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选择性必修三
生物技术与工程
第十单元　生物技术与工程
第5讲　基因工程
考点一
考点三
考点二
课标要求 核心素养
1．概述基因工程的诞生。 2．阐明基因工程的原理及技术(含PCR技术)。 3．举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的应用。 4．概述蛋白质工程的原理及应用。 5．活动：DNA片段的扩增及电泳鉴定。 1.生命观念：举例说出基因工程的基本工具和基本操作程序。
2．科学思维：尝试建立基因工程的操作流程模型。
3．社会责任：基因工程和蛋白质工程的应用。
考点一　重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
(1)手段：按照_______________，通过_________等技术，赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的__________和__________。
(3)水平：_______________水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作_______________技术。
人们的愿望
转基因
生物类型
生物产品
DNA分子
重组DNA
2．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
(2)DNA连接酶
(3)载体
易错整合，判断正误。
(1)基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。( 　　)
(2)基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶、载体等。( 　　)
(3)限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开。( 　　)
√
×
×
(4)质粒上标记基因的存在便于重组DNA分子的筛选。( 　　)
(5)基因工程中实际用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。( 　　)
√
√
1．限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示：原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
2．DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
提示：不是。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
3．天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程载体？为什么？
提示：不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
1．基因工程的理论基础
2．图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
特别提醒：(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。
(3)限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端，而在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。
3．与DNA有关的几种酶的比较
作用对象 作用部位 作用结果
限制酶 DNA 分子 磷酸 二酯键 将DNA切成两个或多个片段
DNA连 接酶 DNA分 子片段 磷酸 二酯键 将两个或多个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚 合酶 脱氧核 苷酸 磷酸 二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA链上
解旋酶 DNA 分子 碱基对中 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链
DNA酶 DNA 分子 磷酸 二酯键 将DNA片段水解为脱氧核苷酸
特别提醒：(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。
(3)限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端，而在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。
考向?　限制酶和DNA连接酶
(2022·天津六校联考)如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。如图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是( 　　)
例 1
B
A．BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键
B．Sau3AⅠ和BamHⅠ切割的序列产生的片段能够相连，连接后的片段还能被Sau3AⅠ切割
C．DNA连接酶能连接②⑤，不能连接②④
D．E·coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接①③，且连接效率低
解析：BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamHⅠ切割 ，Sau3AⅠ切割 ，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后能被Sau3AⅠ切割，但是不一定能被BamHⅠ切割，B正确；②、⑤的粘性末端相同，②、④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②、⑤，也能连接②、④，C错误；E.coliDNA连接酶是从大肠杆菌中获得的DNA连接酶，只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，而图中①、③属于平末端，只能用T4 DNA连接酶连接，D错误。
〔变式训练〕
1．限制性内切核酸酶HindⅢ和XhoⅠ的识别序列及切割位点分别为A↓AGCTT和C↓TCGAG，下列相关叙述正确的是( 　　)
A．两种限制酶是在同一种生物中分离出来
B．两种限制酶切割DNA形成的黏性末端的碱基序列都是AGCT
C．用HindⅢ酶切割含目的基因的DNA片段和用XhoⅠ酶切割质粒后，目的基因和质粒能连接成重组质粒
D．实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果
D
解析：HindⅢ和XhoⅠ是从不同的微生物中分离得到的，A错误；两种限制酶识别和切割的序列分别为A↓AGCTT和C↓TCGAG，则两者切割后形成的黏性末端分别是—TCGA、—AGCT，B错误；两种限制酶切割形成的黏性末端不同，无法形成重组质粒，C错误；实验中可通过控制反应时间、酶浓度等控制切割效果，D正确。
考向?　基因工程载体的应用
如图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列相关叙述错误的是( 　　)
例 2
C
A．需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ来切割质粒
B．表达载体中的青霉素抗性基因在受体细胞中能复制
C．任何基因表达载体中都必须要有青霉素抗性基因作为标记基因
D．表达载体中目的基因的上游有启动子和复制原点
解析：限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因上，因此表达载体构建时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，A正确；表达载体中的青霉素抗性基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代，B正确；基因表达载体中标记基因的种类很多，不一定都是青霉素抗性基因，C错误；表达载体中目的基因的上游有启动子，是mRNA聚合酶识别和结合的位点，同时在目的基因的上游还有复制原点用于目的基因的复制，D正确。
〔变式训练〕
2．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( 　　)
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
D
解析：在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。
考点二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞______或获得预期____________等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知_____________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用_______________和序列比对工具进行筛选。
性状
表达产物
结构和功能清晰
序列数据库
(3)目的基因的获取
①人工合成____________。
②常用_________特异性地快速扩增目的基因。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因________________________________________
____，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
目的基因
PCR
在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一
代
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
