资源简介

(共77张PPT)
DNA分子克隆的一般过程
目的基因的获取
体外重组
导入到宿主细胞中进行扩增或表达
从众多的转化子中筛选和鉴定阳性克隆
第一节 目的基因的获取
首先是获得含目的基因在内的DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链cDNA分子；
已知的基因序列且比较小,可用人工化学直接合成；
如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因
一、PCR技术获取目的基因
1. cDNA的合成
cDNA 的合成可用 RT-PCR(reverse transcription PCR)法。也称反转录PCR。它是一种酶促合成法，即以mRNA为模板，在反转录酶的作用下，以4种脱氧核苷三磷酸为材料合成DNA(cDNA)，再经复制后即成双链DNA。
从真核生物中提取mRNA，由于mRNA后有80-200 bp的Poly(A)，用互补的12-18个核苷酸的Oligo (dT)合成的一种组织中所有mRNA对应的cDNA第一链。然后使用末端转移酶在cDNA第一链末端加上多聚C，经变性和水解mRNA后，加入末端为多聚G的引物合成其互补链(第二条链)，再经PCR进行大量扩增
因为真核生物的基因由编码的外显子和大量不编码的内含子两种序列组成，用这种方法得到的基因没有内含子，不具有启动子和终止子，所以缺乏功能活性。如果外接一段调节序列，就能在受体细胞中表达，所以此法是克隆真核生物基因的有效方法
自从1970年Temin等发现反转录酶以来，此法已广泛应用于人、猪、田鼠 、鸭的基因克隆
2.通过反向PCR进行基因组DNA片段的克隆
从基因组通过PCR克隆DNA片段关键是引物的设计，一般可以根据已经发表的DNA序列设计引物，也可以根据已有的cDNA或EST序列 设计引物。如果根据cDNA序列设计引物扩增gDNA(genome DNA)，设计引物时应该考虑到cDNA无内含子，而gDNA有内含子，设计的引物不应落在外显子的拼接点上。设计引物时，经常会在引物的末端加上一个酶切位点，以利于DNA片段和载体的连接
反向PCR是一种根据已知序列扩增其旁侧序列的方法，利用这种方法可以进行染色体步移 (chromosome walking)。反向PCR (I-PCR)是Triglia等1988年设计的一种方法(原理见图)。首先将基因组DNA用限制性内切酶切割，选择的限制酶应在已知序列中没有“切点”。然后通过连接酶将酶切片段连接，在连接产物中，那些包含已知序列的环状DNA会得到扩增，从而获得已知DNA片段的旁侧序列。I-PCR被用于从酵母基因组DNA中分离YAC克隆末端，从植物基因组DNA中分离转座子侧翼的特异区域；也被成功地应用于探测乙肝病毒(HBV)和T淋巴病毒(HTLV)的结合部位。然而I-PCR也存在着若干问题，比如环化反应难以控制，存在分子间的连接而形成大量的线状串联体，这导致非特异扩增，如果酶切片段太长，也会使扩增效率下降
3.锚定PCR与基因克隆
经RT-PCR得到的大量双链cDNA以后，如果要筛选出特定的目的基因，除了利用cDNA文库筛选外，还可利用锚定PCR得到。这种方法的特点是有一个特异性的引物, 适合于扩增那些只知道一段序列的目的DNA。如对一端序列已知、一端序列未知的DNA片段，可以通过DNA末端转移酶给cDNA第一链末端加上一端多聚dC尾巴，然后加入1个多聚dG的特异引物。
其关键是5’引物，3’引物是通用锚定引物。5’引物决定了扩增的特异性，5’引物可以根据已知序列设计，也可以根据已知的蛋白序列设计
锚定PCR在生物遗传变异研究中已有初步应用。随着分子生物学的发展，锚定PCR有望成为研究生物遗传变异、种系发生、物种分类以及分子流行病等的有用工具
4.热不对称PCR
第二轮PCR则是以AP1 Primer为上游引物，SP2 Primer为下游引物
第三轮PCR则是以AP1 Primer为上游引物，SP3 Primer为下游引物
最后切胶回收清晰的电泳条带，以SP3 Primer 为引物对PCR产物进行测序
构建文库是先将细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将之与适当的载体进行体外重组；再引入到相应的宿主细胞中繁殖和扩增，从而形成含有重组DNA分子的群体。从理论上讲，这些重组子应包含有整个基因组DNA序列，即包含了该生物细胞的全部基因，故称之为基因组文库（genomic library）或基因文库（gene library）
什么是基因文库 一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体整个基因组，这一集合就是该生物体的基因文库
二、通过筛选基因文库获取目的基因
通过筛选基因文库获取目的基因是一种直接从基因组中分离目的基因的方法
例如：用λ噬菌体载体构建基因组文库的操作程序主要包括：
①用适当的限制性内切酶消化基因组DNA，以得到约20kb的大片段；
②用限制性内切酶切割载体DNA，使载体形成与外源DNA相匹配的粘性末端；
③用适当方法，去除λ噬菌体裂解生长非必需的内部片段；
④λ噬菌体载体臂与外源DNA大片段连接成较长的多联体；
⑤利用体外包装系统将多联体组装成完整的颗粒；
⑥重组噬菌体侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，每一克隆中含有外源DNA的一种片段，全部克隆构成一个基因文库。
下页图表示了基因文库构建的基本过程
基因组文库的构建过程
如何通过筛选基因文库获取目的基因
常用的筛选法有核酸分子杂交法和免疫学筛选法
基因组文库
或cDNA文库
表达型cDNA文库
菌落或噬菌斑平板
目的基因的局部片段
或其他物种同源片段
探针
