资源简介

(共44张PPT)
生物技术专业
基 因 工 程
目的与要求：
1.掌握基因工程的基本概念和原理；
2.了解基因操作的主要技术原理和应用；
3.了解基因工程的研究内容；
4.初步掌握基因工程基本的实验操作技术。
本课程教学目的与要求
理论： 32学时 实验: 16学时
主要参考书：
②楼士林，杨盛昌，龙敏南,章军编著.《基因工程》,科学出版社,2002
③吴乃虎编著.《基因工程原理》(上、下册),科学出版社，2002
①何水林 主编.《基因工程》科学出版社,2011
第一章 基因工程概述
第二章 基因工程工具酶
第四章 基因工程主要技术
第三章 基因工程载体
第六章 DNA重组的操作
第八章 蛋白的分离与纯化
第七章 基因的高效表达
本课程内容介绍：
第五章 目的基因的获得
第九章 基因工程的应用
3
基因工程的发展
2
基因工程的概念
1
基因工程的应用
第一章 基因工程概述
基因工程的核心地位
分子生物学
基因工程
生物工程
生命科学
一、 什么是基因工程
在分子水平上提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体，使外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增，或生产不同的产物，或定向地创造生物的新性状，并能稳定地遗传给后代
基因工程的核心内容包括基因克隆和基因表达
基因工程的重要特征：
打破了物种的界限 也是基因工程的优势
可对物种性状进行定向改良
创造物种
这是有可能实现的，当实现了人们能够按自己的意愿来重组基因时，便可以以一种生物为蓝本把它的基因加以改变，就会创造出一个新的物种
1980年通过显微注射法培养出的世界上第一个转基因动物---- “硕鼠”
完全由人造基因控制的单细胞细菌
2010年5月20日美国顶尖科学家克莱格·凡特等合成人造细菌内核
二、基因工程一般操作
General process of gene engineering
1. 从生物有机体基因组中，分离带有目的基因DNA片段
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子
3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞并与之一起增殖
4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞,并筛选出已经得到扩增的目的基因
5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系
1. DNA片段的取得（目的基因的分离和制备）
2. DNA片段和载体的连接——重组体DNA
3. 外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基因文库
4. 选择基因（目的基因）
5. 目的基因表达
切
接
转
选
表
基因工程一般操作可概括为：
基因工程的上游技术和下游技术：
基因工程包括上游技术 和下游技术 两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程
生物材料
mRNA
DNA
RNA
cDNA文库
基因组文库
目的基因
人工合成
克隆载体
重组DNA
受体细胞
克隆子
转基因生物
基本技术路线：
在此基础上根椐自己的目的和要求进行增删和具体化
三、基因工程的基本条件
1. 目的基因
2. 载体
根据作用可分为克隆载体和表达载体
3. 工具酶
4. 受体细胞
四、基因工程的技术策略
强化基因的表达
关闭基因的表达
基因的异源表达
思路有三：1.异源表达特定功能蛋白；2.利用已有的途径构建新的代谢支路；3.转移特定合成酶基因，使转基因生物获得新的合成功能
五、基因工程的发展历程
１基因工程准备阶段
　　 1928年F.Griffith首先发现细菌转化的现象，1944年O.Avery及其同事做的细菌转化试验，在转化过程中，游离DNA 的片段被活的细菌所接受，导致部分后代遗传性状发生了稳定的改变 。通过该实验，证实遗传物质是DNA----基因载体
Griffith肺炎球菌转化实验
光滑型(S)菌株能引起人的肺炎和小鼠的败血症(septicemia)。这种菌株的细菌细胞外面有多糖类的胶状荚膜保护层，使它们不会被宿主的防御机制所破坏。其他一些菌株没有荚膜，不会引起疾病，长成粗糙型(R)菌落
此发现，开启了分子生物学时代。分子生物学使生物大分子的研究进入一个新的阶段。在此以后的近50年里，分子
遗传学、分子免疫学、细胞生物学等新学科出现，DNA重组技术更是为利用生物工程手段的研究和应用开辟了广阔的前景
1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型，并指出遗传信息储存在DNA分子碱基序列之中
弗朗西斯·克里克（Francis Crick）1916 - 2004
詹姆斯· 杜威· 沃森（James Dewey Watson）1928-
1953年4月25日，Francis Crick和James Watson在《Nature》杂志上发表了DNA双螺旋分子结构，当时Francis Crick三十七岁，James Watson只有二十五岁。他们的发现在1962年获诺贝尔医学生理学奖，由Francis Crick，James Watson和Maurice Wilkins共享
James Watson and Francis Crick with their DNA model at the Cavendish Laboratoriesin 1953.
