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(共37张PPT)
本节看点
1. 真原核生物基因结构的差异
2. DNA聚合酶与DNA连接酶的区别与联系
3. 理解同尾酶定义及应用
01.原理与工具
02.基因工程的过程
原核生物的基因
基因 非基因
基因通常是具有遗传效应的DNA片段
翻译
转录
mRNA
基因2
基因3
基因4
基因1
非编码区
编码区
放大
基因3
原核生物DNA
收 裁剪&拼接 翻译
收
mRNA
真核生物DNA
基因1 基因2 基因3
基因4
基因 非基因
收
收
转录
hnRNA
放大
编码区
非编码区
基因3
内含子1 外显子1 内含子2 外显子2 内含子3 外显子3 内含子4
内含子 外显子
基因3编码区
放大
真核生物的核基因
非编码区的结构
启动子： 编码区上游能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域
终止子： 位于编码区下游，转录过程中能够终止 RNA聚合酶转录的DNA序列，使RNA合成终止
调控序列：对基因表达起调控作用的序列的统称
编码区
非编码区
调节基因
操纵基因
终止子
启动子
DNA基本结构
3'末端
T
T
C
G
A
A
5'末端
A
A
G
C
T
T
4 1
5
3 2
5'末端
3'末端
5'末端
3'末端
G
C
A
T
A
T
限制性核酸内切酶——黏性末端
5' … A 3' A5'
3' … T T C G A 5'
黏性末端
A A G C T T
T T C G A A
3'
A G C T T
A
… 3'
… 5'
… 3'
… 5'
5' …
3' …
Hind III
5'末端 A A G C T T 3'末端
T
T
C
G
A
A
3'末端
5'末端
限制性核酸内切酶——平末端
5'末端 G A T A T C 3'末端
C
T
A
T
A
G
5' … 3' … G A T A T C C T A T A G EcoR V
… 3'
… 5'
3' 5' 平末端 5' 3'
… 3'
… 5'
A T C
T A G
G A T
C T A
5' …
3' …
3'末端
5'末端
限制性核酸内切酶
限制（性核酸内切）酶
作用实质
断开(水解)磷酸二酯键
作用于
双链
作用结果
形成黏性末端或平末端
获取目的基因
特点
识别特定序列
（回文序列）
来源
原核生物（主要）
举例
EcoR I 、Alu l
Sam I 、BamH I 等
DNA连接酶
5' … G A T A T C … 3'
3' … C T A T A G … 5'
T4 DNA连接酶
5' … A A G C T T … 3'
3' … T T C G A A … 5'
T4 DNA连接酶
E.coli DNA连接酶
… … 3' 5' 平末端 5' 3'
… 3'
… 5'
3'
A G C T T
3' A
… A
… T T C G A
A T C
T A G
G A T
C T A
A5'
5'
黏性末端
… 3'
… 5'
A
DNA连接酶
DNA连接酶
作用实质
形成磷酸二酯键
作用于
双链
作用结果
连接已有DNA片段
形成重组DNA
举例
T4 DNA连接酶
（黏性末端&平末端）
E.coliDNA连接酶
（黏性末端）
注意： DNA聚合酶与DNA连接酶并非同一种酶 DNA聚合酶功能为连接游离的脱氧核糖 核苷酸(即形成单链)，形成磷酸二酯键
同尾酶
识别切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性核酸内切酶称为同尾酶
… … G C C T A G … …
A
T C T A G
G A T C C G … … G A T C T A
…
…
BamH I
…
…
A G A T C T
T C T A G A
G G A T C C
C C T A G G
… … G A T C C T A
…
…
