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1．(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( C )
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接
解析： 酶3切割后得到的是平末端，应该用T4DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。故选C。
2．(2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( D )
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
解析： 若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。故选D。
3．(2023·浙江卷，19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( B )
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
解析： 分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合在Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3－GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。故选B。
4．(2022·山东卷，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( B )
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析：低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
5．(2019·北京卷)甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株，再将二者杂交后得到F1，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种。以下对相关操作及结果的叙述，错误的是( D )
A．将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞
B．通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定
C．调整培养基中植物激素比例获得F1花粉再生植株
D．经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体
解析： 基因工程中需在体外先将目的基因与带有标记基因的载体结合，再将其导入受体细胞，A项正确；在个体生物学水平上，可通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定，B项正确；在花粉离体培养过程中，合理调整培养基中生长素和细胞分裂素的比例，可使愈伤组织再分化，获得F1花粉再生植株，C项正确；经花粉离体培养获得的若干再生植株一般为单倍体，D项错误。
6．(2019·江苏卷)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是( D )
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
解析： 基因工程菌中含目的基因，能通过繁殖遗传给子代，A项不符合题意；经组培获得的转基因植株的细胞中都含目的基因，能够遗传给子代，B项不符合题意；培育得到的转基因奶牛的细胞中都含目的基因，故能遗传给子代，C项不符合题意；由题干信息可知，进行题述基因治疗时只有淋巴细胞含目的基因，生殖细胞不含目的基因，故不能遗传给子代，D项符合题意。
7．(2023·全国乙卷)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指_将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因__。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为_终止子__；②为_启动子__，其作用是_RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录__；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是_鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来__。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是_密码子具有简并性__(答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_将构建好的表达载体(含有目的基因YFP基因)导入酵母菌中进行表达__。
解析：有关密码子，考生可从以下几方面把握：①概念：密码子是mRNA上决定氨基酸的相邻的3个碱基。②种类：64种，其中有3种是终止密码子，不编码氨基酸。③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。(2)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。(3)正常情况下，GFP突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。(4)基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体(含有目的基因YFP基因)导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。
8．(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是_RNA聚合酶__。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_限制酶切割位点、标记基因、复制原点等__(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_F2和R1或F1与R2__。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_a链__(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_J－V5融合蛋白__，条带2所检出的蛋白_不是__(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
解析：基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。(1)基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′－5′，非模板链(也就是a链)是5′－3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′－3′，引物延伸的方向肯定是5′－3′，所以引物结合的单链其方向是3′－5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′－5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J－V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
9．(2022·广东卷，22)“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对 引物　，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是 作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞　，终止子的作用是 终止转录，使转录在需要的地方停下来　。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是 二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长　，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 废物的资源化　，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于 不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳　，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
解析：(1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的3′端延伸子链。(2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
10．(2022·湖南卷，22)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是 氨基酸序列多肽链　，物质b是 mRNA　。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 密码子的简并性　。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 从基因文库中获取目的基因　、 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成　和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA双链复制　。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 种类　(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏　。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路： 取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间　。
解析：(1)据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
11．(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT－PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 逆转录酶(反转录酶)　，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的 特异性核苷酸序列　来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是 退火(复性)　。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明 曾感染新冠病毒，已康复　(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明 已感染新冠病毒，是患者　。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是 获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 (检测受体能否产生S蛋白)　。
解析：(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT－PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(90～95 ℃)、复性(55～60 ℃)、延伸(70～75 ℃)，故其中温度最低的一步是复性。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭已康复，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。(4)基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建(基因工程的核心)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 (检测受体能否产生S蛋白)。
