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第2讲　微生物的培养技术及应用
选择性必修3　生物技术与工程
第十单元　生物技术与工程
一、培养基的配制
1．概念：人们按照微生物对________的不同需求，配制出供其________的营养基质。
2．营养组成
(1)一般都含有__、____、____和无机盐等。
(2)需要满足微生物生长对____、特殊营养物质以及___的需求。
营养物质
生长繁殖
水
碳源
氮源
pH
O2
考点1　微生物的基本培养技术
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加______
霉菌 一般将培养基调至__性
细菌 一般将培养基调至__________性
厌氧微生物 提供____的条件
维生素
酸
中性或弱碱
无氧
3．种类
(1)按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。
(2)按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。
二、无菌技术
1．概念：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
2．关键：____________。
3．目的：______________________。
防止杂菌污染
获得纯净的微生物培养物
4．消毒与灭菌的比较
比较项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的__________或生物等方法 仅杀死物体表面或内部一部分微生物　　 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体
化学药物消毒法 操作空间、操作者的衣物和手等
紫外线消毒法 接种室、接种箱或超净工作台
物理、化学
比较项目 条件 结果 常用方法 应用范围
灭菌 强烈的理化方法　　 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子　　 湿热灭菌法 培养基、容器等
5．其他操作
(1)做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与__________接触。
(2)为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台并在__________附近进行。
周围的物品
酒精灯火焰
6．实例——酵母菌的纯培养
　　　　
高压蒸汽灭菌
干热灭菌
平板划线法
倒置
未接种
1．无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？(选择性必修3　P10“旁栏思考”)
提示：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
2．操作时，接种环通过灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是什么？(选择性必修3　P13“文字信息”)
提示：将聚集的菌体逐步稀释以便获得不连续的单个菌落。
3．在接种酵母菌的培养基上，若观察到了不同形态的菌落，则分析可能是由哪些原因引起的？(选择性必修3　P13“探究·实践”)
提示：若观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或无菌操作不规范等原因引起的。
4．日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？(选择性必修3　P14“概念检测”)
提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的含水量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温储存通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
1．在培养细菌时，要将培养基调至中性或弱酸性。 ( )
提示：在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性。
2．蛋白胨中含有糖、维生素和有机氮等营养物质。 ( )
3．玻璃器皿、金属用具等可以采用干热灭菌。 ( )
×
√
√
4．微生物的纯培养步骤为配制培养基→接种→灭菌→分离和培养等。 ( )
提示：微生物的纯培养步骤为配制培养基→灭菌→接种→分离和培养等。
5．待灭菌后的培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。 ( )
×
√
6．微生物的纯培养物指的是未被杂菌污染的微生物。 ( )
7．酵母菌纯培养的马铃薯葡萄糖培养基上的葡萄糖也可用蔗糖代替。 ( )
√
√
1．倒平板操作中，平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是
__________________________________________________________
__________________________________________________________。
提示：防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上(污染培养基和破坏菌落)和防止培养基水分过快蒸发
2．纯培养时，须使用固体培养基，原因是_____________________
__________________________________________________________。
提示：固体培养基上细菌分裂产生的子代个体不易分散，从而形成菌落
1．培养物、纯培养物、纯培养辨析
培养物 接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体
纯培养物 由单一个体繁殖所获得的微生物群体
纯培养 获得纯培养物的过程
2．平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环，待其冷却后才能蘸取菌液，以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一次的划线不要与第一次的划线相连。
(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如表：
第一次操作 每次划线之前 划线结束
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
1．某同学为探究已纯化的菌株能否分解纤维素，他将此菌株接种在纤维素分解菌选择培养基上，一段时间后，培养基上出现了菌落，该同学认为此菌株能分解纤维素，但其他的同学并不认同他的观点，你认为他们的理由是什么？
提示：实验缺少空白对照；操作不规范。
2．某同学在利用稀释涂布平板法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？为了防止杂菌污染，有同学建议加入抗生素，你觉得可以吗？并说明理由。
提示：最可能的原因是菌液浓度过高(土壤溶液稀释不够)。不可以，因为抗生素不但能杀灭杂菌，而且也可以杀灭目的菌，因此在培养基上不可以加入抗生素。
