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(共29张PPT)
本节看点
1. 认知PCR技术的基本流程
2. 理解引物位置对最终扩增序列的影响
3. 理解各类型PCR的操作与意义
01.PCR技术
02.应用与拓展
PCR技术
PCR技术路线包括：
高温变性解旋
(92℃左右， 与GC占比有关)
低温退火复性
(55℃左右， 与GC占比有关)
新链延伸
(72℃左右)
PCR技术体系中含有：
模板DNA分子
dNTP/四种游离的脱氧核糖核苷酸
(提供原料及能量)
Taq DNA聚合酶(耐高温)
两种引物(创造复制起始端)
缓冲液(平衡pH)
PCR技术
PCR技术路线包括：
高温变性解旋
(92℃左右，与GC占比有关)
低温退火复性
(55℃左右，与GC占比有关)
新链延伸
(72℃左右)
PCR技术体系中含有：
模板DNA分子
四种游离的脱氧核糖核苷酸/dNTP
(提供原料及能量)
Taq DNA聚合酶(耐高温)
两种引物(创造复制起始端)
缓冲液(平衡pH)
Taq酶耐高温
细胞内DNA复制：
以DNA两条单链为模板( )
以游离的脱氧核糖核苷酸为原料（V）
在 解旋酶（X） 和 DNA聚合酶（X） 作用下
如何把已有的一个DNA分子中特定位置片段的数目变多
高温解旋
引物（可以自行设计V ）
从5‘向3‘延伸形成新单链
低温恢复
思考
PCR技术——第一轮
PCR技术路线包括：
高温变性解旋
(92℃左右，与GC占比有关)
低温退火复性
(55℃左右，与GC占比有关)
新链延伸
(72℃左右)
PCR技术体系中含有：
模板DNA分子
四种游离的脱氧核糖核苷酸/dNTP
(提供原料及能量)
Taq DNA聚合酶(耐高温)
两种引物(创造复制起始端)
缓冲液(平衡pH)
5'末端
3'末端
dNTP ∞ Taq DNA聚合酶
3'末端 5'末端
引物∞
反应体系
3'末端
5'末端
5'末端
3'末端
1.高温解旋
3' 5'
5' 3'
5'末端
3'末端
3'末端
5'末端
2.低温退火
3'末端 5'
Taq DNA聚合酶作用下
3'末端 5'末端
5'末端
3'末端
5'
3'末端
3.新链延伸
PCR技术——第二轮
PCR技术路线包括：
高温变性解旋
(92℃左右，与GC占比有关)
低温退火复性
(55℃左右，与GC占比有关)
新链延伸
(72℃左右)
PCR技术体系中含有：
模板DNA分子
四种游离的脱氧核糖核苷酸/dNTP
(提供原料及能量)
Taq DNA聚合酶(耐高温)
两种引物(创造复制起始端)
缓冲液(平衡pH)
1.高温解旋
2.低温退火
3.新链延伸
PCR技术——第三轮
PCR技术路线包括：
高温变性解旋
(92℃左右，与GC占比有关)
低温退火复性
(55℃左右，与GC占比有关)
新链延伸
(72℃左右)
PCR技术体系中含有：
模板DNA分子
四种游离的脱氧核糖核苷酸/dNTP
(提供原料及能量)
Taq DNA聚合酶(耐高温)
两种引物(创造复制起始端)
缓冲液(平衡pH)
1.高温解旋
2.低温退火
3.新链延伸
注意： PCR第三轮结束后，目的基因(双链)真正出现
习题精练
图1是科研工作者利用差异杂交法获取相关目的基因的研究；图2是克隆出的花色基因C， 和实验所用质粒表达载体简图（箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRI 、BamlI的酶切位点， ampR为青霉素抗性基因， tetR为 四环素抗性基因， P为启动子， T为终止子， ori为复制原点），拟将其与质粒重组，再借助农杆菌导入菊花中。请据图回答问题：
（1）图 1中， A过程需要用 酶， D过程需要筛选 （填“未杂交”或“杂交分子”）的含 32 P的cDNA单链，继而通过人工合成，获得双链cDNA， 并用其构建基因文库。
习题精练
（2）图2中菊花组织培养的培养基常用 方法灭菌。菊花的组织培养过程③需添加生长素和细胞分裂素，当其比值 （升高/降低/适中）促进生根。
（3）图3表示运用影印培养法（使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否导入了农杆菌。培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有 、 。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是 （填数字）菌落中的细菌。
习题精练
（4）为确定基因C是否整合到菊花染色体的DNA上，可用放射性同位素标记的 作为探针进行分子检测，还需要在个体水平上通过 鉴定。
（5）本实验中，对质粒进行酶切时，只能单一酶切，不能双酶切，原因是 。为鉴定筛 选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。下图所示为6条引物在正 确重组质粒中的相应位置， PCR鉴定时应选择的一对引物是 可以扩增出了450bp片段。若目 的基因反向连接了，那么选图中引物 ，可从某一菌落的质粒中扩增出了500bp片段。
RT-PCR