12．(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_④②③①__(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是_Taq酶(热稳定DNA聚合酶)__。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、_延伸__三步，其中复性的结果是_Taq酶从引物起始进行互补链的合成__。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与_两条单链DNA__特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指_一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术__。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
解析：(1)PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。(2)在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶(热稳定DNA聚合酶)，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是Taq酶从引物起始进行互补链的合成(引物通过碱基互补配对和单链DNA结合)。(3)DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。(4)据分析可知，PCR(多聚酶链式反应)技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
13．(2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种限制性内切核酸(或限制)酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′—羟基与5′—磷酸间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得DNA单链；TaqDNA聚合酶的作用是催化以DNA为模板的DNA子链的延伸。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是②④(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是_B__。
A. 5′—AACTATGCG——AGCCCTT—3′
B．5′—AATTCCATG——CTGAATT—3′
C．5′—GCAATGCGT——TCGGGAA—3′
D．5′—TTGATACGC——CGAGTAC—3′
解析：(1)EcoR I是一种限制性内切核酸酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。(2)DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3′—羟基和5′—磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95 ℃时，DNA受热变性后解旋为单链；TaqDNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA子链的延伸。(3)引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。(4)对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR I剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5′端应该是AATTC,3′端是GAATT，故选B。
14．(2021·广东卷)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有_从基因文库中获取、人工合成法__。(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有_盐析法、酶解法或高温变性__。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备_感受态__细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有_抗原—抗体杂交技术__。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是_有的酶失活而使反应中断__。在分子水平上，可以通过改变_基因的碱基序列__，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性以及对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
15．(2020·山东卷，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是限制性内切核酸酶和DNA连接酶,_重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列不发生 (填：“发生”或“不发生”)改变，原因是编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经逆转录(或反转录)过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为品系3，原因是品系3的Wx_mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。
解析：(1)将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出Wx基因的cDNA。(4)识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。
16．(2021·河北卷)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理(例如，收集植物组织器官异地妥善储存)，可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为_基因组文库__。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是_限制酶和DNA连接酶__。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是_便于目的基因的筛选和鉴定__。
(3)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是_农杆菌转化法__。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是_避免目的基因在自然界中的扩散__。
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的_耐性__(填“耐性”或“富集能力”)；据图2可知，对转基因植株的_茎、叶__进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是 YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水　。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于_杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用__(写出两点即可)。
解析：(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。(3)农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T－DNA可转移并插入到受体细胞染色体DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。(4)根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。(5)YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。第4节　蛋白质工程的原理和应用
课标要求
1．说出蛋白质工程崛起的缘由。
2．概述蛋白质工程的基本原理。
3．举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。
核心素养
1．科学思维——尝试通过蛋白质工程技术，根据人类需要的蛋白质结构，设计或改造某一蛋白质的设计流程。
2．社会责任——尝试运用逆向思维分析和解决问题。
知识点一　蛋白质工程的原理
基础知识·双基夯实
一、蛋白质工程
1．概念
(1)基础：蛋白质分子的_结构规律__及其与_生物功能__的关系。
(2)手段：通过_基因改造__或_基因合成__，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。
(3)目的：获得满足人类的生产和生活需求的_蛋白质__。
2．理论和技术条件：_分子生物学__、_晶体学__以及_计算机__技术的迅猛发展。
二、蛋白质工程崛起的缘由
1．基因工程的实质：将一种生物的_基因__转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的_蛋白质__，进而表现出_新的性状__。
2．基因工程的不足：基因工程在原则上只能产生自然界中_已存在__的蛋白质。
3．天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合_特定物种__生存的需要，却不一定完全符合_人类生产和生活__的需要。
4．实例：玉米中赖氨酸的含量比较低，赖氨酸合成中两种酶的_氨基酸__被替换，就可以使玉米叶片和种子中游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。
三、蛋白质工程的基本原理
1．目标：根据人们对_蛋白质__功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
2．方法：_改造基因__或_合成基因__。
3．流程：预期蛋白质功能→设计预期的_蛋白质结构__→推测应有的_氨基酸__序列→找到相对应的_脱氧核苷酸__序列(基因)或合成新的_基因__→获得所需要的蛋白质。
活 | 学 | 巧 | 练
1.蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。( × )
2．蛋白质工程能产生自然界中不存在的新型蛋白质分子。( √ )
3．实施蛋白质工程的前提条件是了解蛋白质结构和功能的关系。( √ )
4．基因工程遵循中心法则，而蛋白质工程不遵循。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.为什么蛋白质工程不是直接改造蛋白质而是通过基因改造和基因合成来完成？
提示：①任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质也是无法遗传下去的。②对基因进行改造比对蛋白质进行直接改造容易操作，难度小得多。
2．蛋白质工程的操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？
提示：基因工程操作程序的基本思路遵循中心法则，从DNA→mRNA→多肽→折叠产生蛋白质，基本上是生产出自然界中已有的蛋白质。蛋白质工程是按照相反的思路进行的，确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→基因中的碱基序列，可以创造自然界不存在的蛋白质。
课内探究·名师点睛
1．对蛋白质工程的2点说明
(1)改造对象：通过改造控制蛋白质合成的基因的结构来改造某种蛋白质的结构。
①任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。
②对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作，难度要小得多。
(2)蛋白质工程中经过处理得到的新基因与基因突变得到的新基因有较大差别：基因突变的新基因中含有不编码蛋白质的序列，而蛋白质工程中经处理得到的新基因则没有。
2．蛋白质工程的基本流程
典例1　科学家为提高玉米中赖氨酸含量，计划将天冬氨酸激酶的第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中第104位的氨基酸由天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸的含量分别提高5倍和2倍。下列对蛋白质的改造，操作正确的是( C )
A．直接通过分子水平改造蛋白质
B．直接改造相应的mRNA
C．对相应的基因进行操作
D．重新合成新的基因
解析：蛋白质工程的目的是对蛋白质进行改造，从而使蛋白质功能可以满足人们的需求。蛋白质行使功能与其高级结构密切相关，而蛋白质高级结构又非常复杂，所以直接对蛋白质进行改造非常困难，而蛋白质是由基因控制合成的，对基因进行操作却容易得多。另外，通过改造基因而改造蛋白质可以遗传，而对蛋白质直接改造，即使成功也不能遗传。
变式训练 葡萄糖异构酶(GI)在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，科学家对GI基因进行体外定点诱变，以脯氨酸(Pro138)替代甘氨酸(Gly138)，含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达，结果最适反应温度提高10～12 ℃。这属于生物工程中的( B )
