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转基因动物的概念
借助基因工程技术把外源目的基因导入动物的生殖细胞、胚胎干细胞或早期胚胎，使之在受体染色体上稳定整合，并能把外源目的基因传给子代的个体，叫转基因动物（transgenic animals）
第一节 动物转基因技术
一、显微注射法制作转基因动物（以小鼠为例）
在显微镜下将体外构建的外源目的基因，用注射针注射到动物受精卵中，使之与动物基因组整合，从而得到转基因动物的方法(操作与植物受体相近)
构建目的基因的表达载体：目的基因应包含完整的ORF,顺式调控序列，加尾信号
线性DNA分子的准备
DNA浓度：1-3μg/mL
1.目的DNA的准备
超排受精卵的准备：
选择4-6周龄的小鼠，用孕马血清促性腺激素素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）先后进行腹腔注射，做超数排卵处理；注射后10-13小时超排卵，每个母鼠与一个公鼠交配。
假孕母鼠的准备：
通过注射PMSG和hCG诱导产生，再与结扎的公鼠交配
2.小鼠的准备和要求
处死经超排处理的小鼠，从输卵管膨大部位取出受精卵
解散卵丘细胞，清洗受精卵
在显微镜下确认和选择受精卵
3. 受精卵的分离
将受精卵置于培养皿或玻片的液滴内，用吸持针吸住受精卵；将外源基因注入受精卵的雄原核内
4.显微注射
将假孕小鼠麻醉，在腹部下方与最后一根肋骨平行的地方开一个小口，在输卵管壶口处用微吸管将注射过的受精卵移入，缝合伤口。按常规饲养，20天前后，后代幼鼠将产出
5.受精卵的移植
PCR
Southern blot
Northern blot
Western blot
标记性状
6.转基因小鼠的鉴定
每天可注射几百个卵，但大约只有66%能存活；移入子宫后，大约25%的受精卵能发育成幼鼠；其中又有大约25%左右的幼鼠是转基因鼠
理想情况下，30-50/1000
一般情况下， 1/1000
显微注射法的效率
顺式调控序列
MAR序列
同源重组
转座子
提高目的DNA的整合率与表达率
外源基因整合效率低
随机整合或随机插入，存在插入突变的风险
方法复杂，技术性强，设备昂贵等
压力调节仪或程控注射仪
压力调节仪或程控注射仪
7.显微注射法的不足
首只转基因猴安迪和制备它的卵母细胞
逆转录病毒的结构
二、逆转录病毒法
受体
吞噬
脱外壳
逆转录
核蛋白复合体
有丝分裂
复合体进入核
为了保证逆转录病毒载体的感染功能，建立包装细胞，在包装细胞里表达三个逆转录病毒的结构基因。所以首先让携带有外源目的基因的逆转录病毒载体感染包装细胞，在包装细胞中被包装成新的子代病毒颗粒，再去感染动物宿主细胞
Mo-MLV (莫洛尼小鼠白血病病毒)
逆转录病毒载体的构建
逆转录病毒载体可同时感染大量胚胎，也可感染稍晚阶段的不同发育时期的胚胎；高效率感染并能在宿主细胞DNA上高度整合，可以大大提高基因的转移效率。但这一高的感染率绝对依赖于细胞的两个特性：一是细胞要具有逆转录病毒的受体，二是目标细胞需要进行细胞分裂。二者缺一不可
逆转录病毒介导转基因的优势
虽然逆转录病毒载体可同时感染大量胚胎，感染效率高，并能在宿主细胞DNA上高度整合，但只可以转移小片断的小于10kb的DNA。而且存在安全隐患。如逆转录病毒在靶细胞染色体上的整合可能造成：
1）破坏细胞正常生长的必须基因/抑癌基因
2）LTR激活原癌基因
3）染色体重排激活原癌基因
逆转录病毒的安全性问题
胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞）是指从哺乳动物囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的潜能性，能够分化出各种组织
用转基因技术将外源基因转移到ES细胞中，或通过同源重组等方法使外源基因整合到ES细胞的基因组中，再把ES细胞移入胚泡期的胚胎，然后移植代孕
三、胚胎干细胞法
1989年，Lavitrano等首次利用小鼠附睾精子与外源DNA温育产生转基因小鼠，转基因效率高达30%；外源基因稳定整合到生殖细胞中，由此获得了转基因的株系；
哺乳动物精子能够吸附结合外源DNA；但不同的哺乳动物细胞精子吸附DNA的能力不同，活精子比死精子能吸附更多的DNA;
经研究发现，外源DNA主要集中在精子的头部，作用部位是精子头部的赤道段和顶体后区
四、精子载体法
与精子共育法：用含BSA的PBS对精液进行稀释，与外源DNA溶液混合温育20～40分钟；
电穿孔导入法：短时电脉冲引起细胞膜瞬时产生微孔，使外源DNA进入细胞内；
脂质体转染法
体外受精法：超排处理的卵子与吸附了DNA的精子共温育；
胞质内显微注射法：先将精子与外源DNA共孵育，然后将精子头部显微注射到处于减数分裂II期的卵母细胞质中
