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考点二　传统发酵技术的应用与发酵工程的基本环节
(2023·山东卷)以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理：①沸盐水冷却后再倒入坛中；②盐水需要浸没全部菜料；③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是(　　)
A．①主要是为了防止菜料表面的醋酸杆菌被杀死
B．②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌
C．③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入
D．④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低
解析：盐水煮沸是为了杀灭杂菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响，A项错误；②盐水需要浸没全部菜料，造成无氧环境，有利于乳酸菌无氧呼吸，B项错误；③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水，是排气减压、隔绝空气、防止杂菌污染等，C项正确；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量，腌制泡菜过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少，D项错误。
答案：C
1．传统发酵技术中四种常用菌种的比较
项目 酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌
生物学分类 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物
代谢类型 异养兼性厌氧型 异养需氧型 异养需氧型 异养厌氧型
发酵条件 前期需氧，后期不需氧　 一直需氧 一直需氧 无氧
生长适宜温度 18～30℃ 30～35 ℃ 15～18 ℃ 室温
生产应用 酿酒、发面 酿醋 制作腐乳 制作酸奶、泡菜
2.理解乳酸菌、乳酸、亚硝酸盐的数量(含量)随时间变化的曲线
3．明确发酵工程的基本环节
题点一：围绕传统发酵技术的应用，考查理解能力
1．(2023·广东广州统考三模)孝感米酒是湖北省的传统美食，其制作流程为：糯米清洗蒸煮＋酒曲(含霉菌、酵母菌等微生物)→发酵→高温煮制→灌装保存。下列叙述错误的是(　　)
A．蒸煮好的糯米需冷却后再加入酒曲，以防影响酒曲中微生物的活性
B．制备好的糯米与酒曲充分混合，装满容器后进行密封发酵
C．发酵时，霉菌先分泌淀粉酶进行糖化后，酵母菌才能大量繁殖
D．高温煮制的目的是使糯米停止发酵并消毒杀菌
解析：温度过高，会将酵母菌等微生物杀死(避免高温杀死酵母菌)，故蒸煮好的糯米需冷却后再加入酒曲，以防影响酒曲中微生物的活性，A项正确；酿酒过程中利用酵母菌的无氧呼吸会产生二氧化碳气体，为防止发酵液溢出，不会装满容器后进行密封发酵，会留有一段空间(一方面利于早期酵母菌有氧呼吸繁殖增加数量，一方面防止发酵过程中发酵液溢出)，B项错误；发酵时，霉菌先分泌淀粉酶进行糖化后，产生大量的葡萄糖，供酵母菌分解利用，C项正确；煮制的作用主要有两个，一是通过高温使糯米停止发酵，二是通过高温煮制达到杀菌消毒的目的，D项正确。
答案：B
题点二：通过发酵工程的原理、操作及应用，提升综合实践能力
2．(2023·广东模拟预测)现代人追求高效率、高品质的健康生活，因此市场上果汁饮料、果酒、果醋越来越受到人们的青睐。请回答：
(1)在果酒酿造过程中，发酵罐先____________，促进酵母菌大量繁殖，然后密闭，有利于获得更多的酒精产物。若产物中生成了酒精，使用酸性重铬酸钾试剂检验呈现________色。
(2)在果酒酿造过程中，如果果汁含有醋酸菌，在酒精发酵旺盛时，醋酸菌能否将果汁中的糖发酵为酸并说明理由？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)当缺少糖源时仍可进行醋酸发酵，其反应式为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)为了进一步提高果酒的品质，我们在利用发酵工程生产果酒时要向发酵罐内接种优良品种的酵母菌，某生物兴趣小组在用平板划线法分离优良品种的酵母菌时，进行了如图操作：其中较明显的一处错误是不要____________________________________，在第二次划线前灼烧接种环，目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)酿酒用到的菌种为酵母菌，酵母菌为兼性厌氧菌，在有氧条件下能够大量增殖，有利于酵母菌数量的增多，故在果酒酿造过程中，发酵罐先通入无菌空气(避免其他微生物的干扰)，促进酵母菌大量繁殖，然后密闭，有利于获得更多的酒精产物；酒精可以用酸性重铬酸钾试剂进行检验，二者反应呈现灰绿色。(2)醋酸菌为好氧菌，需要在有氧的环境下才能生存，酿酒的过程中营造的是无氧环境，使得酵母菌进行无氧呼吸产生酒精，故在酒精发酵旺盛时，醋酸菌不能将果汁中的糖发酵为酸，因为醋酸菌是好氧细菌，而果酒发酵为无氧环境，醋酸菌无法生存。(3)糖源缺乏时，醋酸杆菌会把乙醇变成乙醛，然后乙醛变成乙酸，其反应式为：C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O＋能量。(4)平板划线法注意事项：1.划线时力度不能过大，以免划破培养基。2.划线时第一区域不能与最后区域相连。平板划线法通过反复划线分离，可获得微生物的纯种，分析题图可知其中较明显的一处错误是不要让最后一次划线与第一次划线区域重叠(否则菌落重新长到连在一起，无法起到分离菌种的作用)；在第二次划线前灼烧接种环，目的是杀死接种环上可能残余的菌种，保证下一次划线时的酵母菌直接来源于上一次划线的末端，而且注意每次灼烧之后等冷却才划线，避免将菌种烫死。
答案：(1)通入无菌空气　灰绿
(2)不能，醋酸菌是好氧细菌，而果酒发酵为无氧环境，醋酸菌无法生存
(3)C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O＋能量
(4)让最后一次划线与第一次划线区域重叠　杀死接种环上可能残余的菌种，保证下一次划线时的酵母菌直接来源于上一次划线的末端第15讲　发酵工程
答案：?酵母菌　?乳酸菌　?碳源、氮源、水、无机盐　?平板划线法　?湿热灭菌　?尿素　?稀释涂布平板　?选育菌种?扩大培养
1．(选择性必修3 P6“探究·实践”)制作传统泡菜的盐水需煮沸并冷却后才可使用，原因是什么？
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提示：加热煮沸是为了杀灭杂菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响。
2．(选择性必修3 P7“探究·实践”)在制作果酒的第4步，每隔12 h左右就要将瓶盖拧松一次，但又不打开，这样做的目的是什么？
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提示：使二氧化碳排出，不打开瓶盖是防止氧气和有害杂菌进入。
3．(选择性必修3 P13“探究·实践”)操作时，接种环通过灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是什么？
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提示：将聚集的菌体逐步稀释以便获得不连续的单个菌落。
4．(选择性必修3 P19“探究·实践”)该实验中的选择培养基对分解尿素的细菌具有选择作用。若要判断选择培养基是否起到了筛选的作用，对照组应如何设置？
________________________________________________________________________
提示：用完全培养基接种后在相同条件下同时培养。
5．(选择性必修3 P23“文字信息”)发酵罐中设计搅拌叶轮进行搅拌的意义是什么？
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提示：使菌种与发酵底物更能充分接触，提高发酵效率。
6.(选择性必修3 P25“思考·讨论”)流程⑥在加入酵母菌前需将麦汁进行冷却，其目的是什么？
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提示：防止高温杀死酵母菌(或保持酵母菌细胞的活性)。
1．在果酒发酵过程中，绝大多数微生物不能在发酵液中生存的原因是什么？
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答案：酸性的发酵液和产物酒精均会抑制其他微生物生长。
2．实验中接种方法一般采用的是平板划线法，不必采用稀释涂布平板法，其依据是什么？
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答案：稀释涂布平板法可以用来计数活菌，平板划线法不能用于计数活菌，只能用于分离菌种；若没有计数菌落数量的目的，不必采用稀释涂布平板法。