核酸分子杂交
免疫学筛选
目的基因表达的蛋白抗体
或部分ORF表达出的抗体
阳性克隆
阳性克隆
进一步鉴定
基因文库筛选示意图
用自动合成仪合成寡核苷酸链，再将其连接起来形成基因
化学法只适于合成较小的片段，所以在基因的化学合成中，通常是先合成一定长度的、具有特定序列的寡核苷酸片段。
常用的方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法等
三、化学合成法
1.原理：
亚磷酸三酯法
原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3’-末端先以3’-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接，然后依次从3’-5’的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团也是经过保护的，具体的合成和延伸过程如图
磷酸二酯法
2.用途：
合成探针
合成接头（或连接子）
基因的半合成（酶促合成）
基因的全合成
对较短的基因
基因的组装
目前，化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150-200bp，而绝大多数基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因
常用的基因组装方法主要有两种：
一种方法是将寡聚核苷酸激活，带上必要的5’-磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，再用T4DNA连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段
第二种方法是将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段，可经处理插入适当的载体上
第二节 重组体的构建
（一）具有相同粘末端的DNA分子之间的连接
储存时：使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化
一、粘末端DNA片段的连接
（二）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接
用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体
HindIII
EcoRI
HindIII
EcoRI
载体酶切
HindIII
EcoRI
基因酶切
质粒载体的定向重组
二、平末端DNA片段的连接
1.直接用T4连接酶连接
2. 同聚物加尾法
如果在连接的两个DNA片段没有能互补的粘性末端，可用末端核苷酸转移酶催化脱氨单核苷酸添加DNA的3’末端，例如DNA3’端加上polyG，另一股DNA加上polyC，这样人工在DNA两端做出能互补的共核苷酸多聚物粘性末端，退火后能结合连接
3. 衔接物连接法
是指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成，具一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段
4. DNA接头连接法
接头的一端是齐平的，而另一端是某种内切酶的粘性末端，先利用齐平末端连接方法将它与平端的外源DNA连接起来，造成人工粘性末端，即可再与之互补的粘性末端的载体DNA相连接
三、载体与DNA片段酶切位点不匹配的连接
所谓载体与DNA片段酶切位点不匹配，指载体与待克隆的DNA片段上的酶切位点不相同，因而用一种或两种酶切制造不出可互补的粘性末端
1.按照平末端连接方法加上接头
2.将凹端变为平端
（1）使用Klenow酶在4种dNTP存在下，将3′凹端完全补平
（2）用S1核酸酶去除3′突出末端产生平端DNA分子
3.使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分补平3′凹端转变成粘端
TCGA
AGCT
GATC
CTAG
载体经xhoI酶切形成：
外源基因用San3A酶切形成：
用Klenow酶部分补平二者的3′ 凹端，形成：
TCGA
AGCT
GATC
CTAG
CT
TC
AG
GA
这样，就可以实现有效重组
3′
3′
3′
3′
5′
5′
5′
5′
四、cDNA与载体的连接
通过依次加入连接合成的DNA接头进行cDNA克隆
第三节 基因转移方法
一、重组DNA导入大肠杆菌
（一）转化
将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化
为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子，我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理，处理后的细胞吸收外源DNA的能力大大提高，被称为感受态细胞
对于大肠杆菌细胞，一般采用50mmol/L的CaCl2溶液来制备感受态细胞
大肠杆菌感受态制备操作步骤
　一、 受体菌的培养
　　从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落, 接种于3-5mL LB液体培养基中, 37℃下振荡培养12小时左右, 直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mL LB液体培养基中, 37℃振荡培养2-3小时至OD（A600nm ）＝0.5左右。
二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