精子吸附外源的DNA 方法
将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞（包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等），以这些动物体细胞为核供体
通过显微操作或电融合方法使核供体与去核的原核胚细胞或去核的成熟卵母细胞核受体进行细胞重组融合，使其不经过有性繁殖过程
然后再对重组的胚胎进行胚胎移植，进而得到带有外源基因的转基因动物
五、体细胞核移植法
Dolly
克隆羊“多利”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接连不断； 1997年3月，即“多莉”诞生后1个月，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。
转基因动物效率普遍偏低，表达障碍或表达不可预见性是困扰转基因研究的一个难题。提高转基因效率的策略有：
提高定点整合率；
建立更完善的转基因方法；
选择更好的标记基因；
使用大的外源DNA片段；
选择强启动子系统促进基因表达等
第二节 提高转基因效率的策略
1.生命科学基础研究中的应用
研究基因功能
外源基因在动物体内的表达调控特征及其相应的生物学效应
基因表达的相对特异性和组织分布
例：通过导入人生长激素释放因子（hGRF）基因与金属硫蛋白启动子建立的转基因鼠，血液中呈hGRF的高表达并过度生长，但在垂体和胰脏中呈高水平表达，在下丘脑和肝脏中呈中水平表达，在心脏和性腺中呈低水平表达
第三节 转基因动物的应用
提高抗病能力：将流感病毒基因或衣壳蛋白基因转入动物体内，增强抗病力
提高动物生长速度：导入生长激素基因，生长激素释放因子基因，类胰岛素生长因子基因等，提高生长速度。
提高动物产毛性能：将细菌丝氨酸转移酶基因(SAT), D-乙酰丝氨硫化氢解酶基因（DAS）导入羊体内，将二硫化物转化为半胱氨酸,提高了角蛋白合成量,改善羊毛性能
改善乳品品质：如导入乳腺特异性表达启动子及大鼠肠乳糖酶基因，降低牛奶中乳糖含量
提高动物生存能力：提高鱼的耐受低溶氧性
2 .转基因动物在动物育种中的应用
异种器官移植：猪器官移植到人身上，要克服受体对外源器官的超急性排斥反应（HAP）的障碍，克服措施有降低或消除补体反应------将人的补体调节蛋白因子基因CD55、CD59等通过转基因方法导入器官供体动物，含有CD55基因猪心脏移植到猴体内后，猪心脏跳动了10天； 通过基因剔除来减少或改变供体器官的表面抗原，降低免疫排斥反应； 使供体器官表达人体免疫抑制因子，使该猪器官移植后在移植部位持续释放免疫抑制因子，抑制机体对移植物的免疫排斥
3. 转基因动物在医药科学研究中的应用
转基因动物模型
作为人类疾病模型、治疗人类疾病的动物模型及新药的筛选模型，如老年痴呆症动物模型的建立：将突变的淀粉样前提蛋白基因通过转基因方法导入小鼠，使其在小鼠脑部过量表达。除有学习记忆功能明显减退外，在对转基因鼠的脑皮层和海马部位进行组织切片分析时，发现大量的老年斑样结构
肝癌模型
高血压模型
I型糖尿病转基因动物模型
在人类基因数据库中,已有数千个确定的人类基因与已知的人类疾病有关。遗传学专家将在最近几年内,对大量单基因病的致病基因进行定位,并通过经典方法,对多基因缺陷而引起的多基因病进行深入的研究。通常所采用的快速基因疾病诊断方法,多集中于单基因疾病的诊断,通过对那些进化与人类相隔较远,却又与人类有一定相关性的简单模式生物体(如酿酒酵母、果蝇、线虫类、斑马鱼等) 进行分析, 将对人类疾病相关基因功能的研究起到较大的作用
模式生物：疾病模型
动物生物反应器：从转基因动物体液或血液中收获基因产物的方式。乳腺生物反应器和血液生物反应器
优点：生产成本低（1000倍），产量大（一只绵羊每年产奶300－500kg），动物乳腺可对蛋白质进行复杂而专一的翻译后加工，其过程类似于人体，可得到天然活性较高的产品。乳汁中蛋白的纯化较简单，也不污染环境
4. 动物生物反应器
迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：
利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白
转基因动物成功率低
造成宿主基因突变
外源基因表达水平不高
逆转录病毒可能从整合位点脱落，恢复病毒特性
基因污染等安全性问题
转基因动物研究存在的问题及展望
转基因动物、转基因显微注射法、ES细胞、动物生物反应器
列举动物转基因的方法
简述转基因动物的应用
复习题：

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