错误的是( B )
A．夏季生产果酒时，常需对罐体进行降温处理
B．乙醇为挥发性物质，故发酵过程中空气的进气量不宜太大
C．正常发酵过程中罐内的压力不会低于大气压
D．可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵
解析：A对：利用酵母菌进行酒精发酵时，一般将温度控制在18～30 ℃，因此夏季生产果酒时，需要对发酵罐体进行降温处理。B错：发酵过程中，进气口阀门应该关闭，以保证发酵罐的无氧环境，使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精。C对：正常发酵过程中，由于酵母菌进行无氧呼吸产生CO2，所以发酵罐内的压力增大，高于大气压。D对：葡萄酒的发酵过程消耗葡萄糖，所以可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵。
变式训练 发酵工程在工业生产上得到广泛应用，其生产流程如图所示。结合赖氨酸或谷氨酸的生产实际，下列说法错误的是( D )
A．①为诱变育种，②为提取、分离和纯化等
B．赖氨酸或谷氨酸的生产过程中为使产物源源不断地产生，可及时添加必需的营养组分
C．由于赖氨酸或谷氨酸的发酵菌种为好氧菌，在生产过程中常需增加通氧量
D．人工控制微生物代谢的唯一措施是控制生产过程中的各种条件
解析：由题意分析可知，图中①为诱变育种，②为提取、分离和纯化，A正确；为了提高代谢产物的产量，可及时添加必需的营养组分，B正确；由于赖氨酸或谷氨酸的发酵菌种为好氧菌，因此在生产过程中常需增加通氧量，C正确；人工控制微生物代谢的措施包括改变微生物遗传特性(即选育菌种)、控制生产过程中的各种条件(即发酵条件)等，D错误。
知识点二　发酵工程的应用
基础知识·双基夯实
1．在食品工业上的应用
(1)生产传统的发酵产品，如_酱油、各种酒类__。
(2)生产各种各样的食品添加剂，如通过_黑曲霉__发酵制得的柠檬酸，由_谷氨酸棒状杆菌__发酵生产的味精。
(3)生产酶制剂，如α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶等。
2．在医药工业上的应用
_基因__工程、__蛋白质__工程等的广泛应用给发酵工程制药领域的发展注入了强劲动力。
3．在农牧业上的应用
(1)生产微生物肥料。微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的_有机酸__、_生物活性物质__等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长，常见的有_根瘤菌肥__、_固氮菌肥__等。
(2)生产微生物农药。微生物农药是利用_微生物__或_其代谢物__来防治病虫害的。微生物农药作为_生物防治__的重要手段，将在农业的_可持续发展__方面发挥越来越重要的作用。
(3)生产微生物饲料。微生物含有丰富的_蛋白质__。以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即_单细胞蛋白__，用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。
4．在其他方面的应用
发酵工程正渗透到几乎所有的工农业领域，在助力解决_粮食__、_环境__、_健康__和_能源__等方面的重大问题上，作出了越来越大的贡献。
活 | 学 | 巧 | 练
1.利用微生物农药防治农林虫害属于化学防治。( × )
2．微生物饲料主要是利用发酵工程生产的微生物的菌体。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
1.微生物肥料使作物增产的原理是什么？
提示：微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质能增进土壤肥力、改良土壤结构，促进植物生长。
2．微生物农药防治农林害虫的原理是什么？
提示：微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。
课内探究·名师点睛
1．啤酒发酵的过程及内容
2．“精酿”啤酒与“工业”啤酒的区别
典例2　食品工业是微生物最早开发和应用的领域，利用发酵过程生产的食品比比皆是，下列有关叙述错误的是( B )
A．黑霉菌产生的蛋白酶可以将大豆中的蛋白质分解成肽和氨基酸
B．利用谷物酿制白酒时，酵母菌只需要进行无氧呼吸即可，所以整个发酵过程需要隔绝空气进行
C．利用乳酸链球菌可以提取乳酸链球菌素制作防腐剂
D．味精的生产需要谷氨酸棒状杆菌经过发酵先产生谷氨酸
解析：酵母菌是兼性厌氧微生物，在发酵初期，需要向发酵罐内通气，促进酵母菌大量繁殖，增加酵母菌菌种数量，之后再进行密闭，有利于酵母菌进行无氧呼吸产生酒精。
变式训练 我国是世界上啤酒生产和消费大国。啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制成的。啤酒生产需经过制麦、糖化、发酵等主要环节。糖化主要是将麦芽中的淀粉等有机物水解为小分子的过程。主要工艺流程如图所示，下列关于啤酒发酵的叙述，错误的是( A )
A．糖化采用的温度越高，淀粉水解速度越快
B．啤酒中的酒精是糖类经酵母菌无氧呼吸产生的代谢产物
C．在酿造啤酒过程中，酵母菌进行了有氧呼吸和无氧呼吸
D．酵母不能直接利用淀粉，需要淀粉酶等将淀粉转化成酵母可利用的糖
解析：糖化采用的温度适宜，淀粉水解速度快，如果温度过高，酶失活反应速度下降，A错误；酵母菌无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，故啤酒中的酒精是糖类经酵母菌无氧呼吸产生的代谢产物，B正确；在酿造啤酒过程中，酵母菌开始进行有氧呼吸繁殖增加数量，后酵母菌进行无氧呼吸产生酒精，C正确；酵母菌细胞呼吸的底物为葡萄糖，不能直接利用淀粉，需要淀粉酶等将淀粉转化成酵母菌可利用的糖，D正确。
传统发酵技术与现代工业发酵在很多方面存在差异，总结如下：
项目 传统发酵技术 现代工业发酵
概念 直接利用原料中存在的天然微生物或前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术 利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品
菌种来源 来源于空气、蔬菜、面团发酵物等，菌种不纯 选育的纯菌种，可从自然界中分离，也可利用工程技术改造获得
过程 无菌种选育、扩大培养和接种，无严格的灭菌等 菌种选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵、产品的分离和提纯
