资源简介

(共92张PPT)
第 四 章
基因工程的主要技术及原理
(polymerase chain reaction, PCR)
聚合酶链式反应
第 四节
一、什么是PCR
是体外核酸扩增技术。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的K.B. Mullis 等发明的，因此于1993年获诺贝尔化学奖。
DNA是由四种碱基按互补配对原则组成的螺旋双链。在细胞内， DNA复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，RNA聚合酶合成一小段引物（primer）结合到DNA模板上，最后， DNA合成酶以这段引物为起点，合成与DNA模板配对的新链
PCR就是在体外模拟DNA复制的过程，它用加热的办法让DNA片段变性变成两条单链，让人工合成两个引物结合到DNA模板两端， DNA聚合酶即可以大量复制该模板。
它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点
AGAACTT
TCTTGAA
AGAACTT
TCTTGAA
TCTTGAA
AGAACTT
亲代DNA
子代DNA
二、 PCR的基本原理
DNA的复制 (replication)
由亲代DNA合成两个相同的子代 DNA的过程
（一）原理
在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应
PCR反应扩增的是一对引物之间的DNA片段
（二）基本过程
变性：加热使双链DNA变为单链
退火：降温使引物和互补模板在局部 形成杂交链
延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应
（三）PCR基本反应
以DNA为模板的反应
反应体积：50~100μL
buffer
引物一对
底物：4种dNTP
模板：102~105拷贝
耐热DNA聚合酶（ TaqDNA聚合酶、）
矿物油
模板DNA的用量可根据其分子量的大小调整
PCR缓冲液
在PCR体系中Buffer通常采用10mmol/LTris-HCl （pH8.3-9.0），其中的二价阳离子（通常为Mg2+）可以激活DNA聚合酶的活性中心， Mg2+的浓度可影响PCR扩增产物的特异性。
K+（50mmol/L）利于引物与模板的退火
明胶或血清白蛋白及去污剂（Tween20）起到对TaqDNA聚合酶的稳定作用
循环参数
变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度和时间。94 ℃ ，1min；95 ℃ ，30 s ；97 ℃ ，15 s ；
退火温度和时间：45~55 ℃ ，30 s~1 min
延伸温度和时间：72 ℃ ，时间因扩增片段的长度而异：1kb，1min；3~4kb,3~4min
循环次数：25~35次，视最初靶分子浓度而定
PCR过程中片段增殖的计算
Cycle number Long strands Short strands
0 2 0
1 4 0
2 6 2
3 8 8
4 10 22
5 12 52
6 14 114
20 42 221
X 2（X+1） 2（X+1）-2（X+1）
（一）PCR引物设计
PCR效率和特异性取决于两个方面：一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。
5′引物和3′引物
设计引物时，通常以信息链为基准，5′引物与位于待扩增片段5′上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成；3′引物与扩增片段3′端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成
三、PCR相关知识
PCR引物设计原则
1.引物长度一般15~30个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃,亦会影响产物的生成，且合成引物成本增加
2.引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使 引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量 在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54℃
3.引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。一般引物自身存在的连续互补序列，不超过3bp
4.两引物之间不应存在互补序列，尤其是3′端
5.引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
6.引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。
7.引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子等。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列
（二）模板的取材
病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等
病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等
法医学标本：血斑、精斑、毛发
考古标本
（三）Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶在75~80℃具有最高的聚合酶活性。75~80℃每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70℃时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55℃时为22个核苷酸/秒；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80℃时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关
Taq DNA聚合酶没有3′→5′外切酶活性。没有校正功能。对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1%～0.25%。具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如Vent和Pfu DNA聚合酶。
