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吸光光度法
一 概述
吸光光度法:
基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法。
分类：根据物质所吸收光的波长范围不同，分为紫外、可见及红外分光光度法。
基本方法：
有色物质浓度 ~ 颜色深浅 ~ 吸收光程度
通过比较颜色深浅（吸收光程度），测定物质的浓度。
方法的评价
适用面广
快速、简便
分析有色、无色、浅色物
溶液状态、均质固态样品
灵敏度高：浓度下限达10-5~10-6 mol·L-1
准确度高：相对误差通常为2~5％
一 概述
用于化学平衡等的研究
适用于分析半微量和微量的物质
二 吸光光度法的基本原理
1. 可见光与颜色
阳光
棱镜
连续光谱
物质
不连续光谱
可见光区的划分 :
400 450 500 550 600 650 760
λ/nm
互补光的对应关系
光的互补：蓝 黄
二 吸光光度法的基本原理
光谱示意
表观现象示意
2. 物质对光的选择性吸收
二 吸光光度法的基本原理
物质的颜色与光的关系
复合光
完全吸收
完全透过
吸收黄色光
复合光
（3）同一物质c不同时吸收曲线不同, λmax 不变;
（4） λmax有特征性，可作为定性依据。
（1）同一物质对不同波长光的吸收程度不同;
（2）每种物质都有一个最大吸收波长(λmax);
信息：
物质对光的选择性吸收及吸收曲线
A

c1
c2
λmax
二 吸光光度法的基本原理
三. 光吸收定律
Beer - Lambert定律
Lambert 定律 :
λ, c, T一定
A∝ 光程距离 (b)
A ∝ 物质的浓度c
- dI ∝ I db
- dI = k1 I db
吸光度
二 吸光光度法的基本原理
λ, b, T一定
Beer定律 :
Beer - Lambert定律——光吸收定律
A——吸光度 Io ——入射光强度
a——吸光系数 I——透射光强度
b——光程距离 c——浓度
当一束平行单色光通过溶液时，溶液的吸光度A与溶液的c和b成正比。
A ∝ bc
当 b 一定时， A ∝ c， 可以定量
二 吸光光度法的基本原理
吸收光 ， A ， 物质浓度 。
注意 :
（1） 物质不吸光， I=Io ， A=0
物质吸收部分光， I＜Io， A＞0
（2） A具有加和性，A总=A1+A2+…… +An
（3）入射光的λ：可见光, 紫外光, 红外光
（4）光吸收定律的应用条件
稀溶液
入射光为单色光
二 . 吸光光度法的基本原理
（5）也可以用透射光强度（透射率T%）表示
T %的含义：
物质不吸收光 I=Io ， T% =100%
物质吸收部分光， I＜Io ，T%＜100%
T% ，物质的浓度 。
二 . 吸光光度法的基本原理
（6） 吸光系数的二种表示形式
浓度为1g·L-1的溶液，在某波长时，用1cm的比色皿，所测得的吸光度
浓度为1mol·L-1的溶液，在某波长时，用1cm的比色皿，所测得的吸光度
吸光系数a
摩尔吸光系数
意义
单位
L/g·cm
L/ mol ·cm
A=abc
A= bc
二 . 吸光光度法的基本原理
（1） 在数值上等于c=1 mol ·L-1、b=1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。是吸收物质在一定波长和溶剂下的特征常数。
（2）不随c和b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时， 仅与吸收物质本身的性质有关，故 可作为定性鉴定的参数。
摩尔吸收系数 的讨论
二 . 吸光光度法的基本原理
（3） 是物质的吸光能力的度量。同一吸收物质在不同波长下的 值不同。在λmax处的 max表明了吸收物质最大限度的吸光能力，反映了测定可能达到的最大灵敏度。
（4） max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。
>105：超高灵敏
= (6~10)×104：高灵敏
= 104~103：中等灵敏
< 103：不灵敏
二 . 吸光光度法的基本原理
例 ：
已知含[Fe2+]=500μg/L的溶液，当用邻二氮杂菲为显色剂测定铁时，用2cm比色皿，在波长508nm处测得吸光度A为0.19。请计算铁的摩尔吸光系数。