3．无论是米曲霉发酵过程，还是发酵池发酵过程中，都要随时检测培养液中微生物数量、产物浓度等了解发酵过程。为什么还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件呢？
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答案：目的是保证发酵的正常进行。因为发酵条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物的代谢产物的形成。
考点一　微生物的培养与利用
　(2023·广东卷)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　　)
A．a点时取样、尿素氮源培养基
B．b点时取样、角蛋白氮源培养基
C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D．c点时取样、角蛋白氮源培养基
解析：研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，所以D项正确，A、B、C三项错误。
答案：D
1．微生物培养中的无菌操作技术
2．选择培养基与鉴别培养基的比较
种类 原理 用途 举例
选择培养基 依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计 从众多微生物中分离出所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基 依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计 鉴别不同种类的微生物 伊红—亚甲蓝培养基可以鉴别大肠杆菌
3.筛选目的微生物的原理与实例
(1)原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。因此，可以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。
(2)实例
4．辨析统计菌落数的两种方法
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝C/V×M。C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数，V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
题点一：围绕微生物的培养和无菌技术，考查理解能力
1．(2023·广东茂名检测)从土壤中筛选产脲酶细菌的过程如图所示，表中记录了在适宜条件下培养一段时间后的实验结果，下列有关说法错误的是(　　)
稀释度(倍) 106 107 108
平板 1 2 3 1 2 3 1 2 3
平板菌落数(个) 432 421 445 78 67 74 9 6 8
注：表中各平板上均接种稀释土壤样品溶液0.1 mL
A．取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌
B．进行逐级稀释操作时不需要在无菌环境中进行
C．培养基①②的作用分别是筛选和鉴定
D．应选择稀释度为107倍的平板估算土壤样品中细菌数
解析：为了防止杂菌污染，取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌，A项正确；逐级稀释操作应在无菌环境中进行，以防止杂菌污染，B项错误；据图可知培养基①为选择培养基，初步筛选的产脲酶细菌还应该进行鉴定，培养基②的作用是鉴定，C项正确；计数时，应选择菌落数为30～300的平板进行计数，因此应选择稀释度为107倍的平板估算土壤样品中细菌数，D项正确。
答案：B
题点二：围绕微生物的分离和计数，提升综合实践能力
2．(2023·广东实验中学模考)生物学是一门以实验为基础的自然科学，实验中使用的材料以及实验方法在很大程度上决定着实验的成败，下列有关生物学实验及研究的叙述正确的有(　　)
①调查某种鱼的种群密度及跳蝻的种群密度都可用标记重捕法
②在实验室利用无菌培养液培养酵母菌，酵母菌种群数量达到K值后稳定时间的长短与培养液中营养物质的含量有关
③种群数量的变化可利用数学模型描述、解释和预测
④黑光灯诱捕的方法可用于探究农田里昆虫的物种数目
⑤血细胞计数板计数时，应先盖上盖玻片，再在边缘滴培养液，让其自行渗入计数室
A．①②③④ B．②③⑤
C．②③④⑤ D．②④⑤
解析：①调查某种鱼的种群密度可采用标记重捕法，调查跳蝻的种群密度用样方法，①错误；②在实验室利用无菌培养液培养酵母菌，酵母菌种群数量达到K值后稳定时间的长短与培养液中营养物质的含量有关，营养物质缺乏后，酵母菌种群数量将减少，②正确；③种群数量的变化可利用数学模型(如坐标曲线、数学公式等)描述、解释和预测，③正确；④黑光灯诱捕的方法只能用于探究农田里具有趋光性昆虫的物种数目和种群数量，④错误；⑤血细胞计数板计数时，应先盖上盖玻片，再在边缘滴培养液，让其自行渗入计数室，⑤正确；综上，本题正确的表述为②③⑤。
答案：B考点二　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
　(2023·广东卷)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
解析：裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A项正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B项正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C项正确；将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D项错误。
答案：D
1．DNA粗提取与鉴定原理和实验流程
(1)原理
①DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，其中在物质的量浓度为0.14 mol/L时最低。
②DNA不溶于冷却的酒精，但是细胞中的一些有机物如某些蛋白质则溶于冷却的酒精，可以用冷却的酒精提纯。
③DNA遇二苯胺(沸水浴)会被染成蓝色，因此，二苯胺可用来鉴定DNA分子。
(2)实验流程
实验材料的选取→破碎细胞，获取含DNA的滤液→去除滤液中的杂质→DNA的析出与鉴定。
(3)注意事项
①实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
②提取和分离DNA用塑料离心管的原因：细胞破碎后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附；由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。
2．DNA片段的扩增
(1)原理：利用PCR在体外扩增DNA分子。
(2)实验用具：PCR仪、微量离心管、微量移液器。
(3)实验步骤
①移液：按配方用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分；
②离心：使反应液集中在微量离心管的底部。
③反应：设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
3．DNA片段的电泳鉴定
(1)原理
①DNA分子中的可解离基团，在一定的pH条件下会带上正电荷或负电荷。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
④凝胶中的DNA分子通过染色，在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
(2)实验步骤
①制胶：提前将模具和梳子准备好，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后加入适量的核酸染料混匀，倒入模具，并插入梳子。
②形成加样孔：待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
③上样
④电泳：接通电源，设定电压，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑤拍照：取出凝胶，置于紫外灯下观察和照相。
特别提醒
　PCR实验操作的四点提醒
(1)为避免外源DNA等因素的污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃条件下储存。
(3)每添加一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。
(4)混合均匀后要离心处理，使反应液集中在离心管底部。
题点一：通过DNA粗提取和鉴定，考查实验探究能力
1．(2023·广东梅州统考三模)以菜花为材料提取DNA时，需将材料进行研磨，研磨液的成分常含有SDS(蛋白质变性剂)、EDTA(DNA酶抑制剂，稳定DNA活性)、Tris(缓冲剂)。下列有关叙述错误的是(　　)
A．若选择鸡血细胞为材料，则省去了研磨过程
B．SDS可以使蛋白质变性，便于DNA与蛋白质分离
C．EDTA可以防止DNA水解成核糖核苷酸
D．Tris可以调节溶液中的pH