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考向1考查无菌技术
1．(2022·湖北选择性考试)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(　　)
A．动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B．微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
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D　[动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养不能加入抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。]
2．(2022·江苏扬州模拟)根据相关规定，每毫升合格的牛奶中细菌总数不超过50 000个。某兴趣小组利用恒温水浴锅对新鲜牛奶进行消毒后，进行细菌总数测定，主要步骤如图所示。相关叙述不正确的是(　　)
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A．步骤①中用巴氏消毒法对新鲜牛奶进行消毒，可以减少营养物质的损失
B．步骤②对牛奶进行梯度稀释可以使聚集的微生物分散，便于在培养基表面形成单菌落
C．步骤③中牛肉膏蛋白胨培养基要先高压蒸汽灭菌再调pH，以防止高温影响pH的稳定
D．实验结束时培养基上的菌落可能不止一种，若平均菌落总数少于50个则表明消毒合格
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C　[80 ℃、30 s～1 min处理新鲜牛奶属于巴氏消毒法，采用短时高温处理的目的是尽量减少牛奶中营养物质的损失，A正确；步骤②将牛奶进行梯度稀释的目的是使聚集在一起的微生物分散，便于能在培养基表面形成单个菌落，B正确；牛肉膏蛋白胨培养基配制时应先调pH再灭菌，C错误；由于生牛奶中的微生物可能不止一种，而牛肉膏蛋白胨培养基属于天然培养基，细菌、真菌等均可生长，因此，在实验中，培养基上可能不止出现一种菌落，依据样品液稀释了1 000倍，接种液体积为1 mL，计算推测若平均菌落总数少于50个，则表明消毒后每毫升牛奶中细菌总数不超过50 000个，消毒合格，D正确。]
考向2考查微生物的纯培养技术
3．(2022·山东菏泽二模)野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，如图为纯化某氨基酸营养缺陷型大肠杆菌突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，A、B、C表示操作步骤，D、E为菌落。下列叙述正确的是(　　)
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A．图中①②④为基本培养基，③为完全培养基
B．A操作可提高基因突变和染色体变异的突变率，增加突变株的数量
C．B操作可用涂布器蘸取菌液均匀地涂布在②表面
D．经C过程原位影印及培养后，可从④中挑取D进行纯化培养
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D　[野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，读图可知，图中①②④为完全培养基，③为基本培养基，A错误；大肠杆菌没有染色体，紫外线可以提高基因突变的频率，B错误；B操作是将菌液滴加到培养基表面，再用涂布器将菌液均匀的涂布在②表面，C错误；从图中可看出，D在基本培养基中无法生长，在完全培养基中可生长，说明D是氨基酸缺陷型菌落，故经C过程影印及培养后，可从④培养基中挑取D菌落进行纯化培养，D正确。]
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4．(2022·广东佛山二模)广东特产陈皮具有理气健脾、燥湿化痰之功，其所含黄酮类物质起重要作用，而黑曲霉(一种无害霉菌)可以引起其含量的变化。为了研究黑曲霉对不同年份陈皮黄酮类成分的影响，某研究小组从江门市新会区收集一批陈皮样品进行实验。回答下列问题：
(1)对于前期培养的黑曲霉，可利用__________________法得到单菌落，并通过显微镜检测鉴定，获得纯的目标菌种，收集它的孢子制备悬浮液。
(2)分别称取8克陈化2年、6年、10年的陈皮样品粉末平铺于培养皿，用紫外线对样品进行正反面照射各30 min。用紫外线照射样本的目的是_______________________________________________________
___________________________________________________________
__________________________________________________________。
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(3)将经紫外线照射过的每种年份的陈皮样品都分为两组，一组各加入1 mL无菌水，分别标记为XH2-0、XH6-0、XH10-0，另一组各加入__________________，不同年份的样品分别标记为XH2、XH6、XH10，陈皮为黑曲霉的生长提供____________________等营养成分。置于恒温恒湿条件下培养一段时间后，取不同接种天数的样品检测黄酮类成分的含量，实验结果如表所示。据表分析，实验结果表明：______________
___________________________________________________________
________________________________________________________(答出两点即可)。
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编号 第5天 第7天 第9天 第11天 第13天
XH2 8.32 8.77 9.74 13.11 14.33
XH2-0 7.42 7.39 7.36 7.68 7.98
XH6 8.72 9.73 9.91 10.93 10.82
XH6-0 8.33 8.82 8.63 8.82 9.15
XH10 9.24 10.95 12.48 14.26 12.61
XH10-0 10.27 9.84 9.35 9.51 9.54
[解析]　(1)稀释涂布平板法和平板划线法均可获得单菌落，据此，对于前期培养的黑曲霉，为获得单菌落，可利用稀释涂布平板法或平板划线法获得，并通过显微镜检测鉴定菌落特征，获得纯的目标菌种，收集它的孢子制备悬浮液。(2)用紫外线照射样本的目的是消毒，杀灭陈皮样品中的细菌(微生物)进而保证实验用的材料上的菌种均来自我们的接种物。(3)为保证等量原则，另一组各加入1 mL黑曲霉孢子悬浮液，不同年份的样品分别标记为XH2、XH6、XH10。