… …
… …
G A T C …
T A A …
…
… C T A
Sau3A I
Bgl II
…
…
同尾酶与二次酶切
识别切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性核酸内切酶称为同尾酶
同尾酶切出的序列，由于黏性末端一致，可以连接到一起但重新连接的DNA分子能否被相同的限制酶二次酶切，需要依识别序列讨论
BamH I … … G A T C C G
…
…
… … G G A T C C C C T A G G … …
G C C T A G
Bgl II … … G A T C T A
…
…
… … … …
A G A T C T T C T A G A
A T C T A G
C
G
连接 …
…
G
C
G
C
A
T
T
A
T
A
…
…
4. 在受体细胞中 自主复制 或 随受体细胞复制
多以质粒形式存在 多为重组至宿主细胞染色体上
基因工程的载体工具
常见载体： 质粒 （小型环状DNA分子）、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒
注意：
质粒并非只存在于原核细胞中，许多真核细胞(如酵母菌等)中也存在质粒
1. 适宜的多种限制酶切点(好切)
2. 具有 标记基因 供重组DNA筛选
常为抗性基因
3. 具有 启动子、终止子 等调控区
以受体细胞中可表达为准
良好载体的基本要求
复制原点
5. 对受体细胞无害
质粒
本节看点
1. 基因组文库与cDNA文库的区别
2. 单酶切的弊端与双酶切的优势
3. 表达载体导入受体细胞的不同方式
4. 目的基因检测的方式及应用
01.原理与工具
02.基因工程的过程
基因工程的步骤
复制原点 启动子、终止子 目的基因 标记基因
目的基因的获取
表达载体的构建
DNA分子杂交 分子杂交 抗原-抗体杂交 性状检测 表达载体导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
动物：显微注射法
微生物： Ca2+处理，感受态细胞
基因文库法 人工合成法 基因组文库
cDNA文库
反转录法 化学合成法
植物
农杆菌转化法 基因枪法
花粉管通道法
PCR技术（获取/扩增）
基因组文库
基因组DNA用限制性核酸内切酶酶切
基因组文库内含完整编码区(外显子 + 内含子)
所以基因组文库不适宜直接导入原核生物细胞内表达
导入噬菌体
进行克隆
导入细菌
进行克隆
随机大量酶切为多个片段
随机大量酶切为多个片段
cDNA文库
操作 文库大小 基因多寡 启动子终止子 内含子
物种间交流
基因文库 酶切 多 有 有
大都不可以
cDNA文库 逆转录 少
大都可以
与基因组文库的制作方式不同， cDNA文库提取mRNA作为模板，通过逆转录形成cDNA并保存
注意：cDNA文库DNA分子没有启动子、终止子及内含子序列，更加适合种间基因交流
分别导入 受体细胞
提取mRNA
逆转录
+质粒
增殖
mRNA
cDNA
人工合成
人工合成
反转 录 法 目的基因的 mRNA 杂交双链 (单链RNA/单链DNA) 单链DNA 双链DNA (目的基因) 反转录法的具体操作 已知蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列 推测 目的基因的核苷酸序列 DNA合成仪 化学合成 目的基因 化学合成法的过程
化学合成法
表达载体的构建
表达载体
终止子
复制原点
标记基因
目的基因
启动子
质粒
同一种限制酶
DNA连接酶
单酶切及其弊端
质粒自身环化
×
目的基因反接
×
若只用同一种限制酶处理
DNA连接酶处理
目的基因正接
双酶切及其优势
DNA连接酶处理
目的基因正确连接
若用两种不同的限制酶
同时处理目的基因及质粒 分别创造不同的两侧末端
双酶切： 防止目的基因的反向连接及质粒自身环化现象产生
目的基因(表达载体)导入受体细胞(植物)
注意：