A．基因工程　　　　 B．蛋白质工程
C．发酵工程 D．酶工程
解析：题中是对基因进行改造，以实现对现有蛋白质的改造，属于蛋白质工程。
知识点二　蛋白质工程的应用
基础知识·双基夯实
1．在医药工业方面的应用
(1)研发速效胰岛素类似物：科学家通过改造_胰岛素基因__使B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了_胰岛素的聚合__，研发出速效胰岛素类似物。
(2)提高干扰素的保存期：将干扰素分子上的一个
_半胱氨酸__变成_丝氨酸__，提高了干扰素的保存时间。
(3)改造抗体：将小鼠单克隆抗体上_结合抗原的区域__“嫁接”到人的抗体上，降低了诱发人体免疫反应的强度。
2．在其他工业和农业方面的应用
(1)改进酶的性能或开发新的工业用酶：利用蛋白质工程获得蛋白酶的多种_突变体__。
(2)改造某些重要的酶：利用蛋白质工程改造参与
_调控光合作用__的酶，以提高植物光合作用的效率。
合 | 作 | 探 | 究
利用蛋白质工程可以提高玉米赖氨酸含量，改造途径如下：
结果：改造后玉米叶片和种子中游离赖氨酸含量分别提高5倍和2倍。
(1)结合上述资料，可以通过何种途径提高玉米中的赖氨酸含量？
提示：改变赖氨酸合成途径中关键酶的活性，来提高赖氨酸的含量。
(2)为什么改变一个氨基酸就可以改变蛋白质的稳定性甚至某种蛋白质酶的活性？
提示：蛋白质的结构是由其氨基酸组成决定的，个别氨基酸的改变就会导致其结构的改变，从而影响到其性质和功能。
课内探究·名师点睛
典例2　新冠病毒的表面刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)与人体细胞表面的ACE2受体相互作用感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S蛋白RBD紧密结合，以干扰新冠病毒的感染。下列说法不合理的是( C )
A．LCB1的作用机理与S蛋白的抗体类似
B．LCB1可依据S蛋白的RBD结构进行设计
C．LCB1是通过细胞中原有基因表达产生的
D．可用蛋白质工程进行LCB1的设计和生产
解析：S蛋白的抗体能与S蛋白RBD特异性结合，而根据题干可知，LCB1可与S蛋白RBD紧密结合，说明LCB1的作用机理与S蛋白的抗体类似，A合理；由于LCB1可与S蛋白RBD紧密结合，故LCB1可依据S蛋白的RBD结构进行设计，B合理；由题意知，蛋白质LCB1是一种自然界中不存在的蛋白质，故不能通过细胞中原有基因表达产生的，C不合理；可用蛋白质工程进行LCB1的设计和生产，D合理。
变式训练 科学家将β－干扰素基因进行定点突变导入大肠杆菌表达，使干扰素第十七位的半胱氨酸，改变成丝氨酸，结果大大提高了β－干扰素的抗病活性，并且提高了储存稳定性。该生物技术为( B )
A．基因工程　　　　 B．蛋白质工程
C．基因突变 D．细胞工程
解析：基因工程是将符合人们要求的目的基因导入适宜的生物体内，使其高效表达，从中提取人们所需的蛋白质，或表现出某种性状，蛋白质产品仍然是天然存在的蛋白质。蛋白质工程是对控制蛋白质合成的基因进行改造，从而实现对相应蛋白质的改变，所得到的蛋白质已不是天然存在的蛋白质。题干中的操作涉及的基因显然不再是原来的基因，其合成的β－干扰素也不是天然的β－干扰素，而是经过人工改造的、符合人类需求的蛋白质，因而该生物技术为蛋白质工程。
蛋白质工程与基因工程的区别与联系
比较项目 蛋白质工程 基因工程
区别 起点 预期的蛋白质功能 目的基因
过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→获得需要的蛋白质 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
目标 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 生产非天然的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质
联系 ①都在生物体外对基因进行操作；②蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
“二看法”判断基因工程和蛋白质工程
一看对基因的操作方法—
二看合成的蛋白质种类—
典例3　中华鲟是地球上最古老的脊椎动物，被称为“活化石”。研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的水域环境，以下说法错误的是( D )
A．该工程可以定向改变蛋白质分子的结构
B．改造蛋白质是通过改造基因结构来实现的
C．改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种
D．改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质
解析：改造后的中华鲟具有新的性状，但其和现有中华鲟仍是同一物种；蛋白质工程改造的是基因，可以遗传给子代，因此改造后的中华鲟的后代也具有改造的蛋白质。
学 | 霸 | 记 | 忆
1.基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。
2．蛋白质工程并不是直接改造蛋白质分子的结构，而是通过基因操作来实现对天然蛋白质的改造。
3．蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
4．蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因改造或基因合成，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。
1．关于蛋白质工程的基本流程，下列叙述正确的是( A )
①设计预期蛋白质分子结构
②推测氨基酸序列
③预期蛋白质功能
④找出相应脱氧核苷酸序列
A．③→①→②→④　 B．④→②→①→③
C．①→②→③→④ D．③→④→①→②
解析：蛋白质工程的基本流程是：从③预期蛋白质功能出发→①设计预期的蛋白质结构→②推测应有的氨基酸序列→④找到相对应的脱氧核苷酸序列，A正确。
2．科研人员利用相关技术改变了胰岛素B链的第9位氨基酸，从而避免了胰岛素结合成无活性的二聚体形式。下列相关叙述中，不正确的是( A )
A．该过程的操作对象是胰岛素分子
B．可通过测定DNA序列确定突变是否成功
C．对胰岛素结构的改造属于蛋白质工程
D．胰岛素的本质是蛋白质不宜口服使用
解析：蛋白质工程的直接操作对象是基因，而不是蛋白质，A错误；可通过测定DNA序列确定突变是否成功，B正确；胰岛素是蛋白质，对蛋白质结构的改造属于蛋白质工程，C正确；胰岛素为蛋白质，若口服会被消化酶分解，因此胰岛素不宜口服使用，D正确。
3．猪胰岛素用于降低人体血糖浓度的效果并不明显，原因是猪胰岛素分子中有一个氨基酸与人的不同。为了使猪胰岛素能够用于临床治疗糖尿病，利用蛋白质工程对猪胰岛素分子设计的最佳方案是( A )
A．对猪胰岛素进行一个不同氨基酸的替换
B．将猪胰岛素和人胰岛素进行拼接组成新的胰岛素
C．将猪和人的胰岛素混合在一起治疗糖尿病
D．根据人的胰岛素设计制造一种全新的胰岛素
解析： 由于猪胰岛素分子中只有一个氨基酸与人的胰岛素不同，所以只需替换这一个不同的氨基酸即可。虽然根据人胰岛素分子设计一种全新的胰岛素也可以用于临床治疗，但是在分子设计和胰岛素的生产方面都存在很多的困难，所以并不是最佳方案。第2节　基因工程的基本操作程序
课标要求
1．阐明基因工程的原理和基本操作程序。
2．针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
3．尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
核心素养
1．科学思维——结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究——针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
知识点一　目的基因的筛选与获取
基础知识·双基夯实
1．目的基因
(1)概念：用于改变_受体细胞性状__或获得_预期表达产物__等的基因。
(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是_Bt抗虫蛋白基因__。
2．获取方法
特别提醒：引物是依据目的基因的已知序列设计而成的，其提供3′端，以便DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸连接。
活 | 学 | 巧 | 练
1.目的基因只能是编码蛋白质的基因。( × )
2．PCR需要的条件与细胞内DNA复制的条件完全一致。( × )
3．PCR复性时，温度一般为72 ℃。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.PCR过程中为什么需要引物？DNA链复制的方向是怎样的？
提示：DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物，能够使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
2．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。
提示：在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。
3．在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？
提示：第3轮
课内探究·名师点睛
1．目的基因
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因。
2．目的基因的获取方法
(1)从基因文库中获取。
(2)利用PCR技术扩增。
(3)通过化学方法人工合成。
3．PCR反应
(1)条件
①模板：DNA母链(目的基因所在的DNA片段)。
②酶：耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。
③两种引物：分别与两条模板链相结合。
④原料：四种脱氧核苷酸。
(2)过程
过程 说明 图解
变性 温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
(3)结果
上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
典例1　下列关于PCR反应体系中所加物质作用的叙述，错误的是( B )
A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成
B．引物使TaqDNA聚合酶能从引物的5′端延伸DNA链
C．目标DNA母链用作合成DNA复制的模板
D．四种脱氧核苷酸为PCR提供原料
解析：通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链，A正确；在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；PCR技术的原理是DNA双链复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；DNA合成的原料是四种脱氧核苷酸，D正确。
关于引物
①概念：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度一般为20～30个核苷酸。
②作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，见下图：
③ 引物类型
变式训练 下图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是( A )
A．三种方法都需要酶并均在体外进行
B．①②③碱基对的排列顺序均相同
C．三种方法均属于人工合成法
D．方法a不遵循中心法则
解析：这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制酶；方法c需要DNA聚合酶)，A正确；通过方法a得到的目的基因不含有内含子，通过方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的排列顺序不一定相同，B错误；图示a和c属于人工合成法，而b是从供体细胞的DNA中直接分离目的基因的方法，C错误；方法a遵循中心法则，D错误。
知识点二　基因表达载体的构建
基础知识·双基夯实
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中_稳定存在__，并且可以_遗传__给下一代。
(2)使目的基因能够_表达__和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图]
3．基因表达载体的构建
首先用一定的_限制酶__切割载体，使它出现一个切口，然后用_同种__限制酶或_能产生相同末端__的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用_DNA连接酶__将目的基因片段拼接到载体的切口处。
活 | 学 | 巧 | 练
1.基因工程操作的核心步骤是目的基因的获取。( × )
2．启动子位于mRNA的上游。( × )