解析：鸡血细胞悬浮液作为实验材料，利用细胞吸水涨破的原理，省去了研磨过程，A项正确；SDS是蛋白质变性剂，可使蛋白质结构变得松散，使染色体中DNA和蛋白质分离，B项正确；DNA的基本单位是脱氧核苷酸，EDTA是DNA酶抑制剂，可以防止DNA水解成脱氧核苷酸，C项错误；Tris是缓冲剂，可调节溶液中的pH，D项正确。
答案：C
题点二：围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查实验操作能力
2．(2023·广东一模)新冠病毒包膜表面的S蛋白能识别人体细胞膜表面的ACE2受体并导致病毒入侵人体细胞。制备重组亚单位新冠疫苗的线路是：提取新冠病毒RNA→通过RT－PCR(反转录酶聚合酶链式反应)技术扩增筛选RBD蛋白(S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分)基因(图1)→构建基因表达载体(图2)→导入CHO细胞并培养→提取并纯化RBD蛋白→制成疫苗。图3为利用电泳技术对PCR的产物进行纯度鉴定，1号泳道为标准(Marker)，2号泳道为阳性对照组，3号泳道为实验组。下列相关叙述错误的是(　　)
　　
A．利用RT-PCR技术获取RBD蛋白基因时，需加入逆转录酶、TaqDNA聚合酶
B．利用PCR扩增含有限制酶切点的RBD蛋白基因时，应选择的引物为引物4、引物5
C．2号泳道是以(提纯的)RBD蛋白基因片段为材料所做的阳性对照组
D．为提高目的基因和运载体的正确连接效率，应选择限制酶EcoRⅠ切割
解析：RT-PCR技术是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术，利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因时，需加入逆转录酶、Taq DNA酶，A项正确；引物与模板链的3′端碱基互补配对，故引物1、引物2、引物7和引物8不合适，扩增得到的RBD蛋白基因也应该含有限制酶的酶切位点，故引物3和引物6不合适，故选引物4和引物5，B项正确；PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准(Marker)，2号泳道是以RBD蛋白基因片段为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组，C项正确；质粒上没有SmaⅠ酶切位点，且若使用EcoRⅠ酶切，易造成目的基因和质粒自身环化，故应该选择BamHⅠ和Hind Ⅲ，D项错误。
答案：D[高考命题热点十 ]　荧光定量PCR技术
与PCR技术相关的生物学科素养主要体现角度：
1．生命观念主要体现
(1)物质与能量观：PCR扩增目的基因需要模板、原料并消耗能量。
(2)结构与功能观：PCR仪、微量移液管、微量离心管等的使用以及注意事项。
2．科学思维主要体现
(1)归纳与概括：比较PCR技术和DNA体内复制的异同。
(2)分析与推理：PCR技术中引物的选取。
3．科学探究主要体现
(1)实验操作能力：探究DNA片段的扩增及电泳实验中PCR反应体系的配方的配制以及实验流程中的动手操作能力。
(2)实验现象的观察、分析能力：对DNA片段的扩增及电泳实验结果的观察、分析。
4．社会责任主要体现
PCR扩增的用途包括获取目的基因、对感染疾病(核酸检测)的诊断等。
　(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备______________________。
(3)转化后，TDNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图1)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见图2，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DA1基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DA1基因后，应该用同种限制性内切酶核酸对DA1基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(TDNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因，由于TDNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
答案：(1)野生型
(2)运载体　启动子和终止子
(3)①DA1基因和卡那霉素抗性基因　②75　③自交　100　图见解析
1．(2023·广东梅州大埔县虎山中学校考模拟预测)新冠病毒的抗原性与感染性与其表面的S蛋白(刺突糖蛋白)密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建S蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。请回答下列问题。
(1)①过程所使用的酶为______，为保证PCR技术扩增S蛋白基因正常进行，该反应体系的主要成分有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
PCR技术中低温复性的目的是__________________。
(2)通过PCR技术可在cDNA分子中专一性扩增出S蛋白基因，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
PCR过程经过4次循环，需要的引物的数量是________个。
(3)构建好的重组质粒长度共2 000bp，用限制酶HindⅢ及限制酶HindⅢ和BamHⅠ分别对重组质粒进行切割并电泳，结果如图乙所示，可推测BamHⅠ在重组质粒上有______个酶切位点。
(4)腺病毒疫苗进入人体后，S蛋白基因利用人体细胞的蛋白质表达系统指导S蛋白的合成，其过程是________________________(用文字和箭头表示)。
解析：(1)①过程是利用RNA合成DNA的过程，是逆转录，需要逆转录酶，PCR过程中，其反应体系的主要成分有模板DNA、脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶；低温复性的目的是让引物结合到互补DNA链。(2)由于在PCR技术中引物是根据S蛋白基因的一段已知序列设计合成的，所以能够专一性的扩增出S蛋白基因。PCR技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n＋1－2，因此若一个该DNA分子在PCR仪中经过4次循环，需要24＋1－2＝30个引物。(3)用HindⅢ将质粒2 000bp切割后形成了形成了200bp、400bp和1 400bp共3个片段，而用HindⅢ和BamHⅠ将质粒切割后形成了200bp、420bp、560bp的片段，2 000＝420×2＋560＋200×3，所以一共形成了6个片段，因此有5个酶切位点，因此BamHⅠ在重组质粒上有5－2＝3个酶切位点。(4)腺病毒载体重组新型冠状病毒疫苗中决定S蛋白产生的为cDNA，S蛋白的产生包括以DNA的一条链为模板合成mRNA的转录过程和以mRNA为模板合成蛋白质的翻译过程，其过程如下：S蛋白的cDNA→转录→mRNA→翻译→蛋白。
答案：(1)逆转录酶　模板DNA、脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶　引物结合到互补DNA链
(2)引物是根据S蛋白基因的一段已知序列设计合成的　30
(3)3
(4)S蛋白的cDNA→转录→mRNA→翻译→蛋白
2．(2023·广东统考模拟预测)DNA条形码相当于物种的身份证，是利用短的标准DNA片段对物种进行快速鉴定的新技术，在发现新物种、保护野生动物、监督外来入侵物种等方面有重要作用。该技术的主要步骤为提取样本DNA、PCR扩增、产物测序及序列比对，最后将结果提交至DNA序列数据库。线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)被公认为动物DNA标准条形码片段并得到广泛应用。
(1)如何判断两个生物是否为同一物种？________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
但该方法不适用于只能进行无性生殖的生物，DNA条形码正好可弥补这一缺陷。
(2)采用稀释涂布平板法和平板划线法能将单个微生物分散在固体培养基上，经培养获得单菌落，最终通过观察菌落的____________等特征来进行初步的物种鉴定。
(3)已知某种动物COXⅠ基因单链的核苷酸序列(虚线处省略了部分序列)为5′—GGTCAACAA…TGAAGTTTA—3′，利用PCR扩增COXⅠ基因时所需的引物序列为(已知引物的长度为9个核苷酸)________________________________和________________________________，所需的酶为______________________________，该酶在实际PCR过程中的最适温度为________。
(4)扩增得到的PCR产物在测序之前一般先通过________对产物进行初步鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与