双子叶和裸子植物受到伤害会产生酚类化合物，吸引农杆菌 农杆菌转化法是受体细胞为植物细胞时最普适的转入方法
即使受体细胞为单子叶植物细胞，也可以通过添加酚类物质完 成转入及表达
受体细胞为双子叶植物： 农杆菌转化法
受体细胞为单子叶植物：基因枪法 此外还有花粉管通道法等方法
表现出新性状 的植株
含重组Ti质粒 的农杆菌
插入染色体的目的基因DNA
植物细胞
表达载体
再生植株
培养为
农杆菌
Ti质粒
T-DNA
构建
转入
导入
目的基因(表达载体)导入受体细胞(动物or微生物)
显微注射法
注意：
若想最终获得转基因动物，则表达载体必须直接 导入受精卵中
43℃; 2min
CaCl2处理
质粒与钙离子结合 吸附在细胞外
受体细胞为微生物细胞
受体细胞为动物细胞
CaCl2转化法
质粒进入细胞
感受态细胞
感受态细胞
正常细胞
目的基因的检测与鉴定
进没进去 是否转录 是否翻译
性状体现
待测物 DNA mRNA 蛋白质
个体性状
检测逻辑 目的基因 是否存在 DNA 分子杂交 DNA-DNA 分子杂交 是否出现 杂交带 目的基因 是否转录 分子杂交 DNA-DNA 分子杂交 是否出现 杂交带 目的基因 是否翻译 抗原-抗体杂交 是否出现 杂交带
个体是否
表现性状
抗虫、抗病
抗抗生素等
接种实验
是否存活
习题精练
苯丙酮尿症是PKU基因突变引起的，研究人员尝试用基因治疗的方式治疗该疾病，即将正常基因D导入到有突变基因的细胞中。下图中的图甲为A 、B 、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙表示重组 载体的示意图。其中Ap为氨苄青霉素抗性基因， Tc为四环素抗性基因， lacZ为蓝色显色基因(基因表达的产 物将无色化合物X-gal转化为一种蓝色物质，菌落呈蓝色)， EcoRI(0.7kb) 、PvuI(0.8kb)等为限制酶及其切割 位点与复制原点之间的距离。已知1kb=1000碱基对，请结合所学知识回答：
(1)将正常的D基因导入受体细胞的基因工程操作步骤中，其核心是 ,据图分析上述甲图中三种质粒中不宜作为运载体的有 ，请分析原因
习题精练
苯丙酮尿症是PKU基因突变引起的，研究人员尝试用基因治疗的方式治疗该疾病，即将正常基因D导入到有突变基因的细胞中。下图中的图甲为A 、B 、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙表示重组 载体的示意图。其中Ap为氨苄青霉素抗性基因， Tc为四环素抗性基因， lacZ为蓝色显色基因(基因表达的产 物将无色化合物X-gal转化为一种蓝色物质，菌落呈蓝色)， EcoRI(0.7kb) 、PvuI(0.8kb)等为限制酶及其切割 位点与复制原点之间的距离。已知1kb=1000碱基对，请结合所学知识回答：
(2)若要获取目的基因D ，上述乙图中应选择限制酶 对其所在的DNA进行切割，如果仅知道D基因首位的部分核苷酸序列，通常可根据该基因首位两端的已知核苷酸序列合成 ,利用 技术得到大量的目的基因
习题精练
苯丙酮尿症是PKU基因突变引起的，研究人员尝试用基因治疗的方式治疗该疾病，即将正常基因D导入到有突变基因的细胞中。下图中的图甲为A 、B 、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙表示重组 载体的示意图。其中Ap为氨苄青霉素抗性基因， Tc为四环素抗性基因， lacZ为蓝色显色基因(基因表达的产 物将无色化合物X-gal转化为一种蓝色物质，菌落呈蓝色)， EcoRI(0.7kb) 、PvuI(0.8kb)等为限制酶及其切割 位点与复制原点之间的距离。已知1kb=1000碱基对，请结合所学知识回答：
(3)将目的基因D和甲图中可做载体的质粒进行连接后，会得到图丙中三种连接方式。需要选出正向连接的重 组质粒，可使用 酶切割所获得的重组质粒。完全酶切后进行电泳分析。若是载体自连，电泳图谱 中出现2.7kb一条带，若是正向连接载体和反向连接载体，电泳图谱中出现长度分别为 和 .