发酵条件控制 通过微生物自身的代谢调节pH，通过充气口、排气口及其他人工措施调节溶解氧 通过计算机控制系统，对发酵过程中的温度、pH、溶解氧等进行监测和控制
应用 果酒、果醋的制作，腐乳、泡菜的制作等 应用于食品工业、医药工业、农牧业等
典例3　下列有关传统发酵技术与现代工业发酵的描述，正确的是( B )
A．传统发酵技术与现代工业发酵都需要进行严格的无菌操作，防止杂菌的污染，如都要进行培养液的灭菌
B．传统发酵技术对发酵条件的控制主要通过人工控制，而现代工业发酵对发酵条件的控制是通过计算机系统进行全面的监测和控制
C．制作泡菜的菌种是人工接种的纯的乳酸菌菌种
D．果酒制作、果醋制作以及腐乳的制作等都属于现代工业发酵
解析： 传统发酵技术与现代工业发酵都要进行无菌操作，但传统发酵技术防止发酵液污染的措施主要是进行有关发酵装置的消毒，灭菌不是很严格，传统发酵技术利用的是原料中存在的微生物，培养液是不能灭菌的，A项错误；传统发酵技术对发酵条件的控制主要是通过人工控制的，现代工业发酵对发酵条件的控制是通过计算机系统自动进行监测和控制的，B项正确；制作泡菜属于传统发酵技术的应用，菌种来源于附着在原材料上的天然的乳酸菌，不需要接种，C项错误；果酒制作、果醋制作以及腐乳制作属于传统发酵技术的应用，D项错误。
学 | 霸 | 记 | 忆
1.性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。
2．发酵工程所用的菌种大多是单一菌种。
3．发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵。
4．如果发酵产品是微生物菌体可采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥得到产品；如果发酵产品是微生物的代谢物可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
5．发酵工程的产品主要包括微生物的代谢产物、酶及微生物的菌体。
1．下列关于通过发酵工程生产谷氨酸的叙述，正确的是( C )
A．发酵时常采用的培养基为固体天然培养基
B．从自然界分离的野生型菌株可直接用于生产
C．当菌体生长进入稳定期时，补充营养物质可提高谷氨酸的产量
D．酵母菌和谷氨酸棒状杆菌在发酵产生产品时需提供空气或氧气
解析：通过发酵工程生产谷氨酸时所用的培养基通常由豆饼的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素等配制而成，呈液体状态，因此是液体天然培养基，A错误；从自然界分离的野生型菌株产量一般都比较低，不能满足工业上的需要，通常要用人工诱变的方法处理菌种，使其产生突变，再从中筛选出符合要求的优良菌种才能用于生产，B错误；当菌体生长进入稳定期时，要及时补充营养物质(或循环培养)以满足菌体的营养需求，提高谷氨酸的产量，C正确；酵母菌在发酵产生酒精时为无氧条件，D错误。
2．下列关于发酵工程的应用的说法，正确的是( C )
A．食品添加剂由于可以增加食品营养，改善食品的色、香、味，还可延长保存期，使用时应尽量多添加
B．加酶洗衣粉使用时用沸水洗涤效果最好
C．在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品质，使饲料保鲜，同时提高动物免疫力
D．与使用化学农药相比，使用微生物农药具有成本高、见效快、无污染的特点
解析：食品添加剂过量使用会对人体健康造成影响，甚至危及生命，不能过量使用，A项错误；加酶洗衣粉中酶制剂在最适温度下活性最高，沸水条件使酶失活，洗涤效果较差，B项错误；在青贮饲料中添加乳酸菌，通过乳酸菌的发酵，可以提高饲料品质，使饲料保鲜，同时提高动物免疫力，C项正确；与使用化学农药相比，使用微生物农药具有成本低、无污染、见效慢的特点，D项错误。
3．柠檬酸是一种广泛应用的食品酸度调节剂，它可以通过黑曲霉发酵制得。如图表示生产柠檬酸的连续发酵设置。
(1)根据物理性质，该发酵过程使用的培养基属于_液体培养基__。根据工艺流程可知，黑曲霉的新陈代谢类型属于_异养需氧__型。
(2)从加料口输入的培养基必须经过严格的_灭菌__处理。根据图示可知，发酵过程需要严格控制_温度、pH、溶解氧、通气量__和搅拌速度等条件。
(3)在大规模的发酵生产中，需要将选育出的优良菌种经过多次的_扩大培养__，当达到一定数量后再接种。
(4)此工艺流程(连续培养)以一定的速度不断添加新的培养基，同时又以同样的速度放出旧的培养基，可大大提高生产效率，道理在于_保证微生物对营养物质的需求、排出部分代谢物和使微生物保持较长时间的快速生长__。
解析：(1)据题图分析：黑曲霉发酵产生柠檬酸属于液体发酵，该发酵过程使用的培养基属于液体培养基，黑曲霉属于异养需氧型微生物。(2)微生物发酵的培养基必须进行严格的灭菌处理，发酵过程需要严格控制温度、pH、溶解氧、通气量和搅拌速度等无关变量条件。(3)优良菌种经过多次扩大培养可以应用于大规模的发酵生产中。(4)连续培养的主要原理是保证微生物对营养物质的需求、排出部分代谢物和使微生物保持较长时间的快速生长。第1节　传统发酵技术的应用
课标要求
1．简述传统发酵技术的特点，说出常见的传统发酵食品。
2．概述微生物发酵的基本原理。
3．尝试制作泡菜、果酒和果醋，说出传统发酵技术应用的优点与不足。
核心素养
1．生命观念——比较乳酸菌、酵母菌和醋酸菌的细胞结构的差异，以及代谢过程中对氧的不同需求。
2．科学探究——设计泡菜、果酒和果醋制作的实验流程，探究无菌操作和控制发酵条件的方法。
知识点一　发酵与传统发酵技术
基础知识·双基夯实
1．发酵的概念：指人们利用_微生物__，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
2．传统发酵技术
(1)实例——腐乳制作：经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的_肽和氨基酸__。多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是_毛霉__。
(2)概念：直接利用原料中_天然存在__的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。
(3)类型：传统发酵以混合菌种的固体发酵和半固体发酵为主。
活 | 学 | 巧 | 练
　　1.传统发酵技术可以利用前一次发酵保存下来的卤汁中的代谢产物进行发酵。( × )
2．微生物发酵产生了不同的代谢物使得臭豆腐具有特殊的味道。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
1.在毛霉的代谢过程中主要有哪些物质参与使豆腐发酵变成腐乳的过程？