________________________________________________________________________
等有关，加样之前需要将PCR产物与________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。
解析：(1)能够在自然状态下相互交配并且产生可育后代的一群生物称为一个物种，不同物种间一般是不能相互交配的，即使交配成功，也不能产生可育的后代。(2)采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，经培养获得单菌落。一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，通过观察菌落的形状、大小和颜色等特征可初步进行物种鉴定。(3)由于子链合成的方向是从子链的5′端向3′端延伸，引物选择如箭头所示，，根据碱基互补配对原则，引物为5′—GGTCAACAA—3′和5′—TAAACTTCA—3′。PCR不需要DNA解旋酶，但需要耐高温的DNA聚合酶，该酶在实际PCR过程中的最适温度为72℃。(4)琼脂糖凝胶电泳可对DNA分子进行鉴定，也可实现样品中各种分子的分离。电泳过程中不同DNA分子产生的不同的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，加样之前需要将PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，凝胶载样缓冲液中的指示剂可以显示电泳过程，以便适时终止电泳。
答案：(1)能相互交配且能产生可育后代，则为同一物种；若不能交配或交配后不能产生可育后代，则为不同物种
(2)形状、大小和颜色
(3)5′－GGTCAACAA－3′　5′－TAAACTTCA－3′　耐高温的DNA聚合酶　72 ℃
(4)琼脂糖凝胶电泳　凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象　凝胶载样缓冲液(内含指示剂)
3．(2023·广东一模)表面展示技术是通过重组DNA技术，将外源蛋白与细胞表面的蛋白质组装成融合蛋白，从而可展示在细胞表面。回答下列问题。
(1)若要将芽孢表面蛋白基因cotB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，下图中最适合通过绿色荧光(绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光)确定融合蛋白成功表达的是____。
注：Ampr为氨卡青霉素抗性基因；→表示转录方向；UAG，UAA，UGA是终止密码子，AUG是起始密码子。
(2)芽孢表面蛋白是实现表面展示技术的关键蛋白，结合上述材料，试分析该蛋白在表面展示技术中的作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)导入基因表达载体后的芽孢杆菌接种在含有____________的固体培养基上，以获得携带载体的单菌落，该过程被称为微生物的____培养。
(4)培养基中可能既有含基因表达载体的单菌落，也有含________的单菌落，因此还需要对DNA进行提取，常用酒精初步分离DNA和蛋白质，这里酒精的作用原理是________________________________________________________________________
______________。
(5)若要确定表面展示技术在芽孢杆菌上构建成功，应在紫外光环境下对其进行______水平的检测。
解析：(1)若要将芽孢表面蛋白基因cotB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，则需要将cotB和gfp一起表达，即使用一个启动子和终止子，并且cotB在前，gfp在后，才能通过绿色荧光(绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光)确定融合蛋白成功表达，为了能够顺利表达gfp则中间不能出现终止密码子，转录时模板链的方向应是3′到5′，D中mRNA中间会出现终止密码。只有C项符合题意，C项正确。(2)蛋白在表面展示技术中的作用是芽孢表面蛋白是可以定位在细胞表面的，在与外源蛋白形成融合蛋白后，可将外源蛋白展示(定位在芽孢杆菌表面)。(3)由于表达载体中含有Ampr基因，则若转基因成功能够在含有氨苄青霉素的培养基上生长，所以可以将芽孢杆菌接种在含有氨苄青霉素的固体培养基上，以获得携带载体的单菌落，该过程被称为微生物的选择培养。(4)培养基中可能既有含基因表达载体的单菌落，也有含空载体(不含目的基因的载体、不含外源基因的载体)的单菌落，因此还需要对DNA进行提取，然后进行鉴定，由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，所以可以用酒精初步分离DNA和蛋白质。(5)由于绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光，所以可在紫外光环境下对芽孢杆菌进行个体(细胞)水平进行检测。
答案：(1)C
(2)芽孢表面蛋白是可以定位在细胞表面的，在与外源蛋白形成融合蛋白后，可将外源蛋白展示/定位在芽孢杆菌表面
(3)氨苄青霉素/Amp　选择
(4)空载体(不含目的基因的载体、不含外源基因的载体)　DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
(5)个体/细胞
4．(2023·广东一模)中国科学家采集了某深海海域的沉积物样品，分离、鉴定得到其中的深海放线菌，以期获得具有前景的抗生素替代品。据此回答下列问题：
(1)研究人员欲筛选出深海放线菌进行研究，取1 g沉积物样品接种在液体培养基中摇瓶培养，稀释后取菌液通过__________法接种到高氏一号(加数滴质量分数为10%的酚)培养基表面以获得单菌落。培养基中的酚能抑制细菌等杂菌的生长，而放线菌能在该培养基上正常生长，这种培养基属于__________(填“选择”或“鉴别”)培养基。
(2)通过PCR技术扩增分离得到的放线菌的16S rRNA基因可进行菌株的种属鉴定。PCR技术中起关键作用的酶是__________。该技术能在放线菌总的DNA中专一性扩增出16S rRNA基因的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
PCR产物一般可通过__________鉴定。
(3)紫色杆菌的紫色菌素(一种毒素，致死率高)能使培养基呈紫色，已知呋喃酮C30能明显抑制紫色菌素的产生。研究人员筛选出了放线菌菌株A，用甲醇将菌株A发酵产物提取后配制成溶液，对提取物能否抑制紫色菌素的产生进行了研究。
①将紫色杆菌菌液均匀地涂布在培养基表面，待菌液干燥后，将无菌圆纸片贴于培养基表面，按图1所示在滤纸片上滴加溶液。该实验以__________组为对照，通过比较A、B、C三组的__________可知提取物是否能抑制紫色菌素的产生。
②实验表明甲醇溶液不会影响紫色杆菌的繁殖，培养过程中对A、B、C三组紫色杆菌的数量进行监测，结果如图2所示，据图推测，深海放线菌A的提取物作为抗生素替代品的优点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)分离和纯化微生物常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法，题干信息提示菌液已经先经过稀释，推知这里的接种方法是稀释涂布平板法。该培养基允许放线菌生长，同时抑制或阻止其他细菌等杂菌的生长，推知该培养基为选择培养基。(2)PCR技术的变性(90℃以上)、复性(50℃左右)、延伸(72℃左右)阶段需要的温度都比较高，所以需要耐高温的DNA聚合酶。引物是一段能与DNA母链部分碱基互补配对的短单链核酸，因此能特异性扩增出目的基因片段，该PCR中引物能与16S rRNA基因特异性结合，因此能在放线菌总的DNA中专一性扩增出16S rRNA基因。PCR扩增的产物是DNA分子，DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH条件下，这些基团可以带上正电荷或者负电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带的电荷相反的电极移动，因此PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。(3)①研究提取物的作用时，一般需要设置空白对照和阳性对照。由题干可知呋喃酮C30能明显抑制紫色菌素的产生，推知阳性对照滴加5μL呋喃酮C30，而菌株A发酵产物通过甲醇提取，推知空白对照滴加5μL甲醇溶液，即该实验以A、C组为对照。由于紫色菌素使得培养基呈紫色，若提取物能抑制紫色菌素产生，则会产生褪色圈(透明圈)，根据褪色圈的直径即可推知其抑制作用大小。②由图1可知，滴加呋喃酮C30和菌株A提取物后，紫色杆菌的数量与空白对照组(滴加甲醇溶液)差别不大，推知提取物不会影响致病菌的生长，但是致病菌产生的紫色菌素却有区别，推知提取物不会对致病菌进行选择，使得其不会产生耐药性。
答案：(1)稀释涂布平板/涂布平板　选择
(2)耐高温的DNA聚合酶　引物能与16S rRNA基因特异性结合/引物是根据16S rRNA基因一段已知序列设计合成的　琼脂糖凝胶电泳