习题精练
苯丙酮尿症是PKU基因突变引起的，研究人员尝试用基因治疗的方式治疗该疾病，即将正常基因D导入到有突变基因的细胞中。下图中的图甲为A 、B 、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙表示重组 载体的示意图。其中Ap为氨苄青霉素抗性基因， Tc为四环素抗性基因， lacZ为蓝色显色基因(基因表达的产 物将无色化合物X-gal转化为一种蓝色物质，菌落呈蓝色)， EcoRI(0.7kb) 、PvuI(0.8kb)等为限制酶及其切割 位点与复制原点之间的距离。已知1kb=1000碱基对，请结合所学知识回答：
(4)选择自身不含lacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，在已转化的含重组质粒、空质粒的受体 细胞中和未转化成功的细胞中如何筛选出成功导入重组质粒的受体细胞
性状检测——双标记问题
在真实的基因工程相关实验中，若表达载体上只有一个标记基因(如抗性基因)，则通过含抗生素培养基筛选
后所得菌落有两种可能，其一为含有完整表达载体，其二为只含有空质粒，内部并没有目的基因存在。因 此在实际操作中常使用双抗性标记，以平板影印法辅助鉴定
完成基因工程操作
进行目的基因检测
含四环素培养基
四环素抗性基因
目的基因
启动子
Tetr
复制原点
表达载体
终止子
性状检测——双标记问题
在真实的基因工程相关实验中，若表达载体上只有一个标记基因(如抗性基因)，则通过含抗生素培养基筛选后所得菌落有两种可能，其一为含有完整表达载体，其二为只含有空质粒，内部并没有目的基因存在。因此在实际操作中常使用双抗性标记，以平板影印法辅助鉴定
Pst I
酶切位点
1 4 7 2 5 8
3
6
9
1 4 5 8
3
6
9
Tetr
四环素抗性基因
Ampr
青霉素抗性基因
完成基因工程操作
进行目的基因检测
含四环素培养基
含青霉素培养基
沾取菌落
无菌绒布
习题精练
(1)获取目的基因的方法很多，上图是利用人生长激素mRNA 。而在构建基因表达载体时必须使用的酶是 和 。⑤过程要用CaCl2处理大肠杆菌，目的是 。
(2)如果限制性内切晦Pst l 、EcoR l和Hind lll对质粒pBR322进行切割， 用两种晦、三种晦分别切割时，则形 成的DNA片段共 种，其中含有完整四环素抗性基因的DNA片段的所占比例是 。
习题精练
(3)如果只用限制性内切酶Pst I切割目的基因和质粒pBR322，完成过程 ④、⑤后，将三角瓶内的大肠杆菌（不含Ampr 、Tetr抗性质粒）先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。能在乙培养基上生长的大肠杆菌是含有 抗性基因，含有目的基因的大肠杆菌应该在 （填“乙培养基”、“丙培养基”）
性状检测——“蓝白斑”(报告基因)问题
已知：
lacZt编码Z酶氨基端的一个片段(称为α-肽)
α-肽、缺失α-肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时 就会表现出Z酶活性
底物X-gal 正常大肠杆菌 表达 Z酶
水解为蓝色物质
所谓“报告基因”是指一类在细胞、组织/器官或个体处于特定情况下会表达并使得他们产生易于检测、且
实验材料原本不会产生的性状的基因
Sal I
酶切位点
lacZt 基因
报告基因
青霉素抗性基因
性状检测——“蓝白斑”(报告基因)问题
所谓“报告基因”是指一类在细胞、组织/器官或个体处于特定情况下会表达并使得他们产生易于检测、且
实验材料原本不会产生的性状的基因
实验材料
不正常 的大肠杆菌
编码α-肽的序列缺失 其他序列正常
(体内缺失lacZt)
Sal I
酶切位点
转入 表达
有活性Z酶
转入
无Z酶
未获得lacZt基因
由于目的基因破坏了lacZt
lacZt 基因
报告基因
青霉素抗性基因
获得lacZt基因
有目的基因
空质粒
习题精练
大肠杆菌β-半乳糖苷酶(Z酶)可催化底物(X-gal)水解产生蓝色物质。在pUC18质粒中， lacZt编码Z酶氨基端的一个片段(称为α-肽)，该质粒结构及限制酶识别为点如图甲所示。已知α-肽、缺失α-肽的Z酶片段单独存 在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性。利用图乙中的DNA片段与pUC18质粒进行基因工程操作
(1)限制酶能催化双链DNA分子中 (填化学名称)的断裂。本实验可使用限制酶 处理pUC18质粒和图乙中的DNA片段，再通过DNA连接酶连接，获得目的基因的重组质粒
(2)用重组质粒转化大肠杆菌，然后将大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的固体培养基上进行培养，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具有 。在该培养基上不能生长。从功能上划分，该培养基属于 培养基
(3)当上述培养基中含有X-gal时，生长出的菌落有蓝色和白色两种类型，其中含有重组物质的大肠杆菌的菌落颜色为 ，这是因为 。为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，本实验作为受体细胞的大肠杆菌中Z酶基因应满足的条件是 。
基因编辑（CRISPR/Cas9）
删除部分基因序列 增添部分基因序列
基因被破坏 基因增添部分碱基对
与基因部分序列 碱基互补配对

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