提示：主要是毛霉产生的蛋白酶和脂肪酶参与腐乳的发酵过程。
2．从温度的角度考虑，盛夏制作腐乳会有什么不利影响？
提示：毛霉适宜生长的温度是15～18 ℃，若盛夏制作腐乳，此时气温较高，容易导致豆腐腐败变质。
课内探究·名师点睛
1．自然发酵与人工发酵的比较
项目 自然发酵 人工发酵
概念 利用自然环境中的微生物进行发酵的过程 利用人工接种的菌种进行发酵的过程
缺点 菌群不明，发酵风险大；发酵启动困难，发酵容易中止，发酵不彻底；发酵结果不可控 需要耗费大量的财力，需要由专业的技术人员完成
优点 由于发酵产生许多种类的醇、挥发性的酸，香气较为浓厚 发酵风险低，发酵结果可控
　　2.固体发酵与液体发酵的比较
项目 固体发酵 液体发酵
概念 微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式，如酿酒、酿醋 借助于液态介质完成的发酵，如味精的生产
优点 水分活度低，微生物易生长，酶活力高；发酵过程粗放，不需严格无菌条件；设备构造简单、投资少，易操作，污染少，基本无废水排放 速度快；成本低；产量高
缺点 发酵速度慢，周期长；原料成分复杂，影响产量和质量，产品少，操作强度大等 产生的其他成分很少或基本没有，需人工添加以补充其他成分
典例1　下列有关传统发酵技术的描述，正确的是( D )
A．传统发酵技术所用的菌种一般是接种的纯净的菌种
B．传统发酵技术是各种微生物在有氧条件下将大分子有机物分解成小分子有机物
C．传统发酵技术的目的是获得发酵产品或更多的微生物
D．果酒、果醋、泡菜等是传统发酵技术的产物
解析：传统发酵技术所用的菌种一般是原料中天然存在的微生物，或是前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物，A项错误；发酵是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程，包括有氧发酵和无氧发酵，B项错误；传统发酵技术的目的是生产各种发酵产品，C项错误；传统发酵技术的应用包括果酒、果醋、泡菜等的制作，D项正确。
传统发酵技术是发酵的一种类型，按照工艺流程划分，发酵可划分为现代发酵技术和传统发酵技术。
变式训练 (2023·潍坊期末)下列有关传统发酵技术的叙述，不正确的是( D )
A．传统发酵以混合菌种的固体发酵和半固体发酵为主
B．在制作腐乳的过程中，多种微生物参与了豆腐的发酵，其中起主要作用的是毛霉
C．腐乳味道鲜美的原因在于大分子蛋白质被分解成了小分子的肽和氨基酸
D．传统发酵技术都是直接利用的天然原料中的微生物
解析：传统发酵技术是指直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术，D错误。
知识点二　泡菜制作的原理和过程
基础知识·双基夯实
1．菌种：乳酸菌是_厌氧__细菌，常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。
2．发酵原理：在_无氧__条件下，乳酸菌能将葡萄糖分解成乳酸。
3．制作过程
知识拓展：用水密封泡菜坛的目的是创设无氧环境，因制作泡菜时乳酸菌是在无氧条件下进行发酵的。
活 | 学 | 巧 | 练
　　1.乳酸菌发酵产生了乳酸和CO2。( × )
2．制作传统泡菜是利用植物体表面天然的乳酸菌来进行发酵。( √ )
3．泡菜的制作前期需要通入氧气，后期应严格保持无氧条件。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.在泡菜制作的发酵过程中，为什么要经常向泡菜坛的水槽中补充水？
提示：为了保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。
2．为什么泡菜坛只能装八成满？
提示：蔬菜刚入坛时，其表面带入的微生物，主要以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌较为活跃，这些微生物进行发酵，产物中有较多的二氧化碳，因此坛内要留有一定的空间，否则发酵液可能会溢出坛外。
3．乳酸菌是厌氧菌，发酵时需控制严格的无氧环境。尝试说出泡菜制作过程中制造无氧环境的措施。
提示：①选择气密性好的泡菜坛；②盐水煮沸后冷却待用；③装坛时压实，盐水没过全部菜料；④盖上坛盖后要在坛盖边沿的水槽中注满水；发酵期间不宜开盖，并注意在发酵过程中经常向水槽中补充水。
课内探究·名师点睛
1．制作泡菜所需菌种及原理
常见类型 乳酸链球菌、乳酸杆菌
生物学分类 原核生物
分布 广泛分布于空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内
代谢类型 异养厌氧型
生产应用 制作泡菜、酸奶等
发酵原理 C6H12O62C3H6O3(乳酸)＋能量
1．乳酸菌是在无氧条件下能将葡萄糖分解成乳酸的一类细菌的总称。
2．乳酸菌是厌氧微生物，在有氧气存在时，其无氧呼吸受抑制。
3．泡菜制作的菌种来自植物体表面的天然乳酸菌。
4．抗生素能杀死乳酸菌或抑制乳酸菌的生长，所以含抗生素的牛奶不能发酵成酸奶。
2．泡菜制作的实验设计及操作
3．泡菜制作过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐含量的变化情况分析
发酵时期 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐
发酵初期 少(有氧气，乳酸菌的活动受到抑制) 少 增加(硝酸盐还原菌的作用)
发酵中期 最多(乳酸抑制其他微生物活动) 积累增多，pH下降 下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)
发酵后期 减少(乳酸积累，pH下降，抑制其活动) 继续增多，pH继续下降 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)
曲线模型
典例2　泡菜发酵的微生物主要是乳酸菌，而在发酵初期，水槽内经常有气泡产生，下列关于这些气泡产生的原因及成分的分析正确的是( C )
A．乳酸菌是兼性厌氧型微生物，初期进行有氧呼吸产生CO2；气体为CO2
B．因腌制过程中盐进入蔬菜使蔬菜体积缩小，气体被排出；气体为空气
C．发酵初期活动强烈的是酵母菌，其利用氧气进行呼吸作用，产生气体；气体为CO2
D．乳酸菌在发酵过程中产生了热量，使坛内温度升高，空气受热膨胀排出；气体为空气
解析：乳酸菌是厌氧细菌，只能进行无氧呼吸，A项错误；腌制的过程中蔬菜主要是失水而不是释放气体，B项错误；泡菜的发酵初期中有多种微生物参与，其中气体主要是酵母菌的活动产生的，C项正确；泡菜发酵液中的发酵过程产生的热不会导致坛内温度升高而使空气膨胀排出，D项错误。