(3)①A、C　褪色(透明)圈直径　②不会影响致病菌的生长，从而不会胁迫致病菌使其产生耐药性/不易对致病菌形成选择压力而导致其产生耐药性
5．(2023·广东一模)β-丙氨酸作为重要的中间体，广泛应用于医药、食品、化工等领域。L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)能够催化β-丙氨酸的生成，但天然PanD活力(酶活力是指酶催化一定化学反应的能力)较低且易失活。研究人员运用蛋白质工程对酶基因进行分子改造，在未知PanD三维结构和功能关系的情况下，通过易错PCR技术引入随机突变，再进行定向筛选，最终获得活力和稳定性均较高的PanD。回答下列问题。
(1)易错PCR与普通PCR相似，每次循环也包括了__________________________三步，但可通过改变PCR反应条件来提高碱基错配的几率。在PCR反应体系中，Mg2＋可以提高已发生错配区域的稳定性，Mn2＋可以降低DNA聚合酶对底物的专一性。因此，与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当______(填“提高”或“降低”)Mg2＋浓度、______(填“提高”或“降低”)Mn2＋浓度。通过多轮的易错PCR及筛选，可以获取所需的PanD基因。
(2)研究人员对比改造前后的两种PanD，发现改造后的PanD的第305位氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸，推测突变后酶活力升高的原因是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)为将能表达高活力PanD的大肠杆菌应用于工业发酵生产β-丙氨酸，研究人员还探究了发酵的最佳反应条件，研究中发现了随着底物浓度升高，β-丙氨酸产量下降的现象，推测其原因可能是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
因此在工业生产中，要采用________________(填“一次足量添加”或“多次分批补料”)的投料策略。
解析：(1)PCR每次循环包括：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③升温延伸：合成子链。易错PCR与普通PCR相似，每次循环也包括了变性、复性、延伸三步。PCR技术是指通过DNA的双链复制，在耐高温的TaqDNA聚合酶的催化下，遵循碱基互补配对原则，扩增DNA片段。TaqDNA聚合酶的负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2＋可以降低DNA聚合酶对底物的专一性，也就是说Mn2＋能提高碱基与模板链的错配，增加其突变率；非互补的碱基对由于氢键不易形成，稳定性差，Mg2＋可以提高该错配区的稳定性，因此与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当提高Mg2＋浓度，提高Mn2＋浓度。(2)组成PanD酶的305位氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸后，由于该酶的氨基酸种类改变，导致酶的空间结构发生改变，结构决定功能，进而使酶活力提升。(3)将能表达高活力PanD的大肠杆菌应用于工业发酵生产β丙氨酸，随着底物浓度升高，导致发酵液浓度增加，进而使大肠杆菌失水较多，甚至死亡，不能高效的表达高活力PanD，为了维持发酵液的浓度，在工业生产中，要采用多次分批补料的投料策略。
答案：(1)变性、复性、延伸　提高　提高
(2)组成PanD的氨基酸种类改变，导致酶的空间结构发生改变，进而使酶活力提升
(3)随着底物浓度升高，导致发酵液浓度增加，进而使大肠杆菌失水较多，甚至死亡，不能高效的表达高活力PanD　多次分批补料考点三　胚胎工程及生物技术的安全性与伦理问题
　(2023·广东卷)科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作是(　　)
A．超数排卵 B．精子获能处理
C．细胞核移植 D．胚胎培养
解析：由题干信息可知，该过程通过体外受精获得胚胎，再通过胚胎移植，使长角羚羊成功妊娠并产仔，因此需要进行超数排卵、精子获能处理，并对获得的受精卵进行胚胎培养；由于该过程为有性生殖，因此不需要涉及细胞核移植，所以C项正确、A、B、D三项错误。
答案：C
1．早期胚胎发育过程的流程分析
2．熟知胚胎工程的操作流程
3．归纳胚胎工程中的5个“两”
(1)受精过程中的两个标志
受精的标志是卵细胞膜和透明带之间观察到两个极体，受精完成的标志是雌雄原核融合完成。
(2)胚胎移植过程中两次使用激素
第一次是对供、受体进行同期发情处理。
第二次用于供体的超数排卵。
(3)胚胎移植过程中两次检查
第一次对收集的胚胎进行检查。
第二次对受体是否妊娠进行检查。
(4)胚胎移植或分割的两个时期：桑葚胚和囊胚。
(5)胚胎干细胞的两个来源：早期胚胎和原始性腺。
4．试管婴儿与克隆人
(1)试管婴儿的培育过程
(2)设计试管婴儿的过程
(3)克隆人的培育过程
题点一：通过胚胎工程及应用，考查理解能力
1．(2023·广东惠州统考)2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。在培育过程中，我国科学家经过多年的反复试验，可以在10S之内对卵母细胞进行去核操作，在15S之内将体细胞注入去核的卵母细胞里。培育克隆猴的流程如下图所示，请结合图回答问题。
注：①Kdm4d：组蛋白去甲基化酶　②TSA：组蛋白脱乙酰酶抑制剂
(1)为获得数量较多的卵母细胞，采集前应先用__________激素处理母猴，从卵巢采集到的卵母细胞经成熟培养后进行“去核”处理，这里的“核”是指________________________________________________________________________。
在对卵母细胞去核时，还应同时去除透明带内的____________(细胞)。
(2)研究人员在将胎猴的体细胞注入去核卵母细胞前，用灭活的仙台病毒进行了短暂处理。在此过程中，灭活的仙台病毒所起的作用是________________。将体细胞注入去核卵母细胞比早期核移植中将核注入去核卵母细胞更有进步意义，原因是________________________________________________________________________。
(3)研究人员将Kdm4d的mRNA注入了重构胚，同时用TSA处理了它。这两种物质都是通过改变组蛋白的表观遗传修饰来调控基因表达，即组蛋白去甲基化酶Kdm4d的mRNA的作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________；
组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA的作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________，
最终调节相关基因的表达，提高胚胎的发育率和妊娠率。
(4)该项技术的成功使短期培育大批具有相同遗传背景的克隆猴成为可能，有什么意义？________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。(答出1点即可)
解析：(1)用(外源)促性腺(激素)处理母猴，可获得数量较多的卵母细胞。从卵巢采集到的卵母细胞经成熟培养后进行“去核”处理，这里的“核”是指纺锤体—染色体复合物，同时去除透明带内的第一极体。(2)灭活的仙台病毒可以促进动物细胞融合。卵细胞细胞质可使体细胞核全能性得到表达，与卵细胞的细胞质营养物质丰富有关，也可能因为卵母细胞大，便于操作，更易成功。(3)Kdm4d是组蛋白去甲基化酶，则Kdm4d可以表达组蛋白去甲基化酶，降低组蛋白的甲基化水平。TSA是组蛋白脱乙酰酶抑制剂，可以抑制组蛋白脱乙酰酶的作用，提高组蛋白的乙酰化水平最终调节相关基因的表达，提高胚胎的发育率和妊娠率。(4)该项技术的成功使短期培育出排异反应小的器官移植供体、对个体生长发育机制的研究、疾病致病机制的研究、疾病模式动物的获得、新药的研发等具有重要意义。
答案：(1)(外源)促性腺(激素)　纺锤体—染色体复合物　第一极体/极体
(2)诱导细胞融合　操作简便，对卵母细胞损伤小
(3)可以表达组蛋白去甲基化酶，该酶能降低组蛋白的甲基化水平　抑制组蛋白脱乙酰酶的作用，提高组蛋白的乙酰化水平
(4)排异反应小的器官移植供体、对个体生长发育机制的研究、疾病致病机制的研究、疾病模式动物的获得、新药的研发等具有重要意义
题点二：借助生物技术的安全性和伦理问题，考查社会责任
2．(2023·广东汕头统考三模)经国家的积极努力，脊髓性肌萎缩症(SMA)的特效药于2021年纳入医保目录。SMA是一种常染色体隐性遗传病，一般是SMNⅠ基因发生部分碱基缺失引起的，主要表现为肌无力、肌肉萎缩等。下列相关分析，正确的是(　　)
A．产前诊断是优生优育的重要手段，孕期可通过产前B超检查胎儿是否患SMA
B．一对表型正常的夫妻，若第一个儿子为SMA患儿，则再次生下SMA儿子的概率为
C．SMNⅠ基因突变，将引起表达产物中氨基酸数量减少，蛋白质空间结构异常而致病