3．基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的检测与筛选。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
分析基因表达载体模式图，回答下面问题：
1．构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？
提示：由图可知，目的基因要插入启动子和终止子之间。因为启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位；终止子位于基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确目的基因才能正常转录。
2．为什么一般不能将目的基因插入载体的标记基因中？
提示：标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。
课内探究·名师点睛
1．基因表达载体构建的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．地位：基因工程的核心步骤。
3．基因表达载体的组成
4．过程
典例2　下列有关基因表达载体的构建的说法，错误的是( B )
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子
②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止
④所有基因表达载体的构建是完全相同的
⑤必须在细胞内进行
A．②③⑤ B．①④⑤
C．①②⑤ D．③④
解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子和标记基因等，①错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子控制着转录的结束，③正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误；基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤错误。
启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
(1)启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，与终止子一样都位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止。
(2)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
变式训练 如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是( B )
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
解析：图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤；构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ；抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞；基因表达载体包括复制原点、启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
知识点三　将目的基因导入受体细胞
基础知识·双基夯实
1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内_维持稳定__和_表达__的过程。
2．目的基因导入受体细胞的方法
(1)目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入_子房__中。
Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借_花粉管通道__进入_胚囊__。
②农杆菌转化法
Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染_双子叶__植物和_裸子__植物；农杆菌的Ti质粒上的_T－DNA__能够整合到所侵染细胞的_染色体DNA__上。
Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌_Ti质粒的T－DNA__中，让农杆菌侵染植物细胞。
(2)目的基因导入动物细胞
①常用方法：_显微注射__法。
②常用受体细胞：_受精卵__。
(3)目的基因导入微生物细胞
①方法：用_Ca2＋__处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。
活 | 学 | 巧 | 练
1.将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。( √ )
2．农杆菌感染植物的机理：Ti质粒上的T－DNA可转移到植物受体细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起。( √ )
3．常用Ca2＋处理植物细胞，使细胞可以吸收周围环境中DNA。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。
提示：能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。
2．将目的基因导入动物的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？
提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。
课内探究·名师点睛
1．导入的方法
受体细胞类型 方法 说明 特点
植物细胞 农杆菌转化法 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达 经济、有效，适合于双子叶植物和裸子植物
花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达 简便、经济，我国科学家独创
动物细胞 显微注射法 含目的基因片段的表达载体受精卵的核内→将受精卵移植到雌性动物的输卵管或子宫内→使受精卵发育成转基因动物 将目的基因导入动物细胞的最有效的方法
微生物细胞 Ca2＋处理法(感受态细胞法) Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程 简便、经济、有效
2.目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别
(1)图中a细胞减数分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。
(2)图中b在进行细胞减数分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
典例3　下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是( D )
A．花粉管通道法的操作之一是用微量注射器将含有目的基因的溶液直接注入子房中
B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C．大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是我国科学家独创的一种方法
解析：花粉管通道法的操作之一是用微量注射器将含有目的基因的溶液直接注入子房中，A正确；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术，B正确；大肠杆菌最常用的转化方法是用Ca2＋处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，从而完成转化过程，C正确；我国科学家独创的方法是花粉管通道法，D错误。
在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。
变式训练 农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T—DNA插入植物基因组中。图示为利用农杆菌培育转基因植物的基本流程，请据图回答：
(1)剪除Ti质粒的某些片段、替换复制原点O与添加抗生素的抗性基因T的过程①中，需用多种限制酶处理，原因是_不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列__，需用_T4_DNA连接酶__“缝合”双链DNA片段的平末端。
(2)目的基因主要是指_编码蛋白质的基因__。由过程②形成的基因表达载体中，目的基因的上游具有_启动子__，它是_RNA聚合酶__识别和结合的部位。
(3)过程③常用_Ca2＋(CaCl2溶液)__处理使农杆菌成为感受态细胞。抗生素抗性基因T的作用是_用于鉴定和筛选导入了基因表达载体的农杆菌__。
解析：(1)Ti质粒具多种限制酶切割位点，是因为不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列。连接平末端应选用T4 DNA连接酶。(2)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。目的基因的上游具有启动子，以便于RNA聚合酶识别和结合。(3)过程③常采用Ca2＋(CaCl2溶液)处理农杆菌，以增大农杆菌细胞壁的通透性。抗生素抗性基因T用于检测受体细胞中是否含有基因表达载体。
知识点四　目的基因的检测与鉴定
基础知识·双基夯实
1．分子水平检测
(1)通过_PCR__等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。
(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行_抗原—抗体__杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。
2．个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。
活 | 学 | 巧 | 练
1.从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。( × )
2．通过PCR技术可以检测目的基因是否转录出mRNA。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
鉴定导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。
课内探究·名师点睛
1．目的基因的检测与鉴定
2．不同分子检测原理的异同
(1)检测目的基因是否插入受体DNA中、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则，只是被检测的物质不同，一个是转基因生物的基因组DNA，一个是转基因生物细胞内的mRNA。
(2)进行翻译水平的检测，通常以目的基因表达产物(蛋白质)作抗原，制备相应抗体，检测转基因生物的蛋白质，利用抗原与抗体特异性结合的原理。
(3)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
基因工程操作过程中碱基互补配对现象
基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象；第一步筛选与获取目的基因，用人工合成、PCR获取或基因文库获取，三种常用方法都涉及碱基互补配对；第二步基因表达载体的构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体，第四步利用分子杂交的方法检测(DNA、mRNA)，也都存在碱基互补配对现象。
典例4　在检测抗虫棉培育是否成功的方法中，不属于分子水平检测的是( A )
A．观察害虫吃棉叶后是否死亡
B．通过PCR技术检测棉花的染色体上是否插入了目的基因
C．检测目的基因是否转录形成mRNA
D．从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交
解析：A项属于个体水平的鉴定，不是分子水平的检测。
变式训练 运用现代生物技术，将苏云金杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为了检测实验是否成功，最简便的方法是检测棉花植株是否有( D )
A．抗虫基因　　　　 B．抗虫基因产物
C．新的细胞核 D．相应的性状
解析：将苏云金杆菌中的抗虫基因转移到棉花的细胞中，若此棉花抗虫效果明显的话，说明其体内就具有细菌的抗虫基因，因为生物的性状是由基因控制的。
知识点五　DNA片段的扩增及电泳鉴定
基础知识·双基夯实
1．实验基础
(1)PCR原理：利用了_DNA的热变性__原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的_大小和构象__等有关。
2．实验步骤
活 | 学 | 巧 | 练
1.微量移液器在使用前要先消毒。( × )
2．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
1.判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？如果没有成功应该从哪些方面分析？