RT(reverse transcription)-PCR即反转录 ·聚合酶链反应，是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩
增 （PCR） 相结合的技术
RNA单链 DNA单链
RNA逆转录
SARS-CoV-2
RNA单链
逆转录酶
DNA单链 DNA单链
DNA聚合酶
DNA单链
cDNA扩增
实时(realtime)荧光定量PCR
反向引物
R
正向引物
Q
反向引物
正向引物
Q
R
步骤3·探针被切断
步骤4·聚合完成
反向引物
报告(荧光)基团
淬灭基团
Q
R
正向引物
Q
R
步骤1·聚合
反向引物
正向引物
Q
R
步骤2·链取代
习题精练
荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种 DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时
加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测 系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列有关叙述正确的是
A． 引物是单链 DNA或单链RNA， 引物1 、2的碱基序列相同
B. Taq酶催化DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸
C． 达到设定荧光强度所经过的循环次数与其起始模板量关系不大
D． 该项技术可用于检测某种细胞中不同基因的转录水平
习题精练
新冠病毒是一种单链RNA病毒，常用“荧光RT-PCR技术”进行检测，方法是取检测者的mRNA在试剂盒
中逆转录出cDNA， 并大量扩增，同时利用盒中荧光标记的新冠病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含 有新冠病毒的cDNA， 在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强
度也等比例增加，可通过荧光强度的变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图（如下
图）。请回答下列问题：
（1）题中“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中应该含有；检测者mRNA 、 、逆转录酶、
引物， dNTP 、缓冲体系。
（2）如果要同时扩增两种基因，则试剂盒中的引物应该有 种，引物的作用是
。
习题精练
新冠病毒是一种单链RNA病毒，常用“荧光RT-PCR技术”进行检测，方法是取检测者的mRNA在试剂盒
中逆转录出cDNA， 并大量扩增，同时利用盒中荧光标记的新冠病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含 有新冠病毒的cDNA， 在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，可通过荧光强度的变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图（如下图）。请回答下列问题：
（3）上图中“平台期”出现的最可能的原因是 。理论上，
在检测过程中，有荧光标记的“杂交双链”出现，则说明检测结果呈 （填“阴”或“阳”）
性，但为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。现有甲乙两个待检样本，检测时都出现了上述形态的曲线，但甲的a点比乙的a点明显左移，请给这种结果做出科学合理的解释（试剂盒 合格且正富，操作过程规范且准确）： 。
习题精练
新冠病毒是一种单链RNA病毒，常用“荧光RT-PCR技术”进行检测，方法是取检测者的mRNA在试剂盒
中逆转录出cDNA， 并大量扩增，同时利用盒中荧光标记的新冠病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含 有新冠病毒的cDNA， 在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，可通过荧光强度的变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图（如下图）。请回答下列问题：
（4）除核酸检测外，研究人员还研发了利用生产单克隆抗体的技术，生产出能与新冠病毒结合的特异性抗体。当杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养时，为防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害； 应采取的措施是 ，最后所得抗体的优点是：
五碳糖的种类、结构及功能
1. 一号碳可连接含氮碱基
2. 五号碳连有羟基，未来连接磷酸基团形成磷酸酯键
3. 核糖二、三号碳均连有羟基，脱氧核糖三号碳连有羟基，双脱氧核糖二、三号碳均不含羟基
双脱氧核糖
ddNTP
(结合PCR与sanger测序)
脱氧核糖
DNA及dNTP
核糖
RNA及ATP