Taq DNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。但对4种dNTP聚合到3′-未端的能力不同，对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸，因此PCR产物的末端总是带有两个A
附：Pfu DNA聚合酶
此酶来自激烈热球菌（Pyrococcus fariosus），耐热性极好，在97.5℃半衰期大于3小时，具有3 5 外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比Taq DNA聚合酶高12倍，错误率仅为1.3x10-6，是目前使用最广泛的具有3 5 外切酶活性的耐高温聚合酶
产品报价：
产品编号 产品包装 价 格
ST031 200U 120元
ST032 1000U 550元
ST033 3000U 1400元
北京三博远志生物技术有限责任公司
上海闪晶分子生物科技有限公司
来自嗜热细菌（Thermus thermophilus）74℃温度下进行扩增，在95 ℃的半衰期只有20min。在Mg2+存在下以DNA为模板合成DNA，而在Mn2+存在下以RNA为模板合成cDNA。
编号 规格 售价￥
ZP00401 100U 400
ZP00402 500U 1600
ZP00403 1000U 3000
Tth DNA 聚合酶
Vent DNA 聚合酶
VentR (exo– ) DNA 聚合酶（价格参考）
#M0257V 100 units . . . . . . . . . 319
#M0257S 200 units . . . . . . . . . 629
#M0257L 1,000 units . . . . . . . . 2,789
Vent DNA 聚合酶来自嗜热高温球菌（Thermococcus litoralis）是一种高保真的耐热 DNA聚合酶，其保真度比 Taq DNA 聚合酶高 5 倍。该酶具有高保真性的其中一个原因是自身具有 3'→5' 核酸外切酶校读活性。在 95 ℃温育 1 小时后，仍具有 90% 以上的聚合酶活性。
VentR （exo-）DNA 聚合酶是 Vent DNA 聚合酶经基因工程改造而得，去除了 3'→5' 核酸外切酶校读活性，它是应用于高产量 PCR 的首选酶，其保真度有所降低，大约比 Taq DNA 聚合酶高 2 倍
Pwo DNA聚合酶试剂盒
Pwo DNA聚合酶来自嗜热生物(archaebacterium Pyrococcus woesei),大小为90kDa，具有高持续性的5‘’ → 3‘’DNA聚合酶活性，同时具有3‘’ → 5‘’核酸内切酶活性， 商用的Pwo DNA聚合酶是利用DNA重组技术从E.coli中生产的，此酶已经失去了5‘’ → 3‘’核酸内切酶活性，而且，它在热稳定性和保真度方面都要高出Taq酶10倍。Pwo DNA聚合酶可以生产平末端的PCR产物。
应用：
1. 在标准的PCR反应中可代替Taq酶；
2. 克隆PCR产物（生产平末端PCR产物）；
3. 鉴定组织中稀少的基因突变和等位基因多态性；
4. 鉴定纯细胞群体；
5. 通过PCR合成标记核酸产物
阳性对照：阳性DNA模板
阴性对照：阴性DNA模板
单引物对照：有DNA模板；只加一个引物
（四）设置严格对照
增加退火温度
减少TaqDNA聚合酶的浓度
减少退火及延伸时间
减少引物浓度
减少扩增循环次数
（五）出现非特异性产物时应采取的措施
根据上述说明PCR仪程序设置为：
Step 1 94℃ 2 min
Step 2 94 ℃ 40sec
Step 3 55 ℃ 45sec
Step 4 72 ℃ 50sec
Step 5 to step 2 34 cycles
Step 6 72 10min
Step 7 10 16 hr
Step 8 stop
（六）PCR仪的程序设置
四、实时定量PCR（real-time
quantitative PCR）
实时定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析的方法。
荧光定量PCR(FQ-PCR)是基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)的原理建立的。FRET是指通过供受体发色团之间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色团转移至受体发色团，使受体发光。检测方法有双链DNA内插染料、双标记探针、分子信标技术等多种
在“普通PCR 仪”的基础上，配备一个激发和检测的装置（包括电脑及相关的软件）。通过PCR反应的数学函数关系，加入标准品，可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。该法具有高特异性和可靠性，实验结果稳定，重复性好，在临床检测方面有广泛的用途，如对病毒、病菌和其他病源微生物致病基因的检测
（一）荧光实时定量PCR的优点：
1) 全封闭反应，无需PCR后处理
2) 污染机会降低
3) 实时监测，结果直观，避免人为判断
4) 特异性强，灵敏度高
5) 采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确
6) 体现循环数与模板起始浓度的线性关系
7) 操作安全，缩短时间，提高效率
8) 利于自动化和联网管理
（二）实时定量PCR基本原理
常规vs实时
常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析（左图）
定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，精确对起始模板的定量分析（右图）
定量PCR三个基本概念
1.扩增曲线
指数增长期
平台期
线性增长期
背景期
2.阈值与C(t)值
阈值：默认的是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期
C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数，也称临界循环数
Threshold line
C(t) value
C(t) value
18.12 +/
-
0.04
Threshold line
C(t) value
C(t) value
18.12 +/
-
0.04
C(t) value
18.12 +/
-
0.04
C(t) value
18.12 +/
-
0.04
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
104
103
106
105
102
10
C(t)与初始模板含量
初始模板量越多，C(t)值越小
C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系
3.定量原理
浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量