提示：可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来判断。没有成功的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
2．如果没有出现扩增条带，可能的原因有哪些？
提示：模板DNA含有蛋白或含有TaqDNA聚合酶的抑制剂(如蛋白酶K、苯酚、EDTA)；TaqDNA聚合酶失活；引物出现质量问题，浓度不合适；Mg2＋浓度过低；变性温度低，变性时间短；目的序列变异等。
课内探究·名师点睛
1．操作步骤
(1)加样：按照PCR反应体系的配方将所有组分加入微量离心管中，将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在离心管底部。
(2)反应：将微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应(可参照下表内容进行设置)。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94 ℃，5 min / /
30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
(3)制胶：根据待分离DNA片段的大小，制备琼脂糖凝胶。一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。制好的凝胶放入电泳槽中，加电泳缓冲液，以没过凝胶1 mm为宜。
(4)点样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
(5)电泳：待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
(6)观察：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
2．注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
典例5　某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是( D )
A．增加模板DNA的量
B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间
D．提高复性的温度
解析：增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少反应非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，B、C错误；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。
变式训练 利用PCR检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号泳道为DNA分子量标准样液，10号泳道为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。下列分析错误的是( B )
A．PCR产物的分子大小在250 bp至500 bp之间
B．3号样品为不含目的基因的载体DNA
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号泳道的电泳结果能确定反应体系等因素对实验结果没有干扰
解析：PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp；3号PCR结果包含250～500 bp的片段，说明含有目的基因；9号PCR结果不包含250～500 bp的片段，所以不是所需的转基因植株；10号放入蒸馏水，是为了排除反应体系等因素对结果的干扰，由图可知，10号泳道的电泳结果能确定反应体系等因素对实验结果没有干扰。
细胞内DNA复制与PCR反应的比较
项目 体内DNA复制 PCR反应
不同点 时期 细胞有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期 体外随时进行
场所 活细胞内 微量离心管内
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
解旋 在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开 加热至90 ℃以上时，双链全部解开，不需解旋酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链 在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成 分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72 ℃左右
特点 边解旋边复制，半保留复制 体外迅速扩增
循环次数 受生物体自身控制 30多次
产物 完整DNA DNA片段
相同点 原料 4种脱氧核苷酸(A、G、C、T)
复制原理 严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制
模板 以DNA母链为模板
引物 都需要分别与两条模板链相结合的两种引物
典例6　PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( C )
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④　 B．①②　
C．①③　 D．②④
解析：PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：一是PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸；二是PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
学 | 霸 | 记 | 忆
1.基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的筛选与获取；(2)基因表达载体的构建；(3)将目的基因导入受体细胞；(4)目的基因的检测与鉴定。
2．PCR反应液中需要提供DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
3．PCR反应中每次循环一般可分为变性、复性、延伸三步。
4．基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子以及标记基因等。
5．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法。
6．将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2＋处理法)。
7．分子水平的检测：检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中；检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
8．目的基因的检测与鉴定还需要在个体生物学水平进行鉴定。
1．下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是( A )
A．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
解析： ⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A项正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到棉花细胞的染色体上，B项错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C项错误；基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，D项错误。
2．如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因重组进该质粒，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列( A )
A．NdeⅠ和BamHⅠ　　 B．NdeⅠ和XbaⅠ
C．XbaⅠ和BamHⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ
解析：构建基因表达载体时应将目的基因插入启动子和终止子之间。由题图可知，启动子与终止子之间存在三种限制酶切点，但XbaⅠ在质粒上有两个切割位点，因此为使PCR扩增的该基因能准确插入启动子与终止子之间，扩增时该基因两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ两种限制酶的识别序列。
3．图1为胰岛素基因结构与引物位置示意图，图2为pBR322质粒结构示意图，图中EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ和HindⅢ为限制酶，箭头或线段所指位点为对应酶切位点。研究人员欲用此质粒构建胰岛素基因的表达载体，培养能产生人胰岛素的大肠杆菌。请回答下列相关问题：
(1)若要进行胰岛素基因的扩增常采用_PCR__技术。已知DNA新链的合成方向是5′→3′，若利用图2中质粒构建基因表达载体，应该选择的引物为_引物4、引物5__。
(2)在构建基因表达载体时，选择_BamHⅠ和HindⅢ__作为分别切割质粒和目的基因的限制酶，可提高目的基因和载体的正确连接效率，其原因是_这两种酶能切割质粒和目的基因，且能得到不同的黏性末端，避免质粒和目的基因自连及反接__。
(3)成功构建的基因表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_提供RNA聚合酶特异性识别和结合的位点，驱动基因的转录__，若利用酵母菌作受体细胞生产胰岛素，与大肠杆菌相比，利用酵母菌生产胰岛素的优势有_酵母菌为真核细胞，含有内质网和高尔基体，可对核糖体合成的蛋白质进行加工__。若要检测导入酵母菌的胰岛素基因是否成功转录，常用_PCR__技术。
解析：(1)PCR(聚合酶链式反应)技术可以利用少量的DNA在短时间内获得大量的相同DNA。引物1～4的模板方向是5′→3′(从左到右)，由于DNA新链的合成方向是5′→3′，所以合成胰岛素基因只能选择引物3和引物4。同样，对于引物5～8，只能选择引物5和引物6才能合成胰岛素基因。只有引物4和引物5扩增出来的胰岛素基因含有和题图2相同的两种限制酶的识别位点，而引物3和引物6扩增出来的基因片段不含有，因此应选择的引物为4和5。(2)结合题图1和题图2，要提高目的基因和载体的正确连接效率，在构建基因表达载体时，应选择BamHⅠ和HindⅢ，因为这两种酶能同时切割质粒和目的基因，且能得到不同的黏性末端，这样就避免了质粒和目的基因自连及反接。(3)启动子的作用是提供RNA聚合酶特异性识别和结合的位点，驱动基因转录出mRNA。大肠杆菌属于原核生物，酵母菌属于真核生物，因此与大肠杆菌相比，酵母细胞含有内质网和高尔基体。利用酵母菌生产胰岛素，可对核糖体合成的蛋白质进行加工。为了检测目的基因是否成功转录，即检测是否存在胰岛素基因对应的mRNA，需用PCR技术。第3节　基因工程的应用
课标要求
1．举例说出基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面的应用。
2．认同基因工程的应用价值。
3．关注基因工程的进展。
核心素养
1．生命观念——举例说出植物基因工程、动物基因工程的成果及其给人类带来的影响。
2．社会责任——用基因工程培育优良品种或细胞产品，造福人类。
　　　　　　　知识点一　基因工程在农牧业方面的应用
基础知识·双基夯实
1．转基因抗虫植物
(1)技术方法：从某些生物中分离出具有_抗虫功能__的基因，将它导入作物中，培育出具有抗虫性的作物。
(2)实例：抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。
2．转基因抗病植物
(1)技术方法：将来源于_病毒、真菌等__的抗病基因导入植物中，培育出转基因抗病植物。
(2)实例：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。
3．转基因抗除草剂植物
(1)技术方法：将_降解或抵抗某种除草剂__的基因导入作物，可培育抗除草剂的作物品种。
(2)实例：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。
4．改良植物的品质
(1)技术方法：将_必需氨基酸含量多的蛋白质__编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。
(2)实例：转基因玉米中赖氨酸的含量比对照高30%。
5．提高动物的生长速率
(1)技术方法：将_外源生长激素__基因导入动物体内，提高动物的生长速率。
(2)实例：转基因鲤鱼。
6．改善畜产品的品质
(1)技术方法：将_肠乳糖酶__基因导入奶牛基因组。
(2)实例：乳汁中乳糖含量大大降低的转基因奶牛。
活 | 学 | 巧 | 练
1.农业害虫不会对转基因抗虫作物产生抗性。( × )
2．培育转基因抗病植物的目的基因主要来源于病毒、真菌。( √ )