　　1.将培养液转入离心管中, 冰上放置10 min, 然后于4℃下3000g离心10分钟。
　　2. 弃去上清, 用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10 mL轻轻悬浮细胞, 冰上放置15-30 min后, 4℃下3000 g离心10 min。
　　3.弃去上清, 加入4mL预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液, 轻轻悬浮细胞, 冰上放置几分钟, 即成感受态细胞悬液。
　　4. 感受态细胞分装成200μL的小份, 贮存于-70℃可保存半年
（1）吸附阶段：完整的双链DNA分子吸附于感受态细胞表面
（2）转入阶段：双链DNA分子解链，以单链形式进入细胞，而另一链则被降解
（3）自身稳定阶段；外源质粒在细胞内又复制成双链环型DNA
（4）表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制，并被转录、转译
DNA分子转化的过程：
质粒DNA的大小及构型对转化效率的影响：
（1）大小 ＞ 10Kb，转化效率很低
（2）构型 超螺旋＞环形＞线状
（二）转染
（2）λ噬菌体的体外包装
转染(transfection)：是指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子的过程
（1）转导和转染的区别
转导(transduction)：借助病毒、噬菌体或其他方法将外源DNA导入细胞并整合到宿主基因组上而引起的基因重组现象。
转染：指外源基因通过病毒或噬菌体感染细胞而被吸收的过程
体外包装：是指在体外模拟λ噬菌体DNA在受体细胞内的一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包装成为成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术
λ噬菌体的体外包装的原理：
根据λ噬菌体DNA的体内包装途径，分别获得缺失D包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失E包装蛋白的λ噬菌体突变株。由于不具备完整的包装蛋白，这两种突变株均不能单独包装λ噬菌体DNA，但将两种突变株分别感染大肠杆菌，从中提取缺失蛋白D的包装物（含E蛋白）和缺失E蛋白的包装物（含D蛋白），两者混合后就能包装λ噬菌体DNA
二、重组DNA导入植物细胞的方法
（一）载体介导的转化方法
1.共培养法(cocultivation)
该方法是Marton等1979年以原生质体为受体建立起来的，随后经过一系列的改进，现在是植物基因工程中最常用的一种转化方法。该方法的主要原理是将受体与供体在一起培养，通过接触感染而发生转移，供体常用农杆菌、病毒载体等形式
（1）原生质体共培养法
取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化
①从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养24小时
②原生质体与农杆菌混合培养，原生质体浓度l05／mL、农杆菌l07／mL，20℃下保温32小时
③冲洗去游离的细菌，将原生质体培养在有抗生素(250mg／L万古霉素，200mg／L羧苄青霉素，200mg／L链霉素)的培养基中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害
④ 3周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，2周内，转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中可快速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡
例:烟草原生质体与Ti质粒转移的共培养法程序
（2）叶盘共培养法
该方法最早由Horsch(1985)首创，用于烟草转化
优点：适用性广，对于那些能被农杆菌感染的、并能从叶子再生植株的各种植物均适用
（3）悬浮细胞或愈伤组织共培养
（4）活体接种(inoculation in vivo)
原则上，该种共培养与原生质体共培养的方法和步骤是相同的，在供体上，则必须是有侵染和感染能力的载体系统，如带有Ti质粒的根癌农杆菌。
所谓整体植株接种转化法，是指人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌注射到植物体内，使农杆菌按照天然的感染过 程在植物体内进行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。接种后2-3周，切下接种处部分组织培养4周，可产生愈伤组织，进一步通过分化培养可获得转基因植株
2、病毒介导的基因转移
（1）双链DNA病毒转化载体
这类病毒是以双链DNA作为遗传物质，在这类病毒中，目前研究的最多的是花椰菜花叶病毒（简称CaMV, Caullinus Mozic Virus）。
（2）单链DNA病毒转化载体
GeNV, 顾名思义，可翻译成“双联体病毒”或“孪生病毒”。GeNV的感染范围较广，包括单子叶和双子叶植物，它们的传播媒介是昆虫
（3）单链RNA病毒转化载体
迄今为止，还没有建立起一个完善的以植物RNA病毒为基因载体的基因转化体系，但是RNA病毒仍是一个很有希望作为基因工程载体的植物病毒
（二）DNA直接导入法
1.物理方法
（1）基因枪法
80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限