3．将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法、_________________ 显微注射法 ______处理法
受体细胞 _________________ _________ 原核细胞
转化 过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
花粉管通道法
Ca2＋
体细胞或受精卵
受精卵
辨析
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持_______________的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是____________。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的_______________上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的__________________上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入_________，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入____________。
稳定和表达
基因重组
染色体DNA
T－DNA
农杆菌
受体细胞
(3)农杆菌特点
①能在自然条件下侵染_______________和____________，而对大多数_______________没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有____________，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
Ti质粒
4．目的基因的检测与鉴定
易错整合，判断正误。
(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。( 　　)
(2)构建基因表达载体是转基因工程的核心工作。( 　　)
(3)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部分，有了它才能驱动DNA的复制过程。( 　　)
(4)转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。( 　　)
√
√
√
×
1．PCR可以扩增mRNA吗？
提示：不可以，因为PCR是用DNA双链作模板的，不能直接用单链RNA作PCR的模板，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。
2．为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？
提示：标记基因用于鉴定目的基因是否成功导入受体细胞，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若标记基因中有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进行筛选。
3．新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检测原理是什么？
提示：通过提取病人样本中的RNA，进行反转录聚合酶链式反应(RT－PCR)，通过扩增反应将样本中微量的病毒信息进行放大，最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性，那么就可以认为样本中存在病毒(已经感染)，反之表明样本中没有病毒(未感染)。
1．PCR技术和DNA复制的比较
归纳总结：(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
(2)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
2.如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的大肠杆菌有三种：含环状目的基因的大肠杆菌、含重组质粒的大肠杆菌、含质粒的大肠杆菌。
(3)筛选方法：将大肠杆菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的大肠杆菌和含质粒的大肠杆菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
3．启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基 因上游 目的基 因下游 mRNA 首端 mRNA
尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸)
考向?　目的基因的获取
(2022·山东六校学情联考)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙
述错误的是( 　　)
例 3
A
A．在PCR体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、解旋酶、耐高温的DNA聚合酶等
B．第3轮PCR中，引物1能与图中的②结合并且形成突变基因
C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入基因表达载体
D．在第3轮PCR结束后，含突变碱基对的DNA占1/4
解析：在PCR体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等，但不需要加入解旋酶，A错误；②是引物2以引物1扩增得到的DNA链为模板进行复制得到的，故在第3轮PCR中，引物1能与图中的②结合并且形成含两条链的突变基因，B正确；引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向定点插入基因表达载体，避免发生自身环化，C正确；在第3轮PCR结束后，含突变碱基对的DNA有2个，总DNA分子共8个，所以其比例为1/4，D正确。
〔变式训练〕
3．图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
(1)EcoR V酶切位点为 ，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为_____________________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在_______________酶作用下，形成重组质粒P3。
平
胸腺嘧啶(T)
DNA连接
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是___(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是____________________、_________________________。
B
A类菌落含有P0
C类菌落未转入质粒
　　　　　 菌落类型 平板类型　　　　　　 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是_________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是________________________。
乙、丙
目的基因反向连接
解析：(1)从图中可以看出，EcoR Ⅴ酶切出来的载体质粒为平末端。(2)从图中可以看出，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。(3)由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活，说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活，说明C类菌落没有导入质粒。(4)据图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，若选用另一对甲、乙作引物，会出现目的基因反接扩增出的DNA片段为400 bp，则正好是目的基因反向连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。
考向?　基因工程的操作程序
(2022·山东高三联考)戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是( 　　)
例4
D
A．过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B．重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒
C．过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
D．过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
解析：戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程①是以病毒RNA为模板合成DNA，获取目的基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核苷酸，A项错误；启动子是一段有特殊结构的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的识别结合以驱动目的基因的转录，启动子具有物种或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2蛋白的载体时，需要选择大肠杆菌细胞的启动子，而不能选择其他物种和组织细胞的启动子，B项错误；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C项错误。
〔变式训练〕
