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2024高考一轮复习
第30讲 微生物的培养技术及应用
微点练清【P271】
1．培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。 ( )
2．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。( )
3．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。 ( )
4．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。 ( )
5．对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。 ( )
6．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。 ( )
7．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使培养基的酸碱度降低。 ( )
8．统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计。 ( )
√
√
×
×
×
√
×
×
微生物概述
微生物的概念：
_____________________________的统称。
难以用肉眼观察的微小生物
细菌、真菌、病毒及一些原生生物
禽流感病毒
SARS病毒
大型真菌
实验室培养微生物条件
1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
——培养基的配制
2）确保其它微生物无法混入
——无菌技术
高压蒸汽灭菌
固体培养基
3）将需要的微生物分离出来
——微生物的纯培养
课P9 P272
一、微生物的基本培养技术　
1
培养基的配制
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
(1)概念：
(2)作用：
(3)类型：
固体培养基 液体培养基 半固体培养基
课P9 P272
培养微生物后
液体培养基：
固体培养基：
不同培养基的比较：
分离、计数、鉴定、
菌种保存等
有无凝固
剂如琼脂
微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长形成肉眼可见的菌落
用于扩大微生物种群数量
课P10 P272
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
天然培养基
合成培养基
固体培养基
液体培养基
半固体培养基
选择培养基
鉴别培养基
不同培养基的比较
P272
培养基中加氨苄青霉素
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
选择培养基
培养基+氨苄青霉素
培养基
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
(4)营养成分:
凡是能够为微生物提供C、N等元素的营养物质。
①基本成分：
水、碳源、氮源、无机盐。
碳源
无机碳源：
有机碳源：
氮源
NH4＋、NO3-、NH3等。
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。
CO2、CO32-、HCO3-。
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。
无机氮源：
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨：
均可提供碳元素、氮元素。
无机盐
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等
大量元素：
微量元素：
Ca、K 、Mg等
自养微生物
异养微生物
为什么培养基需要氮源？
是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
课P10 P273
②特殊需求：
满足微生物对 的需求。
pH、特殊营养物质、O2
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
举例说明：
培养乳酸菌需要添加维生素
培养霉菌时需将PH调至酸性，培养细菌时将PH调至中性或微碱性
培养厌氧微生物时需要提供无氧条件
课P10 P272
【随堂练习273】
1．(2022·沈阳模拟)大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌，利 用
其代谢产物能与染料伊红美蓝反应，使菌落呈黑色的特性，从而
将其鉴别出来。下表是其培养基配方，相关叙述错误的是(　 )
A. 培养基配方中X的成分可以是琼脂
B．该培养基中蛋白胨提供的主要营养有碳源、氮源和维生素
C．可采用干热灭菌法对该培养基灭菌
D．可利用培养基上菌落的特征来判断和鉴别大肠杆菌的存在
C
(1)目的：获得　　　　　　。
(2)关键：　　　　　　。
纯净的培养物
防止杂菌污染
2
无菌技术
课P10 P272
条件 结果 常用方法 应用范围
消毒
灭菌
　
(3)常用的灭菌、消毒方法比较
较为温和的物理或化学方法
强烈的理化因素
仅杀死物体表面或内部的部分微生物，不能消灭芽孢和孢子
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药剂消毒法
紫外线消毒法
灼烧灭菌法
干热灭菌法
湿热灭菌法
日常用品
不耐高温的液体
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台。
接种工具(涂布器、接种环)、试管口或瓶口
玻璃器皿、金属用具
培养基及容器
课P11 P273
芽孢
芽孢是某些细菌（如芽孢杆菌属）在营养条件缺乏时，在菌体内形成的一个圆形或椭圆形、含水量低、抗逆性强的休眠体。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞，它是有丝分裂或减数分裂的产物。
孢子
知识拓展
条件 结果 常用方法 应用范围
消毒
灭菌
　
(3)常用的灭菌、消毒方法比较
较为温和的物理或化学方法
强烈的理化因素
仅杀死物体表面或内部的部分微生物，不能消灭芽孢和孢子
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药剂消毒法
紫外线消毒法
灼烧灭菌法
干热灭菌法
湿热灭菌法
日常用品
不耐高温的液体
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台。
接种工具(涂布器、接种环)、试管口或瓶口
玻璃器皿、金属用具
培养基及容器
课P11 P272
3．下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是 (　 )
A．微生物培养基中并不都必须添加碳源或氮源
B．倒平板时，应将打开的培养皿皿盖放到一边，以免培养基
溅到皿盖上
C．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
D．实验结束后，带菌的培养基必须经灭菌处理后才能倒掉
B
【随堂练习274】
3
微生物的纯培养
(1)概念：由 繁殖所获得的微生物群体是纯培养物，获得
的过程就是纯培养。
微生物群
分散
单个细胞
单个菌落
繁殖
不同菌落的形状、大小、光泽度、颜色、透明度等不同。菌落是鉴定菌种的重要依据。
单一个体
纯培养物
菌落：分散的微生物(单一个体)在适宜的 表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的 。
固体培养基
子细胞群体
课P11 P272
（2）获得单菌落的方法： 法和 法。
平板划线
稀释涂布平板
接种
接种和计数
（3）纯培养的一般过程：
接种分离菌种
菌种纯培养
制备培养基
（4）实例——酵母菌的纯培养
①制备培养基
配制培养基
灭菌
倒平板
配制培养基
灭菌
a、配制培养基
马铃薯200g
切成小块
加水1000ml，煮沸至马铃薯软烂
过滤，加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
课P11 P272
b、灭菌
锥形瓶
包器材
培养基
高压蒸汽灭菌
酵母菌培养基
包上牛皮纸
转移
加棉塞
用皮筋勒紧
高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下
培养皿
干热灭菌
灭菌15-30min
课P11 P272
c、倒平板
待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
①拔出锥形瓶的棉塞
②将瓶口迅速通过火焰
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置
课P11 P272
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。 防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
3.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
1.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
思考讨论
课P12 P272
②接种和分离酵母菌
平板划线法
平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
分散或稀释
生长繁殖
课P12 P274
平板划线法的过程
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
课P12 P272
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
平板划线法
蘸取菌液
课P13 P272
1.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