化学原理
化学方法分类
非特异性
SYBR Green I法
特异性
TaqMan探针法
SYBR Green I 法
结合双链DNA分子小沟
延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度
优点
使用方便，无需复杂的设计
成本较低
缺点
与非特异性产物结合，无模板特异性
试验方法较难优化
灵敏度低
TaqMan探针法
水解型
报告基团，淬灭基团
FRET（荧光谐振能量传递）
识别特异性产物
优点
特异性高，可准确定量
灵敏度高
设计不同标记的探针，可进行多重检测
缺点
一个探针只适用于一个目标
价格较高
探针设计较繁琐
4.定量PCR的实验设计和数据处理
绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）
相对定量：计算初始反应模板的相对含量
定量PCR--绝对定量
标准品，标准曲线
已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释
根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线
样品
与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值
unknown
104
103
使用定量PCR进行绝对定量的优势
敏感性高
检测低拷贝数样品：单拷贝
大范围拷贝数样品同时检测
100—1010
省时有效
定量PCR--相对定量
相对定量的目的
比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）
相对定量的问题
样品材料不均一造成的差别
内标基因
内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）
对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差
附：常用的引物设计软件
Oligo 6 （专门的引物设计软件）*
Primer Premier （自动搜索）*
Vector NTI Suit
Dnasis
Omiga
Dnastar
Primer3 （在线服务）*
Primer Premier 5.0
使用简介
主要功能：
引物设计
限制性内切酶位点分析
DNA基元(motif)查找
同源性分析
Primer Premier 5.0使用介绍
Primer Premier 启动界面
Load sequence
基本信息
Sequence name
Original sequence
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq
8种密码子偏好
Choose a function
引物设计界面
First you can design the primer manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
引物搜索选项设定
引物类型
搜索模式
5’引物位置范围
3’引物位置范围
产物大小范围
引物长度
搜索结果
28对引物
引物分值
100分为满分
每对引物的信息
双击选中一对引物
引物信息
回到主窗口
引物及产物信息
是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer
一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有
But …
引物编辑
引物编辑
Edit primer here
Analysis the edit result
Accept the edit result Return to the main window
复习题：
什么是PCR？
PCR技术的基本原理。
PCR反应的基本成分。
PCR引物设计的原则有哪些？
第五节 DNA序列分析
Sanger双脱氧链终止法
Maxam-Gilbert化学裂解法
1
2
测序的常用方法
1. 末端终止法 2. 化学裂解法 3. DNA测序自动化
使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法 用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序 类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出
优点 简便、迅速、应用广泛 不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序 1. 高负荷，1块胶可测16个样品；
2. 机读不需放射自显影；
3. 安全不用同位素；
4. 简单迅速8-10 h
Sanger双脱氧链终止法
(chain-terminator method)
1977年Sanger充分利用DNA复制的生物学特性, 设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法, 进行DNA序列测定, 即双脱氧链终止法
因Sanger法测定了碱基序列, 获得1980年诺贝尔化学奖 (之前：1958年，用酶法测得人胰岛素的氨基酸排序而得诺奖)
一、
弗雷德里克·桑格
母校
圣约翰学院
格洛斯特郡（英格兰）
1.Sanger双脱氧链终止法原理
在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列
2.双脱氧终止法测序反应体系：
DNA聚合酶
单链DNA模板
带有3’-OH末端的单链寡核苷酸引物
Mg2+
4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)
4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)
Sanger法DNA测序的试剂
① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡结构
② 模板(待测DNA)
③ DNA聚合酶
④ dNTP
⑤ 2’,3’-双脱氧核苷三磷酸
（ 2’,3’-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ）
3.测序反应的标记种类
① 引物标记法(Dye primer reactions)
② 终止物标记法(Dye terminator reactions)
This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached to the 3' carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.