变式训练 泡菜在发酵期间，由于乳酸菌的发酵作用，乳酸不断积累，因此可以根据微生物的活动情况和乳酸积累量，将泡菜发酵过程分为三个阶段。下列说法错误的是( D )
A．初期由于含有氧气且pH较高，坛内存在其他微生物的生长
B．中期由于乳酸不断积累，厌氧状态形成，乳酸菌成为优势种
C．后期由于乳酸含量继续增加，发酵速度会逐渐变缓甚至停止
D．整个发酵过程中亚硝酸盐含量不断增加，故泡菜要尽早食用
解析：初期由于含有氧气且pH较高，坛内存在其他微生物的生长，A正确；中期由于乳酸不断积累，厌氧状态形成，乳酸菌成为优势种，B正确；后期由于乳酸含量继续增加，发酵速度会逐渐变缓甚至停止，C正确；整个发酵过程中亚硝酸盐含量表现为先增加后下降的趋势，泡菜一般在腌制10天后，亚硝酸盐含量开始下降，D错误。
　　　　　　知识点三　制作果酒和果醋的原理和过程
基础知识·双基夯实
1．制作果酒
(1)菌种：酵母菌，是一类单细胞真菌，它是_兼性厌氧__微生物。
(2)发酵原理：酵母菌在_无氧__条件下进行酒精发酵，可用于酿酒等。温度是影响酵母菌生长的重要因素，酿酒酵母的最适生长温度约为_28_℃__。
2．制作果醋
(1)菌种：_醋酸菌__，属于原核生物，它是好氧细菌。
(2)发酵原理：当_O2和糖源都充足__时能通过复杂的化学反应将糖分解成乙酸，当缺少糖源时则直接将_乙醇__转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸。多数醋酸菌的最适生长温度为_30～35_℃__。
3．制作果酒和果醋的流程(以葡萄酒和葡萄醋的制作为例)
活 | 学 | 巧 | 练
1.酵母菌通过有氧呼吸可以大量繁殖，通过无氧呼吸可以产生酒精。( √ )
2．由于醋酸菌对氧气的含量相当敏感，所以在醋酸发酵过程中要始终通入氧气。( √ )
3．只有在糖源充足的情况下才能进行醋酸发酵。( × )
4．在利用葡萄发酵生产果酒的后期，加入醋酸菌即可产生醋酸。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.在果酒和果醋制作中，你认为哪些方法可防止发酵液被污染？
提示：(1)冲洗葡萄时应先冲洗再除去枝梗。
(2)榨汁机要冲洗干净并晾干。
(3)发酵瓶要清洗干净，并用70%的酒精消毒。
(4)排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖，防止杂菌污染。
2．果酒制作过程中，在不灭菌的情况下，酵母菌是如何成为优势菌种的？
提示：发酵后期在缺氧和酸性发酵液中，绝大多数微生物的生命活动受到抑制，而酵母菌可以适应这一环境成为优势菌种。
课内探究·名师点睛
果酒和果醋制作的原理
(1)酵母菌和醋酸菌的比较
项目 酵母菌 醋酸菌
生物学分类 单细胞，真核生物 单细胞，原核生物
代谢方式 异养兼性厌氧型 异养需氧型
生长繁殖的最适温度范围 18～ 30 ℃ 30～35 ℃
主要繁殖方式 出芽生殖 二分裂生殖
生产、生活应用 酿酒、发面等 制醋
(2)果酒制作与果醋制作的比较
项目 果酒制作 果醋制作
发酵菌种 酵母菌 醋酸菌
菌种来源 传统的葡萄酒酿造采用自然发酵，菌种主要是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌 空气中的野生型醋酸菌或购买醋酸菌的菌种或从食醋中分离醋酸菌
发酵原理 ①在有氧条件下：C6H12O6＋6O2＋6H2O6CO2＋12H2O＋能量②在无氧条件下：C6H12O62C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量 ①氧气、糖源都充足时：C6H12O6＋2O22CH3COOH(乙酸)＋2CO2＋2H2O＋能量 ②缺少糖源时：C2H5OH＋O2CH3COOH(乙酸)＋H2O＋能量
发酵条件 温度 一般控制在18～30 ℃ 30～35 ℃
时间 10～12 d 7～8 d
氧气 初期需氧，后期不需氧 始终需要氧
pH 最适pH为4.5～5.0 最适pH为5.4～6.0
典例3　下列对葡萄酒和葡萄醋发酵条件控制的叙述，错误的是( B )
A．葡萄汁装入简易发酵瓶时，要留有约1/3的空间
B．用清水冲洗葡萄除去污物时，应反复多次冲洗
C．制作葡萄酒的过程中，需将时间控制在10～12 d
D．制作葡萄醋的温度要比制作葡萄酒的温度高些，但时间一般控制在7～8 d
解析：制作葡萄酒所用的菌种来源于附着在葡萄皮上的野生型酵母菌，对选择的葡萄应冲洗1～2次，清除污物即可，不应反复多次冲洗，以免造成菌种流失。
1．发酵不等于无氧呼吸。发酵是通过微生物的培养来大量生产各种代谢产物的过程，包括有氧发酵(如醋酸发酵、谷氨酸发酵)和无氧发酵(如酒精发酵)。
2．葡萄酒制作过程中产生的酒精能溶解葡萄皮和籽中的色素等物质，从而决定酒的风味、色泽与质地。
3．开瓶后的葡萄酒如果密封不严，则会很快变酸。在变酸的酒的表面观察到的菌膜就是醋酸菌在液面大量繁殖而形成的。
变式训练 如图为果酒与果醋发酵的简易装置及兴趣小组设计的改进装置示意图，下列说法错误的是( C )
A．用70%左右的酒精对上述装置进行消毒后，再装入果汁
B．甲装置在酿酒过程中被杂菌污染的机会比其他两装置大
C．丙装置转为果醋发酵更容易，只需通过气阀2通气即可
D．与甲装置相比，乙装置中的气压更容易保持相对稳定
解析：上述实验中可以用70%左右的酒精对上述装置进行消毒后，再装入果汁进行发酵，目的是避免杂菌污染，A正确；甲装置在酿酒过程中需要通过拧松瓶塞排气，而其他的两个装置不需要通过拧松瓶塞排气，因此甲装置被杂菌污染的机会比其他两装置大，B正确；丙装置转为果醋发酵时，需通过气阀1通气，且需提高发酵温度，C错误；因为乙装置中的碳酸氢钠溶液能够将酵母菌发酵产生的二氧化碳吸收掉，而甲装置中的二氧化碳需要专门排放，否则会爆破，因此与甲装置相比，乙装置中的气压更容易保持相对稳定，D正确。
混淆不同微生物的代谢特点
微生物 类型 代谢类型 适宜生长条件 应用举例
酵母菌 真核生物 异养兼性厌氧型 温度：18～30 ℃；偏酸性环境 果酒发酵、面包制作
醋酸菌 原核生物 异养需氧型 温度：30～35 ℃；偏酸性环境 果醋发酵
乳酸菌 原核生物 异养厌氧型 温度：37 ℃左右；偏酸性环境 泡菜制作、酸奶发酵
腐乳的制作也应用了传统发酵技术，涉及的微生物有酵母菌、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。腐乳制作的原理是经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸。
典例4　(2023·南通海安中学月考)果酒、果醋、泡菜的制作都离不开微生物的发酵作用。下列叙述正确的是( B )
A．酵母菌是兼性厌氧微生物，所以在有氧或无氧条件下均可发酵产生果酒