3．基因工程中，要培育转基因植物和动物，选用的受体细胞都是受精卵。( × )
合 | 作 | 探 | 究
如图为通过基因工程培育抗虫棉的过程，请回答：
(1)抗虫棉能抗病毒、细菌和真菌吗？为什么？
提示：不能。抗虫基因具有专一性。
(2)对于基因工程生产的抗虫棉是否取得最后的成功，最简单的检测方法是什么？
提示：让害虫去吃转基因棉花的植株，观察害虫的生存状况。
(3)从环境保护角度出发，分析转基因抗虫棉与普通棉相比在害虫防治方面的优越性有哪些？
提示：减少了化学农药的使用量，降低了环境污染。
(4)种植转基因抗虫棉若干年后，害虫会不会对转基因抗虫棉产生抗性？为什么？
提示：会。害虫会因遗传物质发生改变产生对转基因抗虫棉的抗性。
课内探究·名师点睛
1．植物基因工程的应用
项目 外源基因类型 成果举例
抗虫转基因植物 抗虫基因：Bt抗虫蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因 抗虫的棉花、水稻、玉米
抗病转基因植物 ①抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因②抗真菌基因：几丁质酶基因、抗毒素合成基因 抗病毒的烟草、小麦、番茄、甜椒
抗逆转基因植物 抗逆基因：调节细胞渗透压基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因 抗盐碱和抗干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂的大豆
改良品质的转基因植物 优良性状基因：提高必需氨基酸含量的蛋白质编码基因、控制番茄成熟的基因、与花青素代谢有关的基因 高赖氨酸玉米、耐储存番茄、新花色矮牵牛
2.转基因植物中的目的基因
(1)目的基因都是来自其他生物的能表现出优良性状的外源基因，并不都是来自细菌、病毒等微生物，如抗冻蛋白基因来自鱼类。
(2)有的目的基因通过控制蛋白质的合成，直接控制生物的某些性状，这反映了基因与性状的直接关系；有的目的基因通过控制酶的合成来控制代谢，进而控制生物的性状，这体现的是基因和性状的间接关系。
(3)注意“抗虫”和“抗病”的区别，二者可以分别通过害虫接种和病毒(或真菌等)接种来进行个体水平的检测。
3．动物基因工程的应用
项目 外源基因类型 成果举例
提高生长速率的转基因动物 外源生长激素基因 转基因绵羊、鲤鱼
改善畜产品品质的转基因动物 肠乳糖酶基因 乳汁中含乳糖较少的转基因牛
生产药物的转基因动物 药用蛋白基因＋乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件 乳腺生物反应器
作器官移植供体的转基因动物 外源的抑制抗原决定基因表达的调节因子或除去供体的抗原决定基因 无免疫排斥的转基因猪
典例1　下列关于培育转基因抗虫棉的叙述，正确的是( B )
A．DNA连接酶能把Bt抗虫蛋白基因与噬菌体相连接
B．Bt抗虫蛋白基因可借助花粉管通道进入受体细胞
C．Bt抗虫蛋白对害虫和人都有不同程度的毒害作用
D．需制备好相应抗原来检测Bt抗虫蛋白
解析： 培育转基因植物常用农杆菌转化法，可用DNA连接酶将编码Bt抗虫蛋白的基因与农杆菌的Ti质粒相连接，构建基因表达载体，A项错误；在植物细胞基因工程中，可利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，也可以利用花粉管通道法将目的基因导入受精卵中，B项正确；Bt抗虫蛋白对哺乳动物无毒害作用，C项错误；要检测目的基因是否成功翻译，可用抗原—抗体杂交技术进行检测，目的基因翻译的蛋白质作为抗原，故需制备好相应抗体来检测Bt抗虫蛋白，D项错误。
变式训练 如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述错误的是( A )
A．过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化
B．过程②用Ca2＋处理可提高转化成功率
C．过程③应在培养基中加入除草剂和物质K
D．筛选得到的A是转化愈伤组织
解析：过程①要用两种限制酶切割出两种不同的黏性末端序列，这样才可防止酶切产物自身环化，A错误；过程②用Ca2＋处理农杆菌可使其成为吸收周围环境DNA分子的生理状态细胞，这样可提高转化成功率，B正确；报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长，因此过程③应在培养基中加入除草剂和物质K，C正确；筛选得到的A是转化愈伤组织，即能在抗除草剂的培养基上生长且呈现蓝色的组织，D正确。
知识点二　基因工程在医药卫生领域和食品工业方面的应用
基础知识·双基夯实
一、基因工程在医药卫生领域的应用
1．技术方法
(1)对微生物或动植物的细胞进行_基因改造__，使它们能够生产药物。
(2)利用乳腺生物反应器生产药物：将_药用蛋白__基因与乳腺中特异表达的基因的_启动子__等调控元件重组在一起，通过_显微注射__导入哺乳动物的受精卵中，培育出的转基因动物通过_分泌乳汁__生产所需要的药物。
(3)培育移植器官：在器官供体的基因组中导入某种_调节因子__抑制_抗原决定__基因的表达或设法除去_抗原决定__基因，然后再结合_克隆__技术，培育出不会引起_免疫排斥__反应的转基因克隆器官。
2．实例：重组人干扰素、促红细胞生成素、抗凝血酶、血清白蛋白等。
二、基因工程在食品工业方面的应用
1．技术方法：利用基因工程菌生产食品工业用_酶__、_氨基酸__和_维生素__等。例如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过_工业发酵__生产凝乳酶。
2．实例：淀粉酶、脂酶、天冬氨酸和苯丙氨酸。
活 | 学 | 巧 | 练
1.利用工程菌可生产人的胰岛素等某些激素。( √ )
2．乳腺反应器就是把药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.为了生产药物，常把药用蛋白基因构建的表达载体导入大肠杆菌或酵母菌细胞中构建工程菌，选用细菌或酵母菌作为受体细胞的优点有哪些？
提示：细菌和酵母菌繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对少，生产能力大等。
2．在研制膀胱生物反应器时，应使药用蛋白基因在什么细胞中特异表达？它与乳腺生物反应器有什么相同和不同点？
提示：应使药用蛋白基因在膀胱上皮细胞中特异表达。相同点是收集药用蛋白较容易，且不会对动物造成伤害。不同点是乳腺生物反应器必须是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。
课内探究·名师点睛
1．乳腺生物反应器的操作过程
2．乳腺生物反应器与基因工程菌生产药物的区别
比较内容 乳腺生物反应器 基因工程菌
含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类
受体基因结构与人类基因结构差异 动物基因结构与人类的基因结构基本相同 细菌和酵母菌的基因结构与人类有较大差异
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物受精卵 微生物细胞
目的基因导入方式 显微注射法 Ca2＋处理法
生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取
生产设备 畜牧业生产、提取设备 发酵生产、提取设备
典例2　采用基因工程技术培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成人凝血因子且只存在于乳汁中。下列有关叙述，不正确的是( A )
A．将含有人凝血因子基因的表达载体导入羊乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器
B．将人凝血因子基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起构建成基因表达载体
C．该转基因羊产生的生殖细胞中可能会含有人凝血因子基因
D．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛
解析：将含有人凝血因子基因的表达载体导入羊受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因羊中，人凝血因子基因在羊乳腺细胞中表达，获得乳腺生物反应器，A错误；构建基因表达载体时需将人凝血因子基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，B正确；用基因工程技术将人凝血因子基因导入羊受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因羊中，人凝血因子基因存在于所有的体细胞中，在减数分裂形成生殖细胞时，该转基因羊产生的生殖细胞中可能会含有人凝血因子基因，C正确；在乳腺生物反应器中，只能从雌性动物进入泌乳期后分泌的乳汁中获取产物，与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器的优点是雌性和雄性动物的尿液中都可提取到产物，不受性别等限制，受体来源更广泛，D正确。
变式训练 下列关于利用乳腺生物反应器生产药用蛋白的叙述，错误的是( B )
A．需要将编码药用蛋白的基因与能在乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起
B．可以使用感受态细胞转化法将基因表达载体导入受体
C．需要借助于早期胚胎培养和胚胎移植技术培育出转基因动物
D．药物的生产会受到转基因动物性别和年龄的限制
解析：培育转基因动物，通常采用显微注射法将目的基因导入动物受精卵。
乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较
名称 乳腺生物反应器 工程菌
含义 是指使外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系
基因结构 动物基因的结构与人类基因的结构基本相同 细菌和酵母菌等生物基因的结构与人类基因的结构有较大差异
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，产生的药物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物的受精卵 微生物细胞
导入目的基因的方式 显微注射法 感受态细胞法(Ca2＋处理法)
生产条件 不需严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞中提取
典例3　下列有关利用乳腺生物反应器与微生物生产药物的叙述，错误的是( D )
A．前者在乳汁中提取药物，后者在细胞中提取
B．两者都是基因工程在医药卫生领域的应用
C．前者合成的蛋白质可加工成熟，后者合成的蛋白质一般不能加工成熟
D．动物和微生物的基因结构与人体的基因结构均相同
解析： 前者在乳汁中提取药物，后者在细胞中提取；乳腺生物反应器和微生物生产药物都是基因工程在医药卫生领域的应用；前者合成的蛋白质可加工成熟，工程菌一般是原核生物，合成的蛋白质一般不能加工成熟；真核生物基因的编码区有内含子和外显子之分，原核生物基因的编码区无内含子与外显子之分。
学 | 霸 | 记 | 忆
1.将来源于某些病毒、真菌的抗病基因导入植物中，培育转基因抗病植物。
2．将外源生长激素基因导入鲤鱼，可提高鲤鱼的生长速度。
3．将药用蛋白基因导入大肠杆菌或酵母菌构建工程菌可生产药物。
4．将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组成表达载体导入哺乳动物的受精卵中可构建乳腺生物反应器。
5．在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后结合克隆技术，可培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆器官。
1．下列关于基因工程的成果及应用的说法，正确的是( C )
A．用基因工程方法培育的抗虫植物也能抗病毒
B．利用基因工程菌只能生产药物
C．基因工程使人们更容易培育出优良性状的动植物品种，获得很多过去难以得到的生物制品
D．利用基因工程生产乙肝疫苗时，目的基因存在于人体B淋巴细胞的DNA中
解析：抗虫基因的表达产物是毒蛋白，只能对害虫起作用；利用基因工程菌除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等；利用基因工程生产乙肝疫苗是通过构建含有乙肝病毒表面抗原基因的重组质粒，然后导入相应的宿主细胞，如酵母菌细胞，生产乙肝病毒表面抗原蛋白，人体B淋巴细胞DNA中不含该基因。
2．下列表示抗凝血酶乳腺生物反应器的制备过程，下列说法正确的是( D )
―→
A．该转基因牛中的抗凝血酶基因只存在于乳腺细胞中
B．②表示性别为雄性的胚胎
C．常用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
D．①表示受精卵
解析：该转基因牛中的抗凝血酶基因存在于所有体细胞中，只是在乳腺细胞中表达，A错误；②表示性别为雌性的胚胎，B错误；常用显微注射法将目的基因导入动物受精卵，C错误；培育转基因动物时常以受精卵作为受体细胞，因此①表示受精卵，D正确。
3．科学家将含有人体α－抗胰蛋白酶基因的表达载体注射到羊的受精卵中，该受精卵发育的雌羊乳汁中含有α－抗胰蛋白酶。上述过程一般不会发生( B )
A．α－抗胰蛋白酶基因与载体间基因重组