4．(2022·山东德州质检)研究人员将GNA基因和ACA基因连接成融合基因，再与pBⅠ121质粒载体结合，导入玉米细胞，最终获得了抗蚜虫玉米新品种，部分操作如图，下列相关叙述错误的是( 　　)
注：图中KpnⅠ、BsaBⅠ、XhoⅠ为限制酶
D
A．①②过程均需使用DNA连接酶，②过程是基因工程的核心步骤
B．与只用KpnⅠ相比，用KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确
C．检测出玉米细胞中含有融合基因，也不能说明抗蚜虫玉米培育成功
D．在加入卡那霉素的培养基上存活下来的细胞，一定是成功导入重组载体的细胞
解析：导入含有卡那霉素抗性基因的非重组载体的玉米细胞也能在加入卡那霉素的培养基上存活下来，D错误。
考点三　基因工程的应用和蛋白质工程
1．基因工程在农牧业方面的应用
2．基因工程在医药卫生领域的应用
3．基因工程在食品工业方面的应用
4．蛋白质工程
概念 基础 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
手段 改造或合成基因
目的 根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造或制造新的蛋白质
流程 预期蛋白质功能→设计预期的_______________→推测应有的_____________→找到并改变相对应的______________________
或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
蛋白质结构
氨基酸序列
脱氧核苷酸序列(基因)
应用 ①临床上：研发出速效__________________产品
②医药工业方面：改变干扰素分子上的一个半胱氨酸，以延长干扰素的保存时间等
③其他工业方面：改进___的性能或开发新的工业用酶
④农业方面：改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用效率，增加粮食产量等
胰岛素类似物
酶
易错整合，判断正误。
(1)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛应用。( 　　)
(2)基因工程中可以将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，得到乳腺生物反应器。( 　　)
(3)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。( 　　)
(4)蛋白质工程在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变其分子的结构。( 　　)
√
√
√
×
1．蛋白质工程为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造？
提示：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造。②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。
2．基因工程能否完全满足人们生产和生活的需要，为什么？
提示：不能，因为基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些蛋白质不能完全满足人类的需要。
1．乳腺生物反应器与工程菌的比较
比较内容 乳腺生物反应器 工程菌
含义 让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的微生物
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物受精卵 微生物细胞
目的基因 导入方式 显微注射法 Ca2＋处理法
生产条件 不需要严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大 需要严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取
2.蛋白质工程与基因工程的异同
项目 蛋白质工程 基因工程
过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
项目 蛋白质工程 基因工程
实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 可生产自然界中不存在的蛋白质 只能生产自然界中已存在的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 考向?　基因工程的应用
某些膀胱上皮细胞可以产生一种称为尿血小板溶素的膜蛋白。科学家将人的生长激素基因插入小鼠基因组内制成膀胱生物反应器，使小鼠膀胱可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。下列说法正确的是( 　　)
A．利用膀胱生物反应器生产人的生长激素属于蛋白质工程的应用
B．需要将尿血小板溶素基因与生长激素基因的启动子重组在一起
C．转基因小鼠中，人的生长激素基因只存在于膀胱上皮细胞中
D．只在小鼠细胞中检测到人的生长激素基因，不能说明该技术已获得成功
例 5
D
解析：利用膀胱生物反应器生产人的生长激素，属于基因工程的应用，A错误；在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的膀胱上皮细胞中特异表达，故应将生长激素基因(目的基因)与膀胱中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，B错误；成功导入的人生长激素基因存在于小鼠的所有细胞中，但只在膀胱组织细胞中才表达，C错误；只在小鼠细胞中检测到人的生长激素基因，不能说明该技术已获得成功，若证明该技术成功，则需要检测到成功表达的人生长激素，可通过抗原－抗体杂交技术进行检测，D正确。
〔变式训练〕
5．免疫缺陷症患者因缺失ada基因而患该病，实验人员利用基因疗法将人正常的ada基因转入该病患者的T细胞中，可改善患者的免疫功能，具体过程如图所示。下列说法正确的是( 　　)
A．ada基因是从人体细胞中直接分离出来的
B．各种遗传病都可以通过基因治疗治愈
C．基因治疗的实质是对有缺陷的细胞进行基因修复
D．病毒的作用是作为携带ada基因的载体
D
考向?　蛋白质工程及其应用
胰岛素可用于治疗糖尿病，但胰岛素注射后易在皮下堆积，需较长时间才能进入血液，进入血液后又易被分解，因此治疗效果受到影响。下图是新的速效胰岛素的生产过程，有关叙述错误的是( 　　)
例 6
B
A．新的胰岛素的预期功能是构建新胰岛素模型的主要依据
B．新的胰岛素生产过程中不涉及中心法则
C．若用大肠杆菌生产新的胰岛素，常用Ca2＋处理大肠杆菌
D．新的胰岛素功能的发挥必须依赖于蛋白质正确的高级结构
解析：新的胰岛素的预期功能是构建新胰岛素模型的主要依据，A项正确；新的胰岛素生产过程中，涉及转录、翻译等过程，B项错误；Ca2＋处理大肠杆菌，可将目的基因导入大肠杆菌生产新的胰岛素，C项正确；根据结构与功能相适应的原理分析，新的胰岛素功能的发挥必须依赖于蛋白质正确的高级结构，D项正确。
〔变式训练〕
6．已知生物体内有一种转运蛋白Y，由300个氨基酸组成。如果将Y中157位的L异亮氨酸变成亮氨酸，261位的酪氨酸变成丝氨酸，改变后的蛋白质Y1不但保留了原有Y的功能，且具备了催化活性。下列说法正确的是( 　　)
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．可以通过对Y蛋白基因进行修饰或人工合成获得Y1蛋白基因
C．蛋白质工程操作过程中，不需要酶和载体作为工具
D．细胞内合成Y1蛋白与Y蛋白的过程中，遗传信息的流向是相反的
B
解析：蛋白质工程和基因工程的根本区别是蛋白质工程可产生自然界中没有的蛋白质，A错误；据分析和题干信息可知，可以通过对Y蛋白基因进行修饰或人工合成获得Y1蛋白基因，B正确；蛋白质工程操作过程中，需要酶和载体作为工具，C错误；细胞内合成Y1蛋白与Y蛋白的过程中，遗传信息的流向是相同的，D错误。
1．(2021·辽宁卷)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( 　　)
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
D
解析：酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。
2．(2021·辽宁卷)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1 kb＝1 000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经_________过程得到cDNA，将其作为PCR的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
逆转录
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入_________和_________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用________________________(填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。
EcoRⅠ
PstⅡ
T4DNA连接酶
相关限制酶的识别序列及切割位点
注：箭头表示切割位点
名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点
HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRⅠ G↓AATTC
CTTAA↑G
PstⅡ CAG↓CTG GTC↑GAC PstⅠ CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnⅠ G↓GTACC CCATG↑G BamHⅠ G↓GATCC
CCTAG↑G