B．果醋发酵时，需要始终保持充足的氧气
C．果酒制作完成后，只需升高温度即可制作果醋
D．参与泡菜制作的微生物不能用于生产酸奶
解析：果酒制作所需菌种为酵母菌，酵母菌为兼性厌氧型微生物，适宜生长繁殖的温度约为28 ℃，在有氧条件下酵母菌能够大量繁殖，在无氧条件下酵母菌能够发酵产生酒精，A错误；果醋制作所需的菌种是醋酸菌，醋酸菌为好氧细菌，适宜生长繁殖的温度是30～35 ℃，发酵过程中需要持续通入无菌空气，B正确；果酒制作完成后，将温度适当升高并通入无菌空气，才能发酵制作果醋，C错误；制作泡菜的菌种是乳酸菌，在无氧条件下可产生乳酸，乳酸菌也可用于制作酸奶，D错误。
学 | 霸 | 记 | 忆
1.发酵是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
2．乳酸菌是厌氧细菌。醋酸菌是好氧细菌。酵母菌是兼性厌氧型真菌。
3．直接利用原材料中天然存在的微生物或利用前一次发酵保存下来的微生物进行发酵、制作食品的技术称为传统发酵技术。
4．传统发酵食品的制作过程中，没有接种菌种，而是利用了天然存在的菌种。
1．制作泡菜所利用的乳酸菌最初主要来自( A )
A．所选蔬菜自身带有的
B．人工加入泡菜水中的
C．腌制过程中产生的
D．泡菜坛边沿上的
解析：乳酸菌分布广泛，在空气、土壤、植物体表和人或动物肠道内都有分布，制作泡菜所利用的乳酸菌最初来自所选蔬菜自身携带的，A正确；在制作泡菜时不需人工加入菌种，B错误；腌制过程中不可能自发产生乳酸菌，C错误；泡菜坛边沿有氧气，乳酸菌为厌氧菌，因此乳酸菌不存活，应该不含乳酸菌，D错误。
2．(2023·大同期末)下图表示果酒和果醋制作过程中的物质变化过程，下列叙述正确的是( C )
A．过程①和②都只能发生在缺氧条件下
B．过程①和③都发生在酵母菌细胞的线粒体中
C．过程③和④都需要氧气的参与
D．过程①～④所需的最适温度基本相同
解析：有氧呼吸和无氧呼吸的第一阶段相同，均发生在细胞质基质中，产物是丙酮酸，而丙酮酸产生乙醇只能发生在无氧呼吸过程中，A、B两项均错误；过程③属于有氧呼吸的第二、三阶段，第三阶段需要氧气参与，过程④是制作果醋的过程，需醋酸菌参与，醋酸菌是一种好氧细菌，因此④过程也需要氧气参与，C项正确；制作果酒时，最适温度为18～30 ℃，而制作果醋时最适温度为30～35 ℃，D项错误。
3．下列有关传统发酵技术的叙述，正确的是( C )
A．制作果酒最快捷的途径是先制果醋，再制果酒
B．酿制果醋所需的酵母菌和醋酸菌的发酵底物、条件完全相同
C．制作腐乳需利用毛霉产生的酶分解豆腐中的蛋白质等物质
D．制作果酒、果醋和腐乳过程都应防止微生物的生长、繁殖
解析：制作果酒最快捷的途径是利用酵母菌发酵，A项错误；酵母菌的发酵底物一般是葡萄糖，醋酸菌的发酵底物是葡萄糖或乙醇，B项错误；毛霉等多种微生物分泌的蛋白酶，能将蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，C项正确；制作果酒、果醋和腐乳过程都需要微生物的生长、繁殖，果酒制作利用的菌种是酵母菌，果醋制作利用的菌种是醋酸菌，腐乳制作利用的菌种是毛霉，D项错误。第2节　微生物的培养技术及应用
课标要求
1．概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求。
2．掌握无菌技术的操作。
3．掌握酵母菌纯培养的方法及步骤。
4．阐明微生物选择培养的原理。
5．概述测定微生物数量的方法。
6．进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
核心素养
1．科学思维——根据微生物的代谢类型分析培养基营养物质的组成。
2．科学探究——设计制备马铃薯固体培养基的实验步骤，并尝试运用平板划线法进行纯化酵母菌。
3．科学思维——根据微生物的代谢特征配制选择培养基。
4．科学探究——设计实验分离土壤中的尿素分解菌，并对实验结果进行分析与评价。
第1课时　微生物的基本培养技术
　　　　　　　知识点一　培养基的种类及营养要素分析
基础知识·双基夯实
1．概念：人们按照微生物对_营养物质__的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2．功能：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
3．分类
琼脂固体培养基是实验室中最常见的培养基之一。微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。
4．营养成分：一般都含有水、_碳源__(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐等营养物质。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质(如维生素、氨基酸等)以及氧气的要求。
5．某些微生物生长还需要的特殊条件
培养的微生物 需要满足的特殊条件
乳酸杆菌 培养基中添加维生素
霉菌 一般将培养基调至_酸性__
细菌 一般将培养基调至中性或弱碱性
厌氧微生物 需要提供无氧的条件
活 | 学 | 巧 | 练
　　1.培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。( × )
2．培养基中提供的碳源是无机物。( × )
3．微生物在液体培养基中生长可形成菌落。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.牛肉膏蛋白胨培养基是一种常见的细菌培养基，其中牛肉膏、蛋白胨能够提供哪些营养成分？
提示：牛肉膏、蛋白胨能够提供碳源、氮源、维生素(生长因子)和无机盐。
2．培养微生物时，培养基中是否必须有碳源和氮源？
提示：不一定，例如培养自养微生物时，一般不需要添加碳源，微生物可以利用空气中的二氧化碳；培养固氮微生物时，一般不需要添加氮源，微生物可以利用空气中氮气。
课内探究·名师点睛
1．培养基的种类、特点及用途分析
划分标准 种类 特点 用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂 观察微生物的运动
固体培养基 微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
化学成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质制备) 微生物的分类、鉴定
是否含有凝固剂(如琼脂)是区分固体培养基和液体培养基的唯一标准，含凝固剂的为固体培养基。
2．培养基营养成分的含义、作用、主要来源分析
营养物质 含义 作用 主要来源