D．第三代试管婴儿技术，可在胚胎移植前进行遗传学诊断，可帮助双方均为携带者的夫妻生下健康宝宝
解析：分析题意可知，SMA是一种常染色体隐性遗传病，该类遗传病无法通过产前B超检查确定胎儿是否患病，A项错误；SMA是一种常染色体隐性遗传病，设为A/a，一对表型正常的夫妻，若第一个儿子为SMA患儿aa，则该夫妇基因型都是Aa，再次剩下SMA儿子的概率＝×＝，B项错误；SMNI基因突变是由于基因发生部分碱基缺失引起的，碱基缺失可能引起mRNA上的密码子减少，但不一定会引起氨基酸数量减少，可能因为碱基缺失而引起终止密码延迟出现，导致氨基酸数量增多，C项错误；“第三代试管婴儿”也称胚胎植入前遗传学诊断技术，指在胚胎移植前，取胚胎遗传物质进行分析，诊断胚胎是否异常，是减少出生缺陷儿的有效方法，第三代试管婴儿技术，可在胚胎移植前进行遗传学诊断，可帮助双方均为携带者的夫妻生下健康宝宝，D项正确。
答案：D考点二　动物细胞工程
　(2023·湖北卷)某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
诱导融合
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含浆细胞)__________(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对______________和______________________生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是________。
解析：(1)浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原—抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。(4)DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5′端，—OH位于3′端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5′端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3′端的—OH相连，④符合题意。故选④。
答案：(1)不需要　使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2)未融合的亲本细胞　融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
1．归纳动物细胞培养的营养成分、过程及相关酶
(1)胰蛋白酶的两次使用：首先用胰蛋白酶处理动物的器官或组织，以制备单细胞悬液；培养过程中发生接触抑制时，同样要用胰蛋白酶处理使细胞分散开。
(2)避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理；加入一定量的抗生素；定期更换培养液。
(3)特殊的营养条件
①液体培养基。
②加入血清、血浆等。
③通入O2以满足代谢的需要。
④通入CO2以维持培养液的pH。
(4)培养过程：原代培养、传代培养。
2．理清克隆动物培育流程
3．准确记忆单克隆抗体的“一过程两特点”
(1)制备过程
(2)单克隆抗体的特点：能够准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并可以大量制备。
4．明确单克隆抗体制备过程中两次筛选的原因、方法及目的
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选原因 诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合的细胞 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
筛选方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种融合细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞能生长 用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群
筛选目的 得到杂交瘤细胞 得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
题点一：通过动物细胞培养和核移植技术，考查理解能力
1．(2023·广东汕头统考二模)将一只黑色小鼠(2n＝40)囊胚期的细胞嵌入到一只白色小鼠的囊胚腔中。在发育过程中，这两只小鼠的细胞混合到了一起，最后形成了一只黑白相间的嵌合体小鼠(二倍体)。下列分析正确的是(　　)
A．培育嵌合体与获得克隆动物都利用了动物细胞核移植技术
B．黑色小鼠嵌入白色小鼠囊胚腔的细胞应该是滋养层细胞
C．嵌合体小鼠出现黑白相间的毛色是基因选择性表达的结果
D．该嵌合体小鼠的胚胎细胞有丝分裂后期的染色体数目为80
解析：培育嵌合体利用了动物细胞融合技术，克隆动物利用了动物细胞核移植技术，A项错误；黑色小鼠嵌入白色小鼠囊胚腔的细胞应该是内细胞团细胞，B项错误；嵌合体小鼠出现黑白相间的毛色是细胞融合的结果，C项错误；该嵌合体小鼠的染色体数为40条，则胚胎细胞有丝分裂后期的染色体数目为80，D项正确。
答案：D
题点二：围绕单克隆抗体的制备及应用，考查综合应用能力
2．(2023·广东模拟预测)新型冠状病毒可通过表面的棘突蛋白(S蛋白)与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。图l为病毒侵入后，人体内发生的部分免疫反应示意图。单克隆抗体可阻断病毒的粘附或入侵，故抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。图2为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。
请据图回答下列问题：
(1)图1中人体内抗原呈递细胞吞噬病毒，并将病毒的抗原暴露在细胞表面，被________细胞表面的受体识别。
(2)B细胞识别入侵的病毒后，在细胞因子作用下，经过细胞的________，形成________细胞。
(3)为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测病毒的________：采集血液样本主要用于血清学检查，检测________：另外通过胸透检测胸部是否有病毒侵染的阴影，也可辅助诊断。
(4)据图2所示，研制抗S蛋白单克隆抗体时，需先给小鼠注射S蛋白以激活小鼠的免疫细胞。细胞①、②融合常用的化学法是用________________作为诱导剂。用HAT培养基筛选获得③，再经多次筛选出的④为________________________，该细胞的特点是________________________________。
解析：(1)据图1可知，人体内抗原呈递细胞吞噬新冠病毒，并将新冠病毒的抗原暴露，呈递给辅助性T细胞，即被辅助性T细胞表面的受体识别后激活该细胞。(2)B细胞识别入侵的病毒后，在细胞因子的作用下，进行增殖、分化，大部分形成浆细胞，少部分形成记忆细胞。(3)抗体主要存在于血清中。临床上为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测疑似患者的呼吸道是否有新冠病毒的核酸；采集血液样本主要用于血清学检查，检测血清中是否产生抗新型冠状病毒的抗体。(4)诱导动物细胞融合的化学方法是用聚乙二醇做诱导剂。在HAT培养基上，未融合的B细胞、未融合的骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的细胞、B细胞与B细胞融合的细胞都不能生长，只有骨髓瘤细胞与B细胞融合形成的杂交瘤细胞才能生长，所以用HAT培养基筛选获得杂交瘤细胞。因此用HAT培养基筛选获得③，再经多次筛选出的④为能产生特定抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。
答案：(1)辅助性T
(2)增殖、分化　浆细胞和记忆B
(3)核酸/RNA　抗新型冠状病毒抗体
(4)聚乙二醇/PEG　能产生特定抗体的杂交瘤细胞　既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体第16讲　细胞工程及生物技术的安全性与伦理问题
答案：?植物细胞的全能性　?愈伤组织　?细胞增殖　?动物细胞核的全能性　?细胞膜的流动性　?生物法　?特定抗体
1．(选择性必修3 P37“探究·实践”)菊花组织培养的再分化过程中，若愈伤组织在诱导生根的培养基中没有形成根，但分化成了芽，其可能的原因是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
提示：培养基中生长素用量和细胞分裂素用量的比值偏低。
2．(选择性必修3 P41“文字信息”)传统生产紫杉醇的方法不利于对野生红豆杉的保护，我国科学家经过多年研究，筛选出了高产紫杉醇的细胞。请简要表述工业化生产紫杉醇的方法。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
提示：利用植物组织培养技术把离体的红豆杉细胞培养成愈伤组织，从中提取紫杉醇，进行加工生产。