B．α－抗胰蛋白酶基因在乳腺细胞中大量扩增
C．RNA聚合酶识别乳腺特异表达基因的启动子
D．乳腺细胞中高尔基体的数量相对较多
解析：该过程中需要构建基因表达载体，因此会发生α－抗胰蛋白酶基因与载体间基因重组；乳腺细胞已经高度分化，不再分裂，因此α－抗胰蛋白酶基因不能在乳腺细胞中大量扩增，只能在乳腺细胞中大量表达；RNA聚合酶识别乳腺特异表达基因的启动子，并与之结合进而启动转录过程；α－抗胰蛋白酶是一种分泌蛋白，动物细胞中高尔基体与分泌蛋白的形成有关，因此乳腺细胞中高尔基体数量较多。第1节　重组DNA技术的基本工具
课标要求
1．简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
2．认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
3．进行DNA的粗提取与鉴定。
核心素养
1．科学思维——模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。
2．社会责任——关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生了基因工程。
　　知识点一　基因工程的概念与限制性内切核酸酶
基础知识·双基夯实
一、基因工程的概念
1．操作场所：_生物体外__。
2．操作技术：_转基因__等技术。
3．操作结果：赋予生物新的_遗传特性__，创造出更符合人们需要的新的_生物类型__和生物产品。
4．操作水平：_DNA分子__水平。
二、重组DNA技术的基本工具
限制性内切核酸酶(又称限制酶)——“分子手术刀”
1．来源：主要来自_原核生物__。
2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定_核苷酸序列__，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_磷酸二酯键__断开。
3．结果：产生_黏性末端__或_平末端__。
活 | 学 | 巧 | 练
1.基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。( √ )
2．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。( × )
3．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？
提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
课内探究·名师点睛
1．限制酶作用特点
(1)切割外源DNA，对自身的DNA不起作用，从而达到保护自身的目的。
(2)专一性：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
2．限制酶作用结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。
(1)黏性末端：错位切，在识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开，产生的是黏性末端，如下图。
(2)平末端：平切，沿着识别序列的中心轴线切开，产生的是平末端，如下图。
3．限制酶的识别序列和切割末端的判断
(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如右图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。
(2)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割，但同样能相互连接。
典例1　如图表示限制酶切割某DNA分子的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切割位点是( C )
A．5′－CTTAAG－3′，切点在C和T之间
B．5′－CTTAAG－3′，切点在G和A之间
C．5′－GAATTC－3′，切点在G和A之间
D．5′－CTTAAC－3′，切点在C和T之间
解析：两条链均按照5′→3′方向分析，由题图可知该限制酶识别的碱基序列为5′－GAATTC－3′，并在G与A之间断开磷酸二酯键，故选C。
变式训练 对下图所示黏性末端的说法，正确的是( C )
A．甲、乙、丙黏性末端是由两种限制性内切核酸酶作用产生的
B．图乙中的酶切位点在A与G之间
C．如果甲中的G突变为A，则原限制性内切核酸酶不能识别该切割位点
D．构建基因表达载体所用的限制酶和DNA连接酶分别作用于a处和b处
解析： 根据题图结果可知，切割甲的限制酶的识别序列是—GAATTC—，切割乙的限制酶的识别序列是—CAATTG—，切割丙的限制酶的识别序列是—CTTAAG—，故甲、乙、丙三个黏性末端是由三种限制酶作用产生的，A项错误；图乙中的酶切位点在A与C之间，而不是A与G之间，B项错误；限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，如果甲中的G发生突变，则限制酶不能识别该切割位点，C项正确；构建基因表达载体所用的限制酶和DNA连接酶的作用位点均是磷酸二酯键即a处，b处为氢键，D项错误。
知识点二　DNA连接酶及与DNA分子相关的几种酶的分析
基础知识·双基夯实
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_磷酸二酯键__。
(2)种类[填表]
　　种类比较　　 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 _大肠杆菌__ _T4噬菌体__
特点 只能连接_黏性末端__ 既可以连接黏性末端，又可以连接_平末端__
活 | 学 | 巧 | 练
1.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。( × )
2．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键形成重组DNA。( × )
3．DNA连接酶能连接所有相同或互补的黏性末端，故该酶没有专一性。( × )
合 | 作 | 探 | 究
限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？
提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E.coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。
课内探究·名师点睛
1．限制酶与DNA连接酶的比较
项目 限制酶 DNA连接酶
不同点 作用 使特定部位的磷酸二酯键断裂 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键
应用 用于提取目的基因和切割载体 用于基因表达载体的构建
关系
　　2.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
种类 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 催化形成磷酸二酯键
不同点 模板 不需要模板 需要以DNA的一条链为模板
作用过程 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键
作用结果 形成完整的DNA分子 形成DNA的一条链
用途 基因工程等 DNA复制
3.限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶、解旋酶的作用部位图解
(1)作用于磷酸二酯键的酶：限制酶(a断开)、DNA连接酶(a形成)和DNA聚合酶(a形成)、DNA水解酶(a断开)。
(2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶。
氢键的形成是由于分子间的作用力，其断裂与重新形成均与限制酶、DNA连接酶无关。
典例2　下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是( C )
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E.coli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸
解析：T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，A错误；E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接，B错误；DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接起来，C正确，D错误。
变式训练 在基因工程操作过程中，DNA连接酶的作用是( C )
A．将任意两个DNA片段连接起来
B．将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来，包括DNA片段和碱基对之间的氢键
C．连接具有互补黏性末端或平末端的DNA片段，即形成磷酸二酯键
D．只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键
解析：DNA连接酶将具有互补的黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
知识点三　基因进入受体细胞的载体
基础知识·双基夯实
1．质粒
(1)质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于_真核细胞的细胞核__或_原核细胞拟核DNA__之外，并具有_自我复制__能力的环状双链DNA分子。
(2)质粒适于作基因运载体的特点
①质粒分子上有一个至多个_限制酶切割__位点，供外源DNA片段插入其中。
②携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中_进行自我复制__，或_整合到受体DNA上__，随_受体细胞DNA__同步复制。
③人工改造的质粒常带有_标记基因__，便于_重组DNA分子的筛选__。
2．噬菌体、动植物病毒等。
活 | 学 | 巧 | 练
1.载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。( √ )
2．所有的质粒都可以作为载体。( × )
3．基因工程中的载体与细胞膜上的载体成分一样。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.所有载体都是质粒吗？为什么？
提示：不是；除了质粒外，载体还有动植物病毒和噬菌体。
2．将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？
提示：不可行；因为如果没有载体，导入受体细胞后，目的基因无法进行自我复制和稳定存在以及表达。
3．质粒上的一些抗生素抗性基因有什么作用？
提示：作为标记基因，对重组DNA进行筛选，检测目的基因是否导入受体细胞。
课内探究·名师点睛
1．载体的功能
(1)作为运载工具将目的基因转运到宿主细胞内。
(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2．常用的载体——质粒
(1)存在场所：细菌、真菌等生物的细胞质。
(2)本质：环状DNA分子。
(3)特点：含有标记基因。
(4)载体必须具备的条件
①能在受体细胞内稳定保存并大量复制。
②有一至多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。
③具有某些标记基因，以便进行筛选。
④载体应对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
基因工程中的载体与载体蛋白的区别
基因工程中的载体 载体蛋白
来源 质粒、噬菌体、动植物病毒 细胞膜上的蛋白质
作用 将目的基因转移到宿主细胞中，并能在宿主细胞中对目的基因进行大量复制 运载要进出细胞的某些物质
典例3　质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( D )
A．质粒是只存在于原核细胞的细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
解析：质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布，A项错误；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点而成为合适的运载目的基因的工具，B项错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C项错误；质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择，D项正确。
变式训练 某研究所的研究人员拟将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，目的基因要插入到基因B中，且大肠杆菌本身不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是( D )
A．导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒
B．抗生素抗性基因是目的基因表达的必要条件
C．成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基上生长
D．能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌不一定符合生产要求
解析：导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒，也可能为普通质粒，A错误；抗生素抗性基因是标记基因，是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，与目的基因表达无关，B错误；由于目的基因要插入到基因B中，即抗氨苄青霉素基因被破坏，工程菌不能抗氨苄青霉素，因此成功导入重组质粒的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，C错误；能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌可能含有重组质粒或普通质粒，因此不一定符合生产要求，D正确。
知识点四　DNA的粗提取与鉴定
基础知识·双基夯实
1．实验原理
(1)_DNA__不溶于酒精，_蛋白质__溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于_2_mol/L的NaCl__溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇_二苯胺__试剂会呈现蓝色。
2．实验步骤
(1)称取30 g洋葱，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
↓
(2)漏斗中垫_纱布__，将研磨液过滤到烧杯中，_4__ ℃处理，取上清液。
↓
(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的_酒精__溶液，静置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。
↓
(4)取两支20 mL的试管编号A、B，各加入2 mol/L的_NaCl__溶液5 mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4 mL的_二苯胺试剂__。混匀后，将试管置于_沸水__中加热5 min。
↓
(5)结果观察：A试管_不变蓝__，B试管_变蓝色__。
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1.DNA与蛋白质都溶于酒精。( × )
2．在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。( × )
3．DNA能溶于2 mol/L的NaCl溶液。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
1.鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？请说明理由。
提示：鸟类适合而哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，不适合作材料提取DNA。
2．实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状物或沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。
3．实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？
提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
课内探究·名师点睛
1．实验材料的选取
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。选取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。
2．方法步骤
(1)粗提取DNA
(2)鉴定DNA
试管编号 A(对照组) B(实验组)
步骤1 2 mol·L－1的NaCl溶液5 mL 2 mol·L－1的NaCl溶液5 mL
步骤2 不进行任何处理 加丝状物或沉淀物
步骤3 加4 mL二苯胺试剂，混匀 加4 mL二苯胺试剂，混匀
步骤4 沸水浴5 min 沸水浴5 min
实验现象 溶液不变蓝色 溶液逐渐变为蓝色
实验结论 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
特别提醒：(1)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质和脂质。
(2)不用哺乳动物的血液作为实验材料，这是因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，不含DNA。
(3)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(4)沉淀DNA时必须用冷酒精。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，使DNA易形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
典例4　下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( A )
A．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，用玻璃棒沿同一方向轻轻搅拌
C．预冷的乙醇可用来溶解蛋白质
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
解析： 猪属于哺乳动物，其红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，而鸡属于鸟类，其红细胞内含有细胞核与各种细胞器，DNA含量较多，A项错误；在除去相关蛋白后，DNA是非常容易断裂的，如果太过剧烈地搅拌，DNA链可能会被破坏，因此轻柔搅拌的目的是为了获得较完整的DNA分子，B项正确；在冷的95%酒精溶液中DNA的溶解度低，DNA的沉淀量大，C项正确；将析出的DNA溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要水浴加热才会呈现蓝色，D项正确。
变式训练 如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列有关叙述错误的是( B )
A．图1中的丝状物含有DNA
B．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
C．图2所示实验操作完成后，最好待试管中溶液冷却后观察颜色变化
D．图2中的溶液b能够溶解DNA
解析：图1中的丝状物含有DNA，A正确；图1所示操作的原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质溶于酒精，B错误；图2所示实验操作完成后，最好待试管中溶液冷却后观察颜色变化，C正确；图2中的溶液b是NaCl溶液，能够溶解DNA，D正确。
选择限制酶的方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。
不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
典例5　利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点分别如下图所示(已知这三种限制酶切割产生的黏性末端不同)。下列分析错误的是( D )
A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组 DNA
解析： 构建重组DNA时，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A项正确；分析图甲，HindⅢ的酶切位点在第二个EcoRⅠ的酶切位点的左侧，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B项正确；P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为链状DNA分子，因每条DNA单链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C项正确；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可正向连接或反向连接，不止能产生一种重组DNA，D项错误。
学 | 霸 | 记 | 忆
1.基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。
2．DNA重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。
3．限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。
4．E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。
5．质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。
6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
8．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。
9．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
1．下列关于E.coli DNA连接酶的叙述，正确的是( A )
①催化具有相同黏性末端的DNA片段之间的连接
②催化具有互补黏性末端的DNA片段之间的连接
③催化具有平末端的DNA片段之间的连接
④催化单个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
A．①②　 B．②④　
C．②③　 D．①④
解析：E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，可用于连接相同或互补的黏性末端，不能连接平末端；T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接平末端的效率相对较低。DNA连接酶不能连接单个的脱氧核苷酸，在DNA复制时，靠DNA聚合酶将单个的脱氧核苷酸聚合在一起。
2．用X酶切割DNA分子后，得到黏性末端①，用Y酶切割DNA分子后，得到黏性末端②，如图所示，以下说法不正确的是( D )
A．X与Y通常是不同的限制酶
B．限制酶与DNA水解酶破坏的化学键相同
C．限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
D．具有①②的两个DNA片段可连接成重组分子，重组后还可以被X或Y切割
解析：由题图可知，X与Y识别的核苷酸序列不同，因此X与Y是不同的限制酶，A正确；限制酶与DNA水解酶破坏的化学键相同，都是磷酸二酯键，B正确；限制性内切核酸酶将一个DNA分子片段切成两个片段，即断裂两个磷酸二酯键，因此需消耗两个水分子，C正确；具有①②的两个DNA片段可连接成重组分子，核苷酸序列发生了改变，所以重组后不能被X或Y切割，D错误。
3．下图中甲、乙分别表示质粒和含目的基因的DNA片段。几种可供选择使用的限制酶识别序列及其切割位点为
注：tetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
回答下列问题：
(1)限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的_磷酸二酯键__断开。题中可供使用的限制酶，切割相应DNA片段后能产生黏性末端的有_EcoRⅠ、BamHⅠ、BclⅠ、Sam3AⅠ__。
(2)经限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以与上述其余限制酶中的_BamHⅠ、BclⅠ__(填限制酶名称)切割后得到的DNA片段连接，理由是_它们切割后产生的片段具有相同的黏性末端__。图中甲质粒经Sau3AⅠ完全切割后可得到_3__种DNA片段。
(3)图甲中的tetR和AmpR在运载体上可作为_标记基因__，用于重组DNA的鉴定和选择。
解析：(1)限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。题中可供使用的限制酶切割相应片段后都会产生黏性末端。(2)经限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以与其余限制酶中的BamHⅠ、BclⅠ切割后得到的DNA片段连接，理由是它们切割后产生的片段具有相同的黏性末端。图中甲质粒有3个Sau3AⅠ的酶切位点(terR上有1个，而AmpR上有2个)，所以经Sau3AⅠ完全切割后可得到3种DNA片段。(3)图中甲的tetR和AmpR都是抗性基因，在运载体上可以作为标记基因，用于重组DNA的鉴定和选择。

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