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陈皮中含有有机物，能为黑曲霉的生长提供碳源、氮源(无机盐)等营养成分。表中数据显示，黑曲霉对不同年份陈皮的黄酮类成分含量均有促进作用；且黑曲霉对陈化2年的陈皮黄酮类成分含量促进作用最大；而且表现出随着接种天数延长，黑曲霉对黄酮类成分含量的促进作用先增强后有所减弱。
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3
4
[答案]　(1)平板划线(或稀释涂布平板)　(2)消毒，杀灭陈皮样品中的细菌(微生物)　(3)1 mL黑曲霉孢子悬浮液　碳源、氮源(无机盐)　黑曲霉对不同年份陈皮的黄酮类成分含量均有促进作用；黑曲霉对陈化2年的陈皮黄酮类成分含量促进作用最大；随着接种天数延长，黑曲霉对黄酮类成分含量的促进作用先增强后放缓
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2
3
4
一、选择培养基
　　　　
允许
抑制或阻止
脲酶
NH3
尿素
考点2　微生物的选择培养和计数
二、微生物的选择培养
1．土壤取样
2．等比稀释
将10 g土样加入盛有__ mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
90
3．涂布平板
　　
0.1
酒精
冷却
4．培养观察
(1)待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入______ ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
(2)在涂布有合适浓度菌液的平板上可以观察到分离的______。
30～37
单菌落
三、微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)计数原理：当样品的____________时，培养基表面生长的一个______，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的______，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)计数标准：为了保证结果准确，一般选择菌落数为_______的平板进行计数。
稀释度足够高
单菌落
菌落数
30～300
(3)计数方法：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为_______、适于计数的平板。在__________下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出______。
(4)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计结果一般用______表示。
30～300
同一稀释度
平均值
菌落数
2．显微镜直接计数法
(1)计数原理：利用特定的__________或____________，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)优点：是一种常用的、________的测定微生物数量的方法。
细菌计数板
血细胞计数板
快速直观
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
　　　　
脲酶
尿素
中性
菌落数目稳定时
菌落特征
1．该实验中的选择培养基对分解尿素的细菌具有选择作用。若要判断选择培养基是否起到了筛选的作用，对照组应如何设置？(选择性必修3　P19“探究·实践”)
提示：用完全培养基接种后在相同条件下同时培养。
2．统计菌落种类和数目时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定。若培养时间不足或培养时间太长，分别会导致什么结果？(选择性必修3　P19“探究·实践”)
提示：遗漏菌落的种类和数目。菌落粘连影响计数、培养基表面干燥脱水、微生物衰败，菌落特征不易观察。
3．为从富含纤维素的土壤中分离出有分解纤维素能力的高产菌株，将样品稀释涂布到鉴别培养基之前，可通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度。选择培养基应以纤维素作为唯一的碳源。选择培养能够“浓缩”目的菌，分析其原因。(选择性必修3　P20“拓展应用”)
提示：目的菌能够以纤维素为碳源大量繁殖，而其他细菌不能以纤维素为碳源，无法正常生活。
1．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。 ( )
提示：选择培养基可以筛选分离出某种微生物。
2．脲酶催化尿素分解产生NH3。 ( )
3．对细菌进行计数时，可以用平板划线法。 ( )
提示：对细菌计数可以采用稀释涂布平板法或显微镜直接计数法。
×
√
×
4．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。 ( )
5．刚果红与纤维素形成红色复合物，可以通过是否产生透明圈来分离纤维素分解菌。 ( )
6．用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 ( )
√
√
√
1．利用稀释涂布平板法进行微生物数量测定时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目要少，这是因为__________________________
_________________________________________________________。
提示：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
2．在进行土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的相关实验时，甲同学从对应1×106倍稀释的培养基中筛选出大约200个菌落，但是其他同学在同样稀释度下只筛选出大约90个菌落，若甲同学的结果有问题，则可能的原因是_____________________________________
__________________________________________________________。
提示：培养基被杂菌污染或培养基中混入了其他含氮物质或土壤样品不同
3．将纯化后的纤维素分解菌接种在含有刚果红的培养基上，然后将平板置于恒温培养箱中培养适宜时间，这些平板上透明圈最大的单菌落中的纤维素分解菌分解纤维素的能力不一定是最强的，原因是_________________________________________________________
__________________________________________________________。
提示：判断纤维素分解菌分解能力的强弱，最准确的是透明圈直径与菌落直径的比值
1．两种纯化细菌的方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 平板划线操作 系列稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
平板示意图
能否用于计数 不能计数 可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征 2．统计菌落时所用两种计数方法的比较