3．(选择性必修3 P46“文字信息”)基因工程的受体细胞选用胚胎干细胞，而不选用造血干细胞，原因是什么？
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提示：胚胎干细胞具有发育的全能性。
4．(选择性必修3 P50“思考·讨论”)制备ADC时应选择相对分子质量较小的抗体，理由是什么？
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提示：相对分子质量小的抗体携带药物到达细胞外间隙的深部更容易，杀伤肿瘤细胞效果更好。
5．(选择性必修3 P53图2－18)通常用去核的卵母细胞作为受体细胞的原因是什么？
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提示：它体积大、易操作、营养物质丰富，细胞质中含有促进细胞核全能性表达的物质。
6．(选择性必修3 P63图2－25)对发育到囊胚期的牛胚胎进行二分胚分割时，要将内细胞团均等分割，原因是什么？
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提示：以免影响胚胎的恢复和进一步发育。
1．我国科学家在木本植物的体细胞杂交方面取得了不少成果，培育出了多种同属不同种的杂种植株。植物体细胞杂交技术与传统育种方法相比，在哪些方面展示出独特的优势。
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答案：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等。
2．利用动物细胞融合获得的杂交瘤细胞的特点是什么？最终制备的单克隆抗体的优点是什么？
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答案：动物细胞融合所获得的杂交瘤细胞的特点是既能无限增殖，又能产生专一性抗体；单克隆抗体的优点是能够准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原特异性结合，并且可以大量制备。
3．何为超数排卵？其意义是什么？
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答案：超数排卵是应用外源促性腺激素诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。超数排卵可以增加优良种畜的繁殖数量。
考点一　植物细胞工程
　(2023·广东卷)人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合，以提高人参皂苷的产率。下列叙述错误的是(　　)
A．细胞融合前应去除细胞壁
B．高Ca2＋—高pH溶液可促进细胞融合
C．融合的细胞即为杂交细胞
D．杂交细胞可能具有生长快速的优势
解析：在细胞融合前，必须先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，再诱导原生质体融合，A项正确；人工诱导原生质体融合有物理法和化学法，用高Ca2＋—高pH溶液可促进细胞融合，B项正确；融合的细胞中有人参根－人参根细胞、人参根－胡萝卜根细胞、胡萝卜根－胡萝卜根细胞，只有人参根－胡萝卜根细胞才是杂交细胞，C项错误；杂交细胞含两种细胞的遗传物质，可能具有生长快速的优势，D项正确。
答案：C
1．总结植物细胞工程的知识点
(1)原理：植物细胞全能性、细胞膜的流动性。
(2)技术：植物组织培养、植物体细胞杂交技术。
(3)应用
①植物繁殖的新途径：快速繁殖、作物脱毒；
②培育作物新品种：单倍体育种、突变体育种；
③细胞产物的工厂化生产。
2．图示植物细胞工程的基本技术
特别提醒
有关植物细胞工程的几个关键问题
　(1)植物细胞A和植物细胞B杂交获得的杂种细胞的类型有三种：AA型、BB型、AB型，符合要求的只有AB型，需要进行筛选。
(2)杂种细胞形成的标志：杂种细胞再生出新的细胞壁。
(3)杂种植株遗传物质的变化：杂种植株的变异类型属于染色体变异，杂种植株的染色体数通常是两亲本细胞染色体数目之和，杂种植株属于异源多倍体。
(4)利用植物组织培养生产细胞产物时，有时只需将外植体培养到愈伤组织，从愈伤组织中获取产物。
(5)具有全能性≠体现全能性
①具有全能性：理论上，具有细胞核的活细胞都具有全能性。
②体现全能性：只有发育成完整生物体或能分化成其他各种细胞，才能说明体现了细胞的全能性。
3．植物激素对植物组织培养的影响
(1)使用顺序不同实验结果不同
使用顺序 实验结果
先使用生长素，后使用细胞分裂素 有利于细胞分裂，但细胞不分化
先使用细胞分裂素，后使用生长素 细胞既分裂也分化
同时使用 分化频率提高
简记为：先“生”分裂不分化，后“生”分裂又分化，同“使”分化频率高
(2)生长素/细胞分裂素的值影响植物细胞的发育方向
生长素/细胞分裂素 植物细胞的发育方向
高 有利于根的分化，抑制芽的形成
低 有利于芽的分化，抑制根的形成
适中 促进愈伤组织的生长
简记为：“高”根，“低”芽，“中”愈伤
4.植物体细胞杂交过程中杂种细胞类型及检测方法
(1)诱导产生的杂种细胞类型(假设用于杂交的两种植物细胞分别为A、B)。
①未融合的细胞：A和B。
②两两融合的细胞：AA、BB和AB。
③多细胞融合体。
(2)检测方法：对诱导产生的细胞进行植物组织培养，然后根据得到的植物性状进行判断。
植物性状 结论
①只表现出一种植物的性状 未融合的细胞
②得到的是具有两种亲本性状的植物 杂种植株
③得到的是两种亲本性状的植物，且一种植物的性状得到加强 多细胞融合体
④得到的是一种植物的性状，但是效果得到加强 同种细胞融合的结果
5.杂种植株遗传物质变化的判断
(1)遗传特性：杂种植株中含有两种植物的遗传物质，具备两种植物的遗传特性。
(2)染色体组数
①染色体组数＝两种植物体细胞内染色体组数之和。
②植物体细胞杂交形成的杂种植株，有几个染色体组就称为几倍体。
③若一植物细胞含有2x条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb，另一植物细胞含有2y条染色体，2个染色体组，基因型为ccDd，则新植株应为异源四倍体，其体细胞中染色体为(2x＋2y)条，4个染色体组，基因型为AabbccDd。
题点一：围绕植物组织培养的过程和应用，考查理解能力
1．(2023·广东深圳模考)愈伤组织形成过程中，生长素和细胞分裂素信号通路相关基因存在DNA和组蛋白去甲基化现象。研究者利用桃叶片诱导愈伤组织，在培养基中添加DNA甲基转移酶抑制剂Aza或组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK，检测形成愈伤组织的面积，结果如图。据此分析正确的是(　　)
A．实验器材、培养基和桃叶片等需经高压蒸汽灭菌处理后使用
B．具有特定形态、排列疏松、有大液泡的结构即为桃愈伤组织
C．DNA去甲基化和组蛋白甲基化分别抑制、促进愈伤组织形成
D．推测表观遗传影响激素的信号转导过程进而影响脱分化过程
解析：桃叶片属于外植体，不能用高压蒸汽灭菌处理，A项错误；愈伤组织细胞是由一小团无定形状态的薄壁细胞组成的，即没有特定形态，B项错误；与对照组相比，在培养基中添加DNA甲基转移酶抑制剂Aza会使愈伤组织面积增加，说明DNA甲基转移酶抑制剂Aza会促进愈伤组织的形成，而DNA甲基转移酶抑制剂Aza可抑制甲基化的形成，因此DNA去甲基化可促进愈伤组织的形成，同理，与对照组相比，在培养基中添加组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK会使愈伤组织面积减小，说明组蛋白甲基化可抑制愈伤组织形成，C项错误；图示加入DNA甲基转移酶抑制剂Aza或组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK会影响愈伤组织的形成，而愈伤组织的形成是脱分化的结果，因此可推测表观遗传影响激素的信号转导过程进而影响脱分化过程，D项正确。
答案：D
题点二：围绕植物体细胞杂交的过程和应用，提升综合实践能力
2．(2023·广东华南师大附中校考三模)如图表示单克隆抗体的制备或植物体细胞杂交的部分过程，据图判断下列说法正确的是(　　)
A．动物细胞融合前需要用酶处理，植物细胞融合前则不需要
B．甲、乙细胞都不能是高度分化的细胞
C．动物细胞融合和植物细胞融合的方法相同
D．丁细胞一定具有细胞周期，但不一定具有全能性
解析：植物细胞融合前需要用纤维素酶和果胶酶处理去除细胞壁，动物细胞融合前不需要，A项错误；在单克隆抗体的制备过程中，甲、乙细胞可以为骨髓瘤细胞和B淋巴细胞，B淋巴细胞是高度分化的细胞，B项错误；动物细胞融合的常用方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等，植物原生质体融合可采用电融合法、离心法、PEG融合法、高Ca2＋—高pH融合法等，两者融合的方法存在差异，C项错误；丁细胞可能是杂交瘤细胞或植物杂种细胞，都能进行有丝分裂，都具有细胞周期，但杂交瘤细胞(保持无限繁殖能力)没有全能性，D项正确。
答案：D第17讲　基因工程
答案：?DNA连接酶　?基因表达载体的构建　?设计蛋白质结构　?脱氧核苷酸序列　?基因　?自然界没有　?酒精　?蓝色