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于_________的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，___号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
感受态
3
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中
解析：(1)利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。(2)根据启动子和终止子的作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间，从图中看出，两者之间存在三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRⅠ和PstⅡ两种不同限制酶；根据PstⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4 DNA连接酶连接质粒和目的基因。(3)转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。(4)由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcoRⅠ和PstⅡ两种酶切割重组质粒，电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0.9 kb，所以对应电泳图中的菌落3。
3．(2021·山东卷)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是_________，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是_________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要___种酶。
SalⅠ
EcoRⅠ
6
(2)将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是__________________________________________________。
F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于___________
__________________________________________，理由是____________
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
引物F4与F5
在调控序列上所对应序列之间的区段上
情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
根据有无荧光
解析：(1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子P的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhoⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhoⅠ所识别，故应该选用添加限
制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoRⅠ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ切割，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq
酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶。(2)受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1～F4与
R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白与结合位点在引物F4与引物R之间的序列上；含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
4．(2022·湖南卷)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是_______________________，物质b是____________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_____________________。
氨基酸序列多肽链
mRNA
密码子的简并性
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有____________________________________、__________________
________________________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是_____________________。
从基因文库中获取目的基因
通过DNA合成仪用
化学方法直接人工合成
DNA双链复制
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是____________________________________________
______________________________________________。
种类
提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不
同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路：____________
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试
管中血液凝固时间
取3支试管，
解析：(1)据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝
血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同
程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
5．(2022·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_____________________________
______________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的_______(填“3′端”或“5′端”)。
两种引物分别与两条模板链3′
端的碱基序列互补配对
5′端
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是___________
__________________________________________________________________________________________________________________________。
在转录出的
mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是__________________________________________________
___________________________________。
在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上
FLAG的碱基数目为3的倍数
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是___________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是________________________________________________________。
促进UBC与FLAG－P的结合
P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是________________
________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明
药物A促进UBC
与FLAG－P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗
的目的
P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变。可通过在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。(3)①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG－P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG －P，杂交
带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG－P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG－P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG－P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。(4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与蛋白P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。

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