Photograph copyright by A. Barrington Brown
卡文迪什实验室
Maurice Wilkins (1916-2004 )
Like Crick, New Zealand-born Wilkins trained as a physicist, and was involved with the Manhattan project to build the nuclear bomb. Wilkins worked on X-ray crystallography of DNA with Franklin at King's College London, although their relationship was strained. He helped to verify Watson and Crick's model, and shared the 1962 Nobel with them.
—— Nature，2003
莫里斯·威尔金斯
Rosalind Franklin (1920-1958)
Franklin, trained as a chemist, was expert in deducing the structure of molecules by firing X-rays through them. Her images of DNA-disclosed without her knowledge - put Watson and Crick on the track towards the right structure. She went on to do pioneering work on the structures of viruses.
—— Nature, 2003
70年代，内森和史密斯、阿尔伯发现了限制内切酶的在分子遗传中的作用，为基因工程奠定了基础
内森
1967
1963
1953
1934
基因转移载体的发现
DNA双螺旋结构理论
遗传密码子的破译
遗传物质的明确—DNA
四大里程碑
三大技术发明
1967、1970 工具酶的发现使在体外切割和连接DNA片段成为可能
基因合成和测序（合成仪、测序仪）
PCR技术（ PCR扩增仪）
1
2
3
Sanger
1972年，美国斯坦福大学的Paul Berg博士领导的小组，首次成功完成了DNA体外重组实验，因此与W.Gilbert, F.Sanger 分享了1980年度的诺贝尔化学奖
Berg等人使用核酸内切限制酶EcoR I，在体外对猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌体的DNA分别进行酶切消化，然后再用T4 DNA连接酶将两种消化片段连接起来，结果获得了包括SV40和λDNA 的重组的杂交DNA分子
Paul Berg
２基因工程问世
1972 年 Paul Berg :
Produced first recombinant DNA using EcoRⅠ
EcoRⅠrecognition sites
λphage DNA
EcoRⅠ cuts DNA into fragments
Sticky end
SV40 DNA
The two fragments stick together by base pairing
DNA ligase
Recombinant DNA
　 1973年，斯坦福大学的S．Cohen等人也成功地进行了另一体外DNA重组实验。他们将编码有卡那霉素（kanamycin）抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒，和编码有四环素（tetracycline）抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101 DNA混合后，加入限制内切酶EcoRⅠ，对DNA进行切割，后再用T4 DNA连接酶将它们连接成重组的DNA分子。用连接后的DNA混合物转化大肠杆菌。结果发现：某些转化子菌落表现出既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗性特征
1973 - Boyer, Cohen & Chang：
Transform E. coli with recombinant plasmid
Stanley Cohen & Annie Chang
Herbert Boyer
Kanamycin resistance gene
Plasmid pSC101
Tetracycline resistance gene
E. coli transformed with recombinant plasmid
Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline
Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies
自基因工程技术问世以来，这三十多年是基因工程迅速发展的阶段。不仅发展了一系列新的基因工程操作技术,而且构建了多种供转化原核生物和动物、植物细胞载体,获得大量转基因菌株
３基因工程的迅速发展
1981年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物---转基因小鼠
1982年基因工程胰岛素商品在美国投放市场。同年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物---转基因烟草
1985年基因工程微生物杀虫剂通过美国环保署审批,1990年基因治疗开始进入临床试验
到1991年批准田间试验1467例，到1998年已有4387例
我国已获批准进入大田的转基因植物(1998年3月)
转基因植物及其特性 申请单位 获批准数
马铃薯 抗病毒 中国科学院 4
抗病 中国农业科学院 1
抗逆 北京大学 1
提高营养品质 北京大学 1
水稻 抗虫 1
抗病毒 2
抗病 中国农业科学院 中国水稻研究所 2
抗除草剂 中国水稻研究所 1
棉 抗虫 中国科学院 中国农业科学院 美国孟山都公司 9
玉米 抗虫 美国孟山都公司 3
大豆 抗除草剂 北京市农林科学院 1

小麦 抗除草剂 北京市农林科学院 1
提高营养品质 北京市农林科学院 1
番茄 抗病 北京大学 1
耐贮存 中国科学院 华中农业大学 3
甜椒 抗病 北京大学 1
辣椒 抗病毒 中国科学院 1
烟草 抗病毒 北京大学 2
抗虫 中国科学院 北京大学 2
番木瓜 抗病毒 北京热带农作物研究所 1
广霍香 抗病 农业科学院 1
矮牵牛 改变花色 北京大学 1
杨树 抗虫 中国科学院 1
我国已获批准进入大田的转基因植物(1998年3月)(续)
生命科学基础理论研究中的应用
定点诱变、表达系统、构建文库、反义核酸技术
农林牧渔中的应用
转基因抗虫棉、耐贮存番茄、耐盐碱棉花、抗除草剂作物、转基因奶牛、超级绵羊等等
工业中的应用
酿酒、食品、发酵、酶制剂等
在医学中的应用 基因治疗、基因工程药物
干扰素、白细胞介素、溶血栓剂、凝血因子、疫苗
六、基因工程的应用
抗癌抗衰老的紫色西红柿
补钙的胡萝卜
基因工程的应用举例：
例1：构建工程菌种来降解化工产物
美马里兰大学生化工程系的Coppella博士等将水解酶基因opd转化到Strepomyces livdians (注：Strepomyces链霉菌属) 转化菌株能稳定地降解硫磷，此菌株发酵液可用于对农药厂的废水处理中
例2 利用基因工程技术生产工业用酶
日本科学家将耐热的α-淀粉酶基因转入枯草杆菌后获得大量的α-淀粉酶。
啤酒酿造中，主要的发酵微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母把麦芽汁中的葡萄糖、麦芽糖、麦芽二糖等成分转变成乙醇。但是麦芽汁中还有约占碳水化合物总数约 20% 的糊精不能被酿酒酵母利用。另一种酵母叫糖化酵母 (S.diastaticus) 能分泌把糊精切开成为葡萄糖的酶，但是它产生的啤酒口味不好。用基因工程的方法，把糖化酵母中编码切开糊精的酶的 DNA 基因引入酿酒酵母中去。这样的酿酒酵母工程菌能最大限度地利用麦芽中的糖成分，使啤酒产量大为提高；并且因为残余糊精量的降低，亦提高了啤酒的质量
例4 基因工程在农业领域的应用
科学家利用基因工程培育抗寒、抗 旱、抗病和抗盐碱的抗性品种、高蛋白粮食等。如：美国研究者将从真菌中分离出毒素喷在大豆田中，有除草剂功效
Bt毒蛋白是细菌“Bacillus thuringiensis苏云金芽孢杆菌 ”产生的一种伴胞晶体，也称为“delta-endotoxin”，即 “delta 内毒素”，转Bt基因抗虫棉对3,4,5龄棉铃虫幼虫的抗性表现形式为拒食作用
例3 应用于化学与能源工业
生产乙醇 Ingram 分离出编码乙醇的基因
例5 基因工程药物
重组人干扰素α-1b (Recombinant Human Interferon α1b )
从人脐血白细胞经NAV-F病毒诱生后提mRNA，反转录成cDNA再构建质粒pBV867 ，转化到大肠杆菌N6405中表达出来的
例6 基因诊断和基因治疗
基因治疗
七、学习基因工程的意义和方法
意义：
对促进生物学发展
有利于正确对待和应用基因工程
有利于树立正确的世界观
学习方法：
掌握基础知识；培养正确的方法论
概念：基因工程
基因工程原理
基因工程技术路线
了解基因工程的发展应用
要求掌握：
再 见

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