1. (选择性必修3 P76“从社会中来”)科学家利用苏云金杆菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。检测Bt基因是否插入到棉花的DNA上。请简要写出该方法的实验过程，并对结果进行分析。
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提示：将转基因的棉花的基因组DNA提取出来，将含Bt基因的DNA片段进行PCR技术扩增，并将扩增出的基因片段进行电泳鉴定。若仅出现一条带，表明目的基因已插入到受体细胞的DNA中。
2．(选择性必修3 P80“文字信息”)构建基因表达载体时，为避免DNA片段和载体自身环化及基因表达载体等的任意拼接，应采取何种措施？
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提示：采用不同的限制酶切割，产生不同的黏性末端。
3.(选择性必修3 P90“资料卡”)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。利用大肠杆菌可构建干扰素工程菌，该工程菌不能生产有活性的干扰素，请解释其原因。
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提示：大肠杆菌为原核生物，无内质网和高尔基体，不具备加工干扰素的能力。
4．(选择性必修3 P102“相关信息”) 转基因植物所携带的目的基因可能传递给非转基因植物，造成基因污染。如果将目的基因导入叶绿体DNA中，就可以有效避免基因污染，原因是什么？
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提示：叶绿体基因不会通过花粉传给下一代。
5.(选择性必修3 P54“文字信息”)治疗性克隆获得的组织器官在移植时一般不会出现排异反应，其根本原因是什么？
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提示：治疗性克隆获得的组织和器官的绝大多数遗传物质和患者相同。
1. 有时为了满足应用需要，会在运载体中人工构建诱导型启动子，其目的是什么？
答案：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
2．做粗提取DNA的实验时，常选用鸡血细胞、猪肝细胞以及新鲜的洋葱、菜花作为实验材料，而不选用猪血细胞，原因是什么？
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答案：鸡血、猪肝以及洋葱、菜花的细胞中含有细胞核，而且以上材料容易获得，而哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器。
考点一　基因工程
　(2022·广东卷)“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对________________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是________________________，终止子的作用是____________________________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________，
具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
解析：(1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，耐高温的DNA酶才能从引物的3′端延伸子链。(2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。 (3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
答案：(1)引物
(2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞　终止转录，使转录在需要的地方停下来
(3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长
(4)废物的资源化　不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
1．图解基因工程的三种工具
2．图解基因工程的操作步骤
3．图解PCR相关知识
4．PCR扩增图解
5．图解蛋白质工程
特别提醒
基因工程操作的四个易错点
(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染植物细胞，并将其Ti质粒上的TDNA转移并整合到受体细胞的染色体DNA上。
(4)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子；启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
题点一：围绕基因工程的操作工具，考查理解能力
1．(2023·浙江统考一模)用DNA重组技术可以赋予生物新的遗传特性，再利用细胞工程与胚胎工程创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具和物质。下列叙述正确的是(　　)
A．进行基因工程时所用到的工具酶有：限制性内切核酸酶、DNA连接酶和运载体。
B．制取单克隆抗体时，要得到分泌特定抗体的杂交瘤细胞需使用选择培养基进行筛选。
C．卵裂结束后，囊胚细胞进入下一阶段分化，经过了一系列复杂变化。
D．若要使植物获得抗虫性状，可从苏云金杆菌体内提取出凝集素基因转入植物体中。
解析：进行基因工程时所用到的工具酶有：限制性内切核酸酶、DNA连接酶，运载体不是工具酶，A项错误；单克隆抗体制备过程中进行了两次筛选，一次筛选是使用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；另一次筛选是进行抗体阳性检测以筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，B项错误；高等哺乳动物胚胎发育经历的时期是受精卵→卵裂期→桑葚胚期→囊胚期→原肠胚期→幼体，囊胚期通过一系列的分裂分化进入原肠胚，原肠胚期进行了各种组织器官的分化，C项正确；若要使植物获得抗虫性状，可从苏云金杆菌体内提取出凝集素基因构建基因表达载体，将基因表达载体转入植物体中，D项错误。
答案：C
题点二：通过基因工程的操作过程，考查综合应用能力
2．(2023·广东模考)噬菌体辅助连续进化技术(PACE)将生物分子的实验室进化与噬菌体M13的生命周期结合在一起(该噬菌体的生命周期仅为10分钟)，使实验室中生物分子的进化速度提高了100倍。该技术有望让制药业使用实验室培育出来的蛋白质、核酸等成分按需制药。
噬菌体M13的增殖依赖于pⅢ蛋白。PACE技术，首先用某目的基因替换原来的pⅢ蛋白基因，构建含有目的基因的pⅢ蛋白缺陷型噬菌体(SP)，然后用SP侵染培养池中的宿主E.coli(其质粒中含有与目的基因活性相关联的pⅢ蛋白基因)。SP必须进化出有效突变才能启动质粒上pⅢ蛋白基因的表达，噬菌体才能获得增殖能力并持续侵染其他宿主，从而实现连续进化(过程如图所示)。
请回答以下问题：
(1)获取目的基因后，常用______________技术对其进行快速扩增。构建pⅢ蛋白缺陷型噬菌体(SP)的遗传改造过程需要用到的工具酶有______________，SP侵染宿主E.coli的过程相当于基因工程基本操作程序中的________________________。
(2)宿主E.coli的辅助质粒(AP)包含有与目的基因活性相关联的pⅢ蛋白基因，是为了对噬菌体(SP)进行____________________。除此之外，AP还应包含有________________才能驱动目的基因转录出mRNA。
(3)研究人员向PACE的培养池不断引流入新鲜的宿主细胞，并设置培养液流出速度稍快于宿主细胞的增殖速度，其目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)PCR的原理是DNA的半保留复制，故目的基因快速扩增方法为PCR(或聚合酶链式反应)技术。基因表达载体的构建过程中需要用到的工具酶有限制性内切核酸酶、DNA连接酶，SP侵染宿主E.coli的过程相当于基因工程基本操作程序中的将目的基因导入受体细胞。(2)AP包含有与目的基因活性相关联的pⅢ蛋白基因，是为了对噬菌体(SP)进行筛选(筛选有效突变的噬菌体)，启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，能启动转录，AP要包含有启动子才能驱动目的基因进行转录。(3)噬菌体是病毒，必须寄生于活细胞才能生存，设置培养液流出速度稍快于宿主细胞的增殖速度，是为了使获得有效突变的噬菌体在培养池中富集并进行连续进化。
答案：(1)PCR(或聚合酶链式反应)　限制酶、DNA连接酶　将目的基因导入受体细胞
(2)筛选(筛选有效突变的噬菌体)　启动子
(3)使获得有效突变的噬菌体在培养池中富集并进行连续进化(或使获得有效突变的噬菌体可以持续侵染新宿主细胞，或使获得无效突变的噬菌体随培养液流失)。

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