2.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
思考与讨论
3.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
接种结束后：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
每次划线前：杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
取菌种前：杀死接种环上原有微生物
P274
③培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。
作对照，该培
养皿无菌落说
明培养基没有
污染
既可以防止培养
基表面的水分挥
发；又可以防止
皿盖上的水珠落
入培养基，造成
污染
课P12 P272
思考与讨论
1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。
2.你是如何记录实验结果的？
可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等
3.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点， 则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
4．在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图。下列有关叙述错误的是(　 )
A．甲中a区域为划线的起始位置B．接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌C．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落D．接种过程中至少需要对接种环灼烧5次
【小本400】
A
二、微生物的选择培养和计数　
1
选择培养基
实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
热泉中发现了耐热的Taq细菌，
并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。
实验室筛选微生物原理：
人为提供__________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时_____________________________
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
课P16 P275
选择培养基的概念
在微生物学中，将允许 生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基。
特定种类的微生物
抑制
阻止
以尿素为唯一氮源的培养基
（1）利用营养条件进行选择培养
分离固氮菌
分离自养型微生物
不加含碳有机物的无碳培养基
不加氮源的无氮培养基
（2）在培养基中加入某种化学物质。
分离得到酵母菌、霉菌等
加入青霉素的培养基
分离得到金黄色葡萄球菌
加入高浓度食盐的培养基
（3）改变微生物的培养条件。
厌氧型微生物，兼性厌氧型
无氧环境下培养
筛选出能分解尿素的细菌
课P16 P275
培养基中加氨苄青霉素
具有氨苄青霉素抗性的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基应有菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
实例:
2
微生物的选择培养
稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
两个基本操作：________和________
梯度稀释
涂布平板
课P17 P275
稀释涂布平板法的过程
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
微量 移液器
稀释10倍菌液
101
土壤10g
②在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
取6支试管，分别加入9ml无菌水。
（1）样品梯度的稀释
课P16 P275
灼
⑤将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，涂布器冷却后，进行涂布。
涂
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
滴
③取0.1ml菌液，滴加到培养基表面
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
浸
（2）取样涂布平板
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
课P17 P275
放入37℃恒温箱中培养1～2d
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
（3）培养与观察
课P17 P275
1．(2022·菏泽二模)精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌缺乏将鸟氨酸转化为精氨酸的酶，不能在缺少精氨酸的培养基上生长，但可作为鸟氨酸发酵的优良菌种。如图为野生型谷氨酸棒状杆菌经诱变获得精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌并进行筛选的过程示意图，过程②将紫外线照射处理的菌液接种在某培养基上。培养至菌落不再增加时，平板上的菌落如图甲所示。过程③向培养基中添加某种物质继续培养得到如图乙所示平板。下列叙述正确的是 (　 )
A．紫外线照射可导致谷氨酸棒状杆菌发生基因突变或染色体变异
B．图乙中菌落B为精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌
C．过程③向培养基中添加的某种物质是谷氨酸
D．过程②所用培养基是一种鉴别培养基
【随堂练习276】
B
3
微生物的数量测定
（1）显微镜直接计数法
计数原理 利用特定的细菌计数板或_____________，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
优点 是一种常用的、________的测定微生物数量的方法
缺点 统计的结果一般是死菌数和活菌数的总和
血细胞计数板
快速直观
课P18 P275
计数原理 当样品的_____________时，培养基表面生长的一个_______，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的_______，就能推测出样品中大约含有多少活菌
计数标准 为了保证结果准确，一般选择菌落数为_________的平板进行计数
计数方法 通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为_________、适于计数的平板。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出________
稀释度足够高
单菌落
菌落数
30～300
30～300
平均值
（2）稀释涂布平板法
课P18 P275
(3)土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课P18 P275
分解尿素细菌鉴定原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
呈碱性，遇酚红指示剂呈 色。
红
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
既是选择培养基又是鉴别培养基
课P18 P275
教材隐性知识（课本P20拓展应用2）分解纤维素的细菌鉴定：
纤维素能与刚果红形成红色复合物，但纤维素水解产物纤维二糖和葡萄糖不能与刚果红形成红色复合物。
在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，接种土壤微生物培养，菌落周围出现透明圈，说明这些细菌能分解纤维素。
透明圈越大说明细菌对纤维素的分解能力越强。
透明圈
微生物的计数方法比较
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M
　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数
缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
结果 比实际值偏大 比实际值偏小
归纳总结
P277
方法 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
用途
接种效果图
相同点
通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散
将菌液进行一系列的等比稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落。
接种环
涂布器
从最后划线区挑取
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落
②用于计数
①都能分离纯化菌种 ②都在固体培养基上进行的
平板划线法 vs 稀释涂布平板法
归纳总结
P277
2．下表为某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方：
请结合所学知识分析，下列相关叙述不正确的是 (　 )
A．根据用途划分，该培养基属于鉴别培养基
B．若要分离能分解尿素的细菌，需将蛋白胨换成尿素
C．若还需鉴定分解尿素的细菌，需将伊红美蓝换成酚红
D．该培养基中蛋白胨只是提供了氮源
【随堂练习276】
D

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