比较项目 活菌计数法(稀释涂布平板法) 显微镜直接计数法
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量
比较项目 活菌计数法(稀释涂布平板法) 显微镜直接计数法
公式 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数； V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数
比较项目 活菌计数法(稀释涂布平板法) 显微镜直接计数法
缺点 当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞的死活
结果 比实际值小 比实际值大
3．选择培养基四种常见制备方法或实例
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
1．鉴定菌株间遗传关系时，常将待测菌株的菌丝体接种于同一培养基内，若两菌丝体间长出“拮抗线”，说明二者的遗传关系较远(图1)。借助此原理，快速筛选出一株与平菇、杏鲍菇菌株遗传关系较远的融合菌株X，请在图2中绘制模式图，标注接种菌丝体位置，注明菌株类型，并大致画出拮抗线的位置。
图1　菌株间的拮抗现象(右图为左图的模式图)
图2
提示：
2．酿酒皮渣堆积过程中会积累醋酸菌和某些兼性厌氧型乳酸菌，向培养基中加入无菌碳酸钙粉末，使培养基不透明，菌落生长时其周围会出现透明圈。现用筛选平板(培养基)初筛醋酸菌时，发现醋酸菌和乳酸菌在平板上形成的菌落形态很相似，很难区分。请设计一个实验方案，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌。即简要写出实验思路和预期结果及结论。
实验思路：_________________________________________________　
___________________________________________________________
预期结果及结论：___________________________________________　
___________________________________________________________
提示：将平板置于无氧环境下培养，观察菌落和透明圈大小。　若菌落继续生长且透明圈增大，则为乳酸菌；若菌落不能继续生长且透明圈不再增大，则为醋酸菌。
考向1微生物的选择培养
1．(2021·山东等级考)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是(　　)
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
B　[根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲菌可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A正确；乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C正确；可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标可以是菌落周围深蓝色圈的大小，D正确。]
2．(2022·全国乙卷)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题。
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有__________________________(答出两点即可)。
(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是________；用菌株C生产S的最适碳源是___________________。
菌株C的生长除需要碳源外，还需要______________________(答出两点即可)等营养物质。
(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是___
__________________________________________________________。
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是__________________________________(答出一点即可)。
[解析]　(1)对所需的玻璃器皿进行灭菌，玻璃器皿常用的灭菌方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌等。(2)由实验结果可知，与以制糖废液为碳源相比，以葡萄糖为碳源时菌株C的细胞干重最大，说明最适于菌株C生长的碳源是葡萄糖；而以制糖废液为碳源时，用菌株C生产S的产量高于以葡萄糖为碳源时的产量，说明最适于生产S的碳源是制糖废液。微生物的生长一般都需要水、碳源、氮源和无机盐，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、水等营养物质。
(3)分析题中表格可以看出在以淀粉为碳源的培养基中，菌株C不能生长，原因可能是菌株C中缺少分解淀粉的酶，不能利用淀粉。(4)要测定生产S的最适制糖废液的浓度，实验自变量为制糖废液的浓度，可分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度，即为生产S的最适碳源浓度。(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，既有利于减少污染、节省原料，又能降低生产成本。
[答案]　(1)高压蒸汽灭菌、干热灭菌　(2)葡萄糖　制糖废液　氮源、无机盐、水　(3)缺少淀粉酶　(4)分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度即为生产S的最适碳源浓度　(5)减少污染、节省原料、降低生产成本
考向2微生物的计数
3．(2022·山东济宁模拟)嗜冷细菌在－15～20 ℃下能够正常生长，其产生的大量胞外耐高温的脂肪酶和蛋白酶会分解脂肪和蛋白质，从而造成牛奶腐败变质。为测定某牛奶样品中嗜冷细菌的数目，某生物小组做了如图所示实验，下列有关说法错误的是(　　)
注：培养皿旁的数字代表菌落数目。
A．牛奶样品中不一定含有嗜冷细菌生长繁殖所需的所有营养成分
B．估算1 mL牛奶样品中嗜冷细菌的活菌数为3.9×105个
C．刚挤出的鲜牛奶冷藏一段时间后进行高温杀菌处理，牛奶就不会腐败变质了
D．可从嗜冷细菌中获得抗冻基因用于抗冻作物品种的培育
C　[嗜冷细菌在－15～20 ℃下能够正常生长，牛奶样品中主要含有碳源、氮源等，但不一定含有嗜冷细菌生长繁殖所需的所有营养成分，如生长因子等，A正确；计数时应选择30～300的菌落数进行计算，据图可知，1 mL牛奶样品中嗜冷细菌的活菌数为(36＋39＋42)÷3×103÷0.1＝3.9×105个，B正确；牛奶等液体制品的消毒常采用巴氏消毒法，采用高温杀菌处理对牛奶进行消毒处理时会破坏牛奶的营养物质，C错误；可从嗜冷细菌中获得抗冻基因，将其作为目的基因导入作物体内，用于抗冻作物品种的培育，D正确。]