桑格（sanger）测序（ddNTP的使用）
DNA模板单链 + 常规PCR体系
习题精练
(2012·福建)双脱氧核苷酸常用于DNA测序，其结构与脱氧核苷酸相似，能参与DNA的合成，且遵循碱基互
补配对原则。 DNA合成时，在DNA聚合酶作用下，若连接上的是双脱氧核苷酸，子链延伸终止；若连接上 的是脱氧核苷酸，子链延伸继续。在人工合成体系中，有适量的序列为GTACATACATG的单链模板、胸腺 嘧啶双脱氧核苷酸和4种脱氧核苷酸。则以该单链为模板合成出的不同长度的子链最多有
A． 2种 B． 3种 C． 4种 D． 5种
习题精练
(2020· 山东模考)双脱氧核苷三磷酸（ddNTP） 与脱氧核苷三磷酸（dNTP） 的结构如图所示。已知ddNTP
按碱基互补配对的方式加到正在复制的子链中后，子链的延伸立即终止。某同学要通过PCR技术获得被
32 P标记且以碱基“C”为末端的、不同长度的子链DNA片段。在反应管中已经有单链模板、引物、 DNA聚合 酶和相应的缓冲液等，还需要加入下列哪些原料？( )
① . dGTP， dATP， dTTP， dCTP
② . dGTP， dATP， dTTP
③ . “ 位32 P标记的ddCTP
④ . Y 位 32 P标记的ddCTP
A. ①③ B. ①④ C. ②③ D. ②④
本节看点
1. 理解基因工程的应用
2. 理解基因诊断与基因治疗的基本方式
3. 理解蛋白质工程的原理与操作
01.PCR技术
02.应用与拓展
植物基因工程的应用
类型 相关基因
成果
抗虫 Bt毒蛋白基因 蛋白酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因 植物凝集素基因等
抗虫棉
抗病 病毒外壳蛋白基因 病毒复制酶基因 几丁质酶基因 抗毒素合成基因等
抗烟草花叶病毒的转基因烟草
抗病毒小麦、甜椒、番茄等
抗逆 耐高温干旱 耐冷耐冻 耐盐等
抗冻烟草、番茄
抗除草剂的大豆玉米
改善品质 氨基酸改良基因 控制果实成熟基因 花青素代谢相关基因等
富含赖氨酸的转基因玉米
耐储存番茄
观赏新花色的矮牵牛等
动物基因工程的应用
改善方向 有关基因
成果
提高动物生长速度 生长激素基因
转基因绵羊、转基因鲤鱼
改善家畜产品品质 肠乳糖酶基因
降低乳糖的奶牛
转基因动物 生产药物 药用蛋白基因
乳腺生物反应器
膀胱反应器
转基因动物做器官移 植供体 抑制抗原决定簇因子表达 的调节基因
转基因克隆猪器官
乳腺生物反应器与基因工程菌
项目 乳腺生物反应器
基因工程菌
基因结构 动物基因结构和人基本相同
细菌等原核生物和人基因结构差异较大
基因表达 合成的药物蛋白和天然蛋白相同
细菌无内质网高尔基体
合成的药物蛋白可能无活性
受体细胞 动物受精卵
微生物细胞
转化方式 显微注射法
Ca2+ ，感受态细胞法
生产条件 无需严格灭菌 温度等条件影响不大
需严格灭菌，严格控制工程菌所需温度、pH、
营养物质浓度等外在条件
药物提取 从动物乳汁中提取
从微生物细胞提取
生产设备 畜牧业生产和提取设备
工业生产
乳腺生物反应器与基因工程菌
乳腺生物反应器与基因工程菌
基因诊断与基因治疗
项目 体外基因治疗
体内基因治疗
原理 病人体内获得某种细胞，如T淋巴细胞，在体外完成基因转移，筛选成功转移的细胞扩增培养，重新输入患者体内
直接向人体组织细胞转移基因
成果举例 用腺苷酸脱氨酶基因治疗复合型 免疫缺陷病
用正常基因治疗遗传性囊性纤维化病
过程 取患者淋巴细胞→细胞培养→将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞中→筛选→将导入成功的淋巴细胞转入患者体内
用经过修饰的腺病毒作为载体结合正常基因，构建基因表达载体→导入患者肺组织中
特点 操作复杂，成功率高
操作简单，成功率低
注意事项 基因治疗并非把健康的外源基因导入患者的所有细胞中 而只是导入某些功能异常的体细胞中 故致病基因依然可以通过生殖细胞遗传给后代
蛋白质工程(二代基因工程)
氨基酸序列
多肽链
基因
DNA
蛋白质
三维结构
翻译
转录
mRNA
生物功能
预期功能
基因修饰或合成
折叠
设计
分子
表达载体的构建
项目 基因工程
蛋白质工程
区 别 原理 基因重组
中心法则的逆转
过程 获取目的基因 → 表达载体构建 → 导入受体细 胞 → 目的基因的检测与鉴定
预期蛋白质的功能 → 设计预期的蛋白质的结构
→ 推测应有的氨基酸序列 → 找到对应的脱氧 核糖核苷酸序列 → 合成DNA → 表达出蛋白质
实质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需要 的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
定向改造或生产人类所需要的蛋白质
结果 生产自然界中已经有的蛋白质
生产自然界中本不存在的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，对现有的蛋白质的改造或制造新 的蛋白质必须通过基因修饰或基因合成来实现

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