碳源 凡能提供碳元素的物质 构成生物体细胞的物质和一些代谢物，有些也是异养生物的能源物质 无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源 凡能提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢物 无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素 是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源、酶的激活剂等 无机化合物
水 生物体内含量很高的无机物 不仅是优良的溶剂， 而且可维持生物大分子结构的稳定 从外界摄入
典例1　下列关于微生物营养的说法，不正确的是( C )
A．对异养微生物而言，牛肉膏既是碳源，又是氮源
B．生长因子是指氨基酸、维生素、碱基等不可缺少的微量有机物
C．氮源不能为微生物提供能量
D．氮源主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
解析：同一种物质可以既作为碳源又作为氮源，如牛肉膏，A正确；生长因子是指氨基酸、维生素、碱基等不可缺少的微量有机物，B正确；自然界中一些微生物如硝化细菌，可以通过氧化氨释放的能量获得生长所需能量，C错误；蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物等都含有氮元素，所以氮源主要用于合成这些含氮的化合物，D正确。
变式训练 如表是微生物培养基的成分。下列有关说法错误的是( C )
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量(g) 0.4 4.0 0.5 0.5 100 mL
A.此培养基可用来培养自养型微生物
B．此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源
C．若除去①，此培养基可培养硝化细菌
D．培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源
解析：此培养基中不含有机碳源，适合用来培养自养型微生物，A正确；此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源，B正确；硝化细菌能进行化能合成作用，但不能固氮，因此若除去①，此培养基不能培养硝化细菌，C错误；培养基中若加入氨基酸，它可作为碳源、氮源，D正确。
知识点二　无菌技术
基础知识·双基夯实
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。
概念 常用方法
消毒 使用_较为温和__的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物 煮沸消毒法：日常生活中常用的方法
_巴氏消毒法__：适用于不耐高温的液体，如牛奶
化学药物消毒法：如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等
紫外线消毒法：适用于接种室、接种箱或超净工作台等
灭菌 使用_强烈__的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 湿热灭菌：常用高压蒸汽灭菌，如培养基的灭菌
干热灭菌：适用于耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金属用具等
灼烧灭菌：适用于接种工具或其他金属用具
做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
归纳拓展：(1)芽孢是某些细菌生长到一定阶段，在细胞内形成的休眠体。孢子是某些微生物的繁殖体。
(2)与煮沸消毒法相比，巴氏消毒法的优点是在达到消毒目的的同时，营养物质损失少。
活 | 学 | 巧 | 练
　　1.无菌技术可以用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染。( √ )
2．只要是没有生物活性的材料均可进行湿热灭菌。( × )
3．消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
1.在科研和生产上，研究和应用微生物的前提是什么？在实验室中培养微生物应注意哪些问题？
提示：在科研和生产上，研究和应用微生物的前提是防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物。在实验室中培养微生物，一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面确保其他微生物无法混入。
2．对培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶常采用的灭菌或消毒方法分别是什么？
提示：分别为高压蒸汽灭菌(或湿热灭菌)、干热灭菌、灼烧灭菌、化学药物消毒、紫外线消毒、巴氏消毒。
3．常用酒精擦拭双手是预防新冠肺炎的日常防护措施之一，这是消毒还是灭菌？体积分数为70%和95%的酒精，哪种效果更好？为什么？
提示：酒精擦拭属于消毒，酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好。浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，酒精分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。
课内探究·名师点睛
1．无菌技术的主要内容
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
2．常见的灭菌和消毒方法
方法 种类 主要方法 应用范围 联系
灭菌 湿热灭菌法(以高压蒸汽灭菌法为例) 100 kPa,121 ℃的高压蒸汽灭菌锅内维持15～30 min 培养基等 ①都需借助理化性质，营造微生物难以生存的不良环境②其作用原理都是通过使蛋白质(或核酸)变性来抑制微生物生命活动或杀死微生物
干热灭菌法 放入密闭容器如干热灭菌箱，160～170 ℃加热2～3 h 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适合用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
灼烧灭菌法 酒精灯火焰灼烧 微生物接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中试管口或瓶口等