(1)BTB培养基灭菌后待平板凝固，应倒置放在超净台上，目的是
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__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(2)将污泥样品梯度稀释后，使用________(填工具)将样液均匀涂布在BTB培养基上，放在________环境中培养2～3天后，挑选显________色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。
(3)将纯菌株接种在液体培养基上培养一段时间，若在培养瓶顶部检测到N2O，即可鉴定为目的菌。不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌，原因是____________________________________
__________________________________________________________。
(4)C/N(碳氮含量比)对反硝化效率有一定的影响。科研人员测得不同C/N条件下目的菌对硝酸盐的去除率，结果如图所示：
科研人员提出，在利用目的菌株处理工业污水时，需要适当向污水中投放少量淀粉，据图分析这样做的主要目的是_______________
__________________________________________________________。
(5)为计数微生物的数量，一位同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的土壤样液0.1 mL，培养后菌落数分别为155、160、176、149个，则每毫升原土壤样液中上述微生物数量为________。
[解析]　(1)BTB培养基灭菌后待平板凝固，应倒置放在超净台上，这样做的目的是防止皿盖上的水珠落入培养基，同时也能避免培养基中的水分过快的挥发。(2)利用稀释涂布平板法纯化菌株时，接种工具是涂布器，根据反硝化过程的产物可知，反硝化细菌能在无氧环境中将硝酸盐转化为氮气，为了筛选出耐高温的反硝化细菌，需要将接种后的平板放在无氧、42 ℃环境中培养2～3天，反应过程中消耗培养基中的H＋，因此会导致菌落周围呈弱碱性，菌落周围培养基呈蓝色。故需要挑选显蓝色的单菌落在固体培养基上划线分离，
获得纯菌株。(3)因为其他微生物也能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低，因此不能用硝酸盐降低作为检测指标，而应该用反硝化作用的最终产物N2O作为检测指标。(4)结合实验数据可知，C/N影响目的菌对硝酸盐的去除率且随着该比值的增大，能提高对污水中硝酸盐的去除率，实验结果显示在C/N＝7时效果最好，因此在利用目的菌株处理工业污水时，向污水中投放少量淀粉的目的是适当提高污水中的C/N，从而提高目的菌对污水中硝酸盐的去除率。(5)由实验数据推知每毫升原土壤样液中上述微生物数量为(155＋160＋176＋149)÷4÷0.1×106＝1.6×109个。
[答案]　(1)防止皿盖上的水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快的挥发　(2)涂布器　无氧、42 ℃　蓝　(3)其他微生物也能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低　(4)适当提高污水中的C/N，从而提高目的菌对污水中硝酸盐的去除率　(5)1.6×109
1．核心概念
(1)(选择性必修3 P9)培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)(选择性必修3 P10)消毒：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
(3)(选择性必修3 P10)灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
(4)(选择性必修3 P12)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。　(5)(选择性必修3 P16)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．结论语句
(1)(选择性必修3 P16)土壤中的某些细菌能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。
(2)(选择性必修3 P18)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
(3)(选择性必修3 P18)同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
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3
2
4
1．(2021·北京等级考)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下述操作不正确的是(　　)
A．对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌
B．使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C．用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布
D．观察菌落的形态和颜色等进行初步判断
真题体验·感悟高考
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3
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C　[为避免杂菌污染的干扰，需对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌，A正确；葡萄球菌需从人体皮肤的微生物中分离，为避免杂菌污染，故需要使用无菌棉拭子从皮肤表面取样，B正确；棉拭子上的微生物需要用平板划线法在培养基上进行接种，C错误；根据微生物在固体平板培养基表面形成菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别，D正确。]
2．(2021·山东等级考)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是(　　)
1
3
2
4
A．乙菌的运动能力比甲菌强
B．为不影响菌的运动需选用液体培养基
C．该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D．穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
1
3
2
4
B　[从图中可以看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说明了乙菌的运动能力比甲菌强，A正确；实验所用培养基应为固体培养基，B错误；该实验可以根据黑色沉淀的多少初步比较细菌产生硫化氢的能力，但不能测定产生硫化氢的量，C正确；微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。]