This figure is a representation of an acrylamide sequencing gel. Notice that the sequence of the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5' to 3' ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand, 5' to 3', is AATCTGGGCTACTCGGGCGT
4.测序过程:
(1) 模板纯化与引物合成
(2) DNA链的延长和合成阻断
四个试管分别加入：DNA聚合酶、dNTP、标记引物
终止剂不同 ddA ddG ddC ddT
四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链
(3) 电泳 ACGT次序 高压电泳
(4) 放射自显影得到直读图象
Maxam-Gilbert化学裂解法
化学裂解法是Maxam 和Gilbert 等人1977年创建的，用来测定DNA序列, 即化学直读法, 简称作化学法。
某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而使N-糖苷键断裂，致使在3’ 和 5’位上的磷酸二酯键断裂，戊糖脱落。
硫酸二甲酯可作用于嘌呤环，而联氨可作用于嘧啶环
二、
腺苷(AR) 脱氧胞苷(dCR)
β1 , N9-糖苷键 β1 ,N1-糖苷键
β1
β1
N9
N1
OH
哌啶
1.化学裂解法测序的原理
(1) 用放射性核素标记待测DNA一侧末端
(2) 将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系
(3) 用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组混合物
(4) 电泳分离，放射自显影得到图谱，即可读出DNA序列
表: 特异断裂4种脱氧核苷酸的方法
作用碱基 试剂与反应 碱基释放 DNA断裂
强G/弱A 稀释250倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（PH8.0）10MMgCl2、0.1M EDTA 20℃60分钟，DNA中G的N7和A的N3甲基化 甲基化嘌呤不稳定，在中型pH加热被破坏 在0.1M碱中，90℃15分钟，戊糖脱落，DNA链断裂，G断裂比A快5倍
A 同上 0.2N HCl，0℃，60分钟，碱基被破坏 同上，A断裂比G快
C+T 15-18M联苯胺、20℃50分钟，嘧啶环被破坏释放 0.5M哌啶处理，断裂DNA键，C与T有同样速率
C 2M NaCl，联氨处理方法同上，100分钟，此时，T的破坏被抑制，只有C被破坏释放 同上，只在C处断裂DNA链
在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：
G反应----硫酸二甲酯（DMS）使G的N7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶（也叫六氢吡啶）置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。
G+A反应----甲酸使嘌呤环上N原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。
T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。
C反应----在高NaCl存在时，只有C与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换
碱基特异性修饰及裂解
反应体系 修饰试剂 碱基修饰反应 置换试剂 断裂点
G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G
G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G和A
C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C和T
C 肼（高盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C
（1）限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回收每1个片段作为测序材料
（2）碱性磷酸酶处理消除5’磷酸
（3）多核苷酸酶催32P dNTP标记（5’-OH）末端
（4）使标记片段变性为单链
（5）分4个反应体系，按上述程序（4个机制）化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂），DNA链上每50-100碱基只有1个被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长
（6）电泳
（7）放射自显影
（8）4个反应管统一阅读，DNA的4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出
2.化学法测序的基本步骤
G G+A T+C C
Ａ　Ａ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｔ　Ｔ　Ｃ　Ｇ　Ａ－＊　
3.化学法的优点
化学法一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况。（不能通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用）
不需酶催化
5 ′和3 ′端均可标记，可从两方向测同一DNA
操作繁琐、费时、分辨率较低
三、 大片段DNA序列测定的策略
人类基因组计划的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱完成，人类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序取得了突破性进展，测序策略的成熟、测序方法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能力的提高， 大大推进了大规模DNA测序的进程
1.定向测序策略
?
定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析 。传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列分析
2.随机测序策略?
随机测序策略又称鸟枪策略(shotgun strategy)，此策略是将被测基因组DNA随机切割成2Kb左右的小片段，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列
3.多路测序策略
?
多路测序策略(Multiplex method)是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅读，快速分析DNA序列的一种技术。这种方法的复合随机克隆文库来源于相同的基因组DNA。 将 DNA片段克隆到20种不同的质粒载体上，再亚克隆进不同的质粒载体。将来源20个亚克隆库的克隆进行测序
4.大规模DNA测序的趋势－自动化
DNA测序实现规模化的重要条件是自动化和机械化。目前，DNA制备、克隆文库 组建及筛选、DNA测序分析、数据的分析获得、碱基序列阅读、重叠克隆群顺序排定等过程 均已平行发展，自动化操作紧随其后。随着DNA测序不断由半自动化向自动化过渡，原始数据积累将不成问题，关键是把全基因的散测序组装起来，以实现DNA测序的完整性。目前，在亚克隆筛选、模板制备、测序反应、碱基阅读等方面均在一定程度上实现了自动化
310型全自动遗传分析仪
DNA全自动分析仪：
ABI Prism 3100遗传分析仪
3700型全自动遗传分析仪
安玛西亚DNA序列分析系统型号：MegaBACE 500/1000/4000
分析仪器的新发展：
377型遗传分析仪
377 型DNA 全自动测序仪采用经典的聚丙烯酰胺凝胶的电泳方式, 结合美国应用生物系统公司专利的四色荧光标记, 激光检测, 一个泳道检测的方法, 具有测序结果准确性好, 精度高, 操作简便快速等特点, 已成为全球应用最多最广泛的全自动DNA 测序仪之一
454型测序仪
Life Technologies公司
最先推出的是Ion Proton I芯片，适合外显子组测序。
新一代Ion Proton测序仪
DNA序列测定的自动化
Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列
红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）
黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）
绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP）
兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）
复习题：
DNA测序有哪些方法
Sanger双脱氧链终止法原理

展开更多......

收起↑