资源简介

(共29张PPT)
第一节 植物的转基因技术
一、植物转基因技术的基本路线
1.分离目的基因
2.将目的基因与载体连接，形成重组DNA
3.利用细菌繁殖扩增重组DNA
4.将与表达载体相连的重组DNA导入到目标植物的细胞中
5.筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株
6.大规模种植
二、 转基因的受体系统
1.植物组织受体系统 受伤的组织，愈伤组织等
2.植物细胞原生质体系统
3.生殖细胞受体系统 单倍体培养作为受体；直接在生殖细胞受精时进行基因转化
4.叶绿体转化系统
优点：①便于外源基因定位整合，②基因多拷贝，表达量高，③导入的外源基因性状稳定、安全性好，④能直接表达原核基因
三 、外源基因导入植物的方法
1. DNA直接转移法
1）化学刺激法 PEG、PNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化钙等化学试剂等处理原生质体，可使其捕获外源DNA
2）电击法 在适当的外加电压下，细胞膜可能被击穿，使得外源DNA容易进入细胞内。原生质体不受伤害，而且膜孔可恢复
3）显微注射法 借助显微注射仪，将外源DNA通过机械方法直接注射到受体细胞
5）脂质体介导法 是将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。转化效率较高，简单易操作，重复性好
4）基因枪法 也称微粒轰击法
将DNA包被到金粒或钨粒上然后把这些粒子加速推进靶细胞。优点是转化受体迅速简单、取材广泛，不受基因型限制，金属微粒的喷射面广，植株可育性高，转化频率高等
6）微激光束法 利用激光微束脉冲引起细胞膜可逆穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞
7）花粉通道法 将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子或早期胚体细胞。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高
1）Ti 质粒介导的整合转化程序
Ti 质粒的结构与功能
豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌----农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti (Tumor)
2. 载体介导法
Ti 质粒的结构图谱
整个质粒 200 - 250 kb
其中 T-DNA 12 - 24 kb
tms 的编码产物负责：
合成吲哚乙酸
tmr 的编码产物负责：
合成植物分裂素
tmt 的编码产物负责：
合成氨基酸衍生物冠瘿碱
2）植物病毒介导的转染
例如：以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物
第二节
转基因植物的筛选与检测
报告基因 (reporter gene)
是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体
一、报告基因检测
1.抗生素抗性基因 npt、 aphIV、 spt、 cat、 ble
npt, 新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素、G418，巴龙霉素及新霉素等具有抗性；
aphIV, 潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素具有抗性；
spt, 链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具有抗性；
cat, 氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧失抗菌素活性。
aacc3和aacc4, 庆大霉素3-N-乙酰转移酶基因，对庆大霉素有抗性；
ble，博来霉素抗性基因，对博来霉素有抗性
注：
2.抗除草剂抗性基因
Bar，编码磷化麦黄酮乙酰转移酶（PAT），使PPT（磷化麦黄铜）的自由氨基乙酰化而对PPT解毒。抗除草剂草丁膦和双丙氨磷；
epsps，草甘膦抗性标记基因，抗草甘膦；
als，绿黄隆抗性标记基因
3.显色或发光报告基因
GUS酶活性检测 GUS是β-葡萄糖苷酶，能催化裂解一系列的葡萄糖苷，产生一系列具有发色基团或发荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学法对GUS活性进行定量和空间定位分析，检测方法简单灵敏
荧光素酶活性检测 荧光素酶催化的底物为6-羟基喹啉类似物，在镁离子、ATP及氧的作用下酶使6-羟基喹啉类似物脱羧，生成激活态的氧化荧光素，发射光子后，转变成常态的氧化荧光素
GFP即绿色荧光蛋白，可在395nm和490nm的波长下发出独特的绿色荧光
绿色荧光蛋白检测
3.显色或发光报告基因
二、 分子生物学检测方法
酶联免疫检测（ELISA）：利用抗原与抗体的特异反应，当抗原与抗体结合时，通过结合在抗体上的酶作用于特定的底物后发生显色反应，借助于比色鉴定转基因植物
PCR技术检测
分子杂交
第三节 改进转基因的技术
一、转基因植物中外源基因的沉默
位置效应
DNA甲基化
重复序列诱发基因沉默（RIGS）
共抑制
二、提高外源基因表达水平的策略
1）选择合适的转化方法
2）使用信号肽
3）选择强启动子和诱导型启动子
4）选择强终止子
5）使用增强子
6）消除甲基化的影响
7）使用植物偏爱的密码子
8）使用MAR序列（基质结合区序列）
MAR是染色质上的一段DNA序列，又称核骨架结合区（SAR）。长度一般为300-1000bp，它可以与核骨架结合，在两个MAR之间的染色质区域可连接成环，环的大小为5-200kb。每一个环为一个独立的表达结构，利用这点，将MAR序列接到基因两侧，形成MAR-gene-MAR结构，可避免附近染色质造成的位置效应
二、提高外源基因表达水平的策略
第四节 农作物基因工程
抗虫转基因作物
抗病毒作物
抗细菌和真菌作物
抗除草剂转基因作物
抗非生物胁迫作物
提高作物产量与品质
第五节 植物生物反应器
转基因植物作为生物反应器，可以生产过去只能从稀有植物乃至其他生物体才能够获得、或者收获量甚微的一些具有商业价值的物质，如细胞素，激素，单克隆抗体，营养蛋白、疫苗、酶、各种生长因子、植物次生代谢物及其他一些药物及工业部门使用的原料。
能产生脂肪酸的转基因植物
转基因植物作为生物反应器的优势如下：
植物易于生长，农田管理成本相对低廉，操作技术要求也不高
植物表达系统生产的疫苗可以直接 储存在植物种子和果实中，无需冷藏系统进行储藏运输，易于长距离运输及推广
植物具有完整的真核表达修饰系统利用转基因植物生产的重组蛋白
药物和疫苗在分子结构和生物活性上与人体来源的蛋白质相似
转基因烟草表达小鼠抗体
复习题：
转基因植物、报告基因、基因沉默、生物反应器
植物转基因技术的基本路线
导致转基因失活的原因有哪些？
基因工程在农业生产中有哪些应用？
转基因植物作为生物反应器有哪些优势？

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