消毒 巴氏消毒法 62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃处理30 s～1 min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 日常食品、罐装食品
紫外线消毒法 30 W紫外灯照射30 min 接种室、接种箱、超净工作台
化学药物消毒法 用体积分数为70%的乙醇、碘酒涂抹，来苏水喷洒等 皮肤、伤口、动植物组织表面、空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等
典例2　(2023·长郡中学月考)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。下列关于消毒和灭菌的叙述，错误的是( B )
A．牛奶的消毒常用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法
B．水厂供应的自来水通常是经过高锰酸钾消毒的
C．用紫外灯对密闭教室消毒前，适量喷洒消毒液可强化消毒效果
D．培养基不能放入干热灭菌箱中进行干热灭菌
解析：用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法对牛奶等饮品消毒，既能杀菌，又能保持营养和风味，A正确；高锰酸钾是强氧化剂，不宜用于自来水消毒，自来水消毒常用氯气，B错误；用紫外灯对密闭空间消毒前，适量喷洒消毒液可强化消毒效果，常喷洒石炭酸，C正确；培养基应该用高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)，D正确。
变式训练 消毒和灭菌是微生物培养中常用的操作方法。下列说法正确的是( A )
A．微生物接种技术的方法各不相同，但核心都是要防止杂菌污染，保证培养物的纯度
B．在100 ℃煮沸5～6分钟属于灭菌方法，可杀死微生物细胞和一部分芽孢
C．在灭菌后倒平板前，加入一定量的缓冲液以调节培养基的pH
D．高压蒸汽灭菌，只有当压力表的压力降到一个标准大气压时，才能打开盖子
解析：防止杂菌污染，保证培养物的纯度，是微生物接种技术的核心；在100 ℃煮沸5～6分钟属于煮沸消毒，不属于灭菌；为了防止污染，调节培养基的pH应在灭菌之前；高压蒸汽灭菌，只有当压力表的压力降到0时，才能打开盖子。
知识点三　微生物的纯培养
基础知识·双基夯实
1．相关概念
(1)培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。
(2)纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体。
(3)纯培养：获得纯培养物的过程。
2．酵母菌的纯培养
(1)原理：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。采用_平板划线法__和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(2)方法步骤
a．制备培养基
b．接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
平板划线的操作步骤如下：
c．培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和_一个未接种__的平板倒置，放入28 ℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24～48 h。
活 | 学 | 巧 | 练
1.微生物的纯培养就是不含有代谢废物的微生物培养物。( × )
2．倒平板操作中，等待平板冷却凝固后，要将平板倒置。( √ )
3．平板划线操作中，划完一个区域后要将接种环灼烧，再划下一个区域。( √ )
4．把一个不接种的培养基放在相同条件下培养可检验培养基的灭菌是否合格。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
1.平板划线操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环或接种针，其目的分别是什么？
提示：划线接种前灼烧是杀死接种环上可能存在的微生物，其后每次划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌种。划线结束后灼烧，能及时杀死接种环或接种针上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。
2．接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？
提示：培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。
课内探究·名师点睛
1．微生物纯培养的操作步骤
2．倒平板操作步骤
3．平板划线法操作步骤
典例3　(2023·运城联考)下列有关平板划线操作的叙述，正确的是( B )
A．用接种环蘸取菌液后需要立即塞上棉塞
B．待灼烧灭菌的接种环冷却后再进行划线
C．划线结束后要形成首尾相连的环形圈
D．每次划线都要在菌液中蘸取一环菌液
解析：用接种环蘸取菌液后，要将试管口再次通过火焰灭菌后再塞上棉塞，A错误；待灼烧灭菌的接种环冷却后再进行划线，B正确；划线结束后最后一次划线不能和第一次划线相连，C错误；只在第一次划线时蘸取一环菌液，后续的划线不需要再蘸取菌液，D错误。
变式训练 如图是倒平板的操作，下列相关叙述错误的是( D )
A．正确的操作顺序是丙→乙→甲→丁
B．甲应在酒精灯火焰附近进行
C．此培养基不可能为液体培养基
D．完成甲后应快速进行丁操作
解析：结合倒平板的操作步骤可知，正确的操作顺序为丙→乙→甲→丁，A正确；甲在酒精灯火焰附近进行可以避免杂菌污染，B正确；图示操作中的培养基是固体培养基，C正确；等待培养基冷却凝固后，再将培养皿倒过来放置，D错误。
一、倒平板操作的注意事项
1．培养基灭菌后需要冷却至50 ℃左右时才能倒平板。温度过高，培养基凝固后皿盖上冷凝水过多，落入培养基，造成污染；温度过低，培养基又会凝固。
2．将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
3．培养基冷却凝固后，要将培养皿倒置的原因：防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
4．在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板应弃用，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