1
3
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4
3．(2020·江苏高考)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素分解菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
1
3
2
4
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
1
3
2
4
B　[倒平板后无须间歇晃动，A错误；图中Ⅰ区、Ⅱ区的细菌数量太多，Ⅲ区的细菌数量较少，可从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；Ⅲ区中存在单菌落，该实验结果能达到菌种纯化的目的，C错误；刚果红能与纤维素形成红色复合物，但不能和纤维素水解后的纤维二糖、葡萄糖等形成红色复合物，因此菌落周围的纤维素被降解后，不能被刚果红染成红色，D错误。]
1
3
2
4
4．(2022·全国甲卷)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
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3
2
4
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题。
1
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2
4
1
3
2
4
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成__________________________(答出两种即可)等生物大分子。
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是________。
1
3
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4
1
3
2
4
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
_________________________________________________________。
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是________，理由是___________________
__________________________________________________________
_________________________________________________________。
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2
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[解析]　(1)培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。(2)由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌的增殖呈“J”形曲线增长，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后A细菌的数量是N0·2n。(3)分析表格数据可知，实验的结果是在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的
1
3
2
4
思路是在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。(4)在平板Ⅱ(无氮源的培养基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。
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[答案]　(1)石油　DNA、RNA、蛋白质　(2)N0·2n　(3)在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力　(4)A菌株　A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
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(教师用书独具)
(2020·全国卷Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
请回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用____________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是_______________(答出一点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：
__________________________________________________________
__________________________________________________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即________________。
[解析]　(1)实验过程中，对盛有水或培养基的摇瓶进行灭菌时，常采用高压蒸汽灭菌法。据题图分析可知，乙培养基为固体培养基，与甲培养基相比，其特有的组分Y物质应是凝固剂琼脂。甲、乙培养基均只允许能利用物质S作为氮源和碳源的微生物生长，因此均为选择培养基。(2)据题意，假设至少将摇瓶M中的菌液稀释X倍，才能保证稀释后的100 μL菌液中细菌细胞数不超过200个，初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，则稀释之前100 μL菌液中有2×106个细菌，可得2×106×(1/X)＝200，则X＝104，因此至少应将摇
瓶M中的菌液稀释104倍。(3)在筛选过程中，若培养基中S浓度过高，可能会导致细胞失水，进而抑制菌株的生长。(4)将含有能降解S的细菌的淤泥加入无菌水中，进行适当稀释后，取适量的菌液，利用稀释涂布平板法涂布到乙培养基上，在适宜条件下进行培养，一段时间后，统计菌落数，即可估算出淤泥中能降解S的细菌细胞数。(5)本实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供的营养物质是水、碳源、氮源和无机盐。
[答案]　(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104　(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐

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