该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体
首先将钨、金微粒(直径约0.4μm,重量约0.05mg)与供体DNA溶液(1-2μL)混合并保温，使DNA吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的“基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以进入受体细胞
操作技术程序为：
基因枪示意图
基因枪所用材料：
（1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。
（2）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇(PEG)、异丙醇等，但多用前两种
（3）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。
基因枪法的特点：（1）转化效率高
（2）受体广泛
（3）操作简单
（2）电激法(electroperation)
电激法是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。
原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（Vm）约为l00mV，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿
电激法操作程序：
将盛有细胞和DNA混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负极之间，在0℃下加高压（2～4 kv），电脉冲10 min后，将待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长2 d，再进行筛选。存活细胞的回收率约为60%～ 80%。
可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原
不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低
（3）微注射法（micro-injection）
微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头一道进入
真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法
显微注射技术的关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的固定。对于植物细胞而言，首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。
常用的细胞固定方法有3种：琼脂糖包埋法、多聚赖氨酸粘连法、吸管支持法
（4）激光微束法(laser microbeam)
（5）超声波法
此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞
基本原理：是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞
利用超声波处理可避免脉冲高压对细胞的损伤作用，有利于原生质体的存活，是一种有潜力的转化途径
（6）离子束法
离子束作用在生物表面后可引起电子溅射，离子束的溅射好象一把手术刀，对生物体进行微细加工，使生物体表面层层剥离，原来不连通的通道在一定距离内连通，后来的离子就可穿行较长的距离，落在预定的位置上
2．化学方法
（1）PEG (聚乙二醇) 法
是细胞融合剂，它可以使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使相互之间的接触和粘连；还可以引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞膜之间的融合和外源DNA进入原生质体
（2）脂质体法
脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜结构，可将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内
早期：丝氨酸磷酸+胆固醇
第二代：二油酰乙醇胺磷脂+胆固醇+软脂酸
3. 种质系统法(germ line transformation system)
（1）花粉管通道法（pollen-tube pathway）
在显花植物中利用花粉在柱头上萌发进入胚囊所留下的通道，将外源基因渗入到胚囊中的基因直接转移方法
1）受体是整株水平，无须离体培养，突破了宿主范围的限制，可应用于任何开花植物。
2）转化可用于重组DNA，甚至是总DNA。
3）操作技术条件宽容。
4）转化率高
优点：
（2）浸渍法
该法是用外源DNA溶液直接来浸种、浸苗、浸穗等手段来诱导受体产生变异的基因直接导入法。
优点：操作简单，受体广泛
缺点：缺乏理论依据
如：万文举用玉米(品种CYB)DNA浸泡水稻(品种XR)干胚，后代出现广谱分离，在遗传上，出现有8％左右的1.5m以上的接近供体玉米植株高度的个体，干粒重、生育期都出现了相当程度的分离。选出的优良株系，形态上具有典型的C4叶光合结构，生理上，C4光合关键酶PEP高于原亲本，更高于水稻；生化上，后代出现有唯玉米CYB才有的两条酶带(过氧化物酶同工酶和脂酶同工酶)；栽培上，表现出抗病、抗高温、耐低温，产量相当于杂交稻，起名为遗传工程稻"GRE-1”
（3）胚囊和子房注射法