5．整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
二、平板划线操作的注意事项
1．蘸取菌液及每次划线之前都需灼烧接种环，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的不同。
项目 蘸取菌液前灼烧 每次划线前灼烧 划线结束灼烧
目的 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 灼烧杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种均来自上次划线的末端 杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者
2.灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液或进行划线，以免温度太高，杀死菌种。
3．在做第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的末端开始划线，这样才能使菌体的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个菌体繁殖而来的菌落。
4．最后一次的划线不要与第一次的划线相连。
5．划线时用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
典例4　关于平板划线操作的叙述，错误的是( C )
A．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种
C．第二次划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
D．划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种
解析：平板划线操作中接种环蘸取菌液前灼烧的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前都要灼烧接种环，是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种均来自上次划线的末端；划线结束后仍需灼烧接种环，是为了及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者；在第二次划线时，接种环上的菌种来源于第一次划线的末端。
学 | 霸 | 记 | 忆
1.各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。
2．获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
3．消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
4．灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
5．由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
6．菌落是分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
1．微生物的实验室培养可采用高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)、酒精擦拭、火焰灼烧等不同的灭菌或消毒方法，这些方法可依次用于处理( C )
A．接种针、手、培养基 B．器皿、接种针、手
C．培养基、手、接种针 D．菌种、手、接种针
解析：高压蒸汽灭菌法(湿热灭菌)通常用于培养基的灭菌；用酒精擦拭双手是用化学试剂进行消毒的方法；火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物接种工具的灭菌，如接种针、接种环等。
2．如图为平板划线法接种的示意图。观察或比较各种细菌菌落形态的最佳区域是( D )
A．①　　 B．②　　
C．③　　 D．④
解析：由题图可知，该平板上的划线顺序为①→②→③→④，观察或比较各种细菌菌落形态的最佳区域是④，故选D。
3．回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是_蛋白胨__(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是_不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同__。硝化细菌在没有碳源的培养基上_能够__(填“能够”或“不能”)生长，原因是_硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源__。
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板_倒置__(填“倒置”或“正置”)。
(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是_在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征__。
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过_灭菌__处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
解析：(1)能同时提供碳源、氮源的成分必须同时含有碳和氮两种元素，蛋白胨、葡萄糖和NaNO3中，只有蛋白胨同时含有这两种元素。不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同，所以在配制培养基时，在分装前必须调节pH。硝化细菌能够进行化能合成作用，即能够利用化学反应产生的化学能固定外界的CO2，所以能够在没有碳源的培养基上生长。
(2)用平板培养细菌时，为防止培养基冷凝后形成的水滴滴落在培养基上污染培养基，要将平板倒置。
(3)通常根据菌落的形状、大小、颜色等特征初步区分不同种的微生物，因为不同微生物的菌落的形状、大小、颜色、凹凸情况等不同，且在一定的培养条件下微生物的菌落特征是稳定的。
(4)为防止污染环境，使用后的培养基在丢弃前需进行灭菌处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。

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