胚囊、子房注射法是指用显微注射仪把外源DNA溶液注入子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生高的压力及卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植株
三、重组DNA导入动物细胞的方法
1. 磷酸钙沉淀法
其原理是：磷酸钙可以同被转染的DNA形成一种DNA-磷酸钙沉淀物。这种沉淀物黏附到培养的动物单层细胞表面后，会迅速地被细胞捕获，从而使外源DNA分子进入动物细胞中
2.脂质体介导感染法 脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜结构
3.细胞核的显微注射法
5. DEAE-葡萄糖转染技术
6.电击法
二乙胺乙基葡萄糖（diethyl-aminoethyldextrac，DEAE-dextran）是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进动物细胞捕获外源DNA。但其作用的机理尚不清楚，可能是其与DNA结合从而抑制核酸酶的作用或与细胞结合而促进DNA的内吞作用
4.病毒感染法
第四节
重组子的筛选与鉴定
外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况：
（1）
（2）
（3）
转化
E.coli
一、载体表型特征选择法
（一）抗药性标记插入失活筛选法
例：pBR322
如果外源基因插入到tetr基因内部，Tetr抗性消失，表型为不抗四环素（Tets）、而仍抗氨苄青霉素（Ampr），这样的转化细胞在含有 Amp的培养基仍可生长，但在含有四环素的培养基上不能再生长；反之，如果Ampr基因由于外源基因插入其内部而失活，带有重组DNA分子的转化细胞在含有Tet的培养基平板上生长，在含有 Amp的培养基不能生长
插入失活法筛选重组子
（二）α-互补效应选择法
例: pUC质粒
在LacZ- 的大肠杆菌中，在平板培养中，菌落是白色的。若在该细胞中引入pUC质粒，其上有LacZ′，质粒和大肠杆菌DNA可实现α-互补，菌落呈蓝色
如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因，则LacZ′基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色
二、根据插入序列的表型选择法
进入受体细胞的重组DNA分子中的外源基因如果在宿主细胞中能实现功能表达，产生出有功能活性的基因产物，那么鉴定此种重组体最简便的方法就是表型特征的直接选择法
以上两种方法统称遗传检测法
三、DNA凝胶电泳检测法
四、R-环法
在临近双链DNA变性温度下和高浓度（70%）的甲酰胺溶液中，即所谓的R-环条件下，双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此，将RNA和DNA的混合物置于这种条件下，RNA便会同双链DNA分子中与之互补的序列退火形成稳定的 DNA-RNA杂交分子，而另一条DNA链则成为单链状态。这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体，叫做R-环结构
以上两法为
物理检测法
五、核酸杂交检测法
例：原位杂交筛选重组体菌落(或噬菌斑)
六、免疫化学检测法
免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种
转化菌落
影印平板
置于含氯仿饱合气体的容器
细菌裂解抗原释放
覆盖吸附有未经标记的抗体的NC膜
形成抗原抗体复合物
将NC膜与I125标记的抗体温育
放射自显影
与母板对照，挑取所需的重组克隆
标记抗体测定法的步骤：
用免疫化学法检测克隆在表达载体pUC8上的基因
免疫沉淀测定法 是指可溶性抗原的相应的抗体在适当条件下特异的结合而出现沉淀反应
八、DNA-蛋白质互作筛选法
原理：
外源DNA
蛋白质
翻译
能与某一特定DNA序列结合
操作：以此特定的DNA作为探针与克隆群体杂交
七、DNA序列分析
与测序质粒连接，测序
九、PCR检测法
设计特异引物，进行基因克隆
十、转译筛选法
转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法，可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种方法
1.杂交抑制转译
要求：被研究的目的基因编码有丰富的mRNA
DNA
蛋白质
mRNA
蛋白质
×
杂交
原理：
步骤：
转化菌落
提取重组DNA
与总mRNA杂交
形成DNA-RNA杂种分子
将总mRNA（包括DNA-RNA分子）
提取出来
体外转译
蛋白电泳放射自显影（1）
总mRNA
体外转译
蛋白电泳放射自显影（2）
经对比, (1)比(2)中少了一种蛋白质
找到一种转译作用被抑制了的mRNA
筛选出重组菌落（或噬菌斑）
2. 杂交选择转译
观察到在这种杂交选择的转译中，存在着一种特殊活跃的mRNA
重组体库
提取DNA
固定在NC膜上
与mRNA或总RNA杂交
目的基因与对应的mRNA杂交，mRNA固定在NC膜上
将分离mRNA的进行体外转译
凝胶电泳或生物活性检测
找出单菌落重组体
再见
基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。 基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。基因打靶技术将广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型的研制以及经济动物遗传物质的改良等方面

展开更多......

收起↑