解：
二 . 吸光光度法的基本原理
4. 偏离Beer-Lambert定律的原因
出现的现象：
A
c
产生原因：
1） 单色光不纯
在高浓度端，
工作曲线呈弯曲状。
A与c偏离线性
现有仪器无法获得纯单色光，只能获得小
范围的复合光。
二 . 吸光光度法的基本原理
按光吸收定律:
Io
Io1
Io2
I1
I2
I
试样
若入射光包含λ1和λ2二种波长光, 当照射试样后
二 . 吸光光度法的基本原理
讨论 :
当为纯单色光时，
A总= ελ1bc
当单色光不纯时，
λ1=λ2
ελ1= ελ2
A总∝ c
线性破坏
结论：
单色光纯度越差，线性越差
λ1=λ2
ελ1= ελ2
二 . 吸光光度法的基本原理
2
1
A1
A2
例 1= 2 但 A1 》 A2 0
减少单色光不纯引起偏差方法
——— 在 max处测量
在 max 处
单色光不纯
但 ε2=0
测量误差较小
二 . 吸光光度法的基本原理
2）溶液本身引起的偏差
（1）若溶液浓度大于0.01mol·L-1时，粒子间的相互作用
（2）溶液以胶体、乳浊、悬浮状态存在时，有反射、散射作用
二 . 吸光光度法的基本原理
例 :
(橙色)
(黄色)
λmax=450nm
A总
包括离解、缔合、生成新物质、形成异构体
使原物质浓度改变
吸光度值变化
产生偏离
pH ， 平衡 移,
（3）溶液内部的化学变化
二 . 吸光光度法的基本原理
分光光度法 :
仪器—分光光度计
基本组成：
光源
单色器
样品室
显示器
检测器
三. 仪器和方法
＊ 光源 (钨灯、氢灯、氘灯）
能发射紫外光区或可见光谱区的连续光谱；
足够的辐射强度、稳定性较好、使用寿命较长
基本要求 :
常用的光源 :
可见光区: 钨灯 (辐射波长为320nm~2500nm)
紫外区: 氢灯、氘灯(辐射波长为185nm~400nm)
三. 仪器和方法
＊ 单色器
作用 :
将光源发射的复合光分解成单色光的光学系统
（棱镜或光栅）
三. 仪器和方法
组成 :
棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜等
棱镜分光
三. 仪器和方法
入射狭缝：光源的光由此进入单色器
准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束
聚焦装置：将分光后的单色光聚焦至出口狭缝
（透镜或凹面镜）
色散元件：将复合光分解成单色光
光栅分光原理
三. 仪器和方法
利用不同波长入射光产生干涉条纹的衍射角不同而将复合光分成单色光。
＊ 样品室
用于放置各种类型的吸收池(比色皿)和相应的池架附件
三. 仪器和方法
比色皿厚度:
0.5, 1, 2, 3, …cm
比色皿:
石英池和玻璃池
＊ 检测器
作用:通过光电效应，使透过吸收池的光信号变成可测的电信号的装置。
（光电管或光电倍增管）
三. 仪器和方法
要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。
(1)光电管
(2)光电二极管阵列
(1)光电管
三. 仪器和方法
涂光敏材料
光照
光敏材料
产生电子
产生电流
电压
光强度大
电流大
(2)光电二极管阵列
三. 仪器和方法
电容器
充电
电容器
放电
光照射
再次充电
测量周期
电容器充电的电量 每个二极管检测到的光子数目成正比 光子数与光强度成正比。通过测量整个波长范围内光强的变化就可得到吸收光谱。
＊显示器
由检流计、数字显示、微机组
成的自动控制和结果处理系统
三. 仪器和方法
四、显色反应和显色条件的选择
1.显色剂作用
2. 显色反应的选择
3. 影响显色反应的因素
4. 显色剂的分类
1.作用
无色或浅色
试样
有色物
+显色剂
比色
显色反应
配合反应
氧化还原反应
缩合反应
重氮化—偶氮化反应
四、显色反应和显色条件的选择
2.显色反应的选择
灵敏度高 =104－105
(2) 选择性好
(3) 有色物组成恒定，化学性质稳定
(4) 显色剂在测定波长处无明显吸收
对比度=λmax有色物 -λmax显色剂＞60nm
四、显色反应和显色条件的选择
3.影响显色反应的因素
(1) 显色剂用量
根据吸光度A与显色剂浓度cR的关系来确定
cR选择——引起A变化最小处的cR（即曲线平坦处）
M + R MR
四、显色反应和显色条件的选择
例：
Fe(ssal)+ 紫红色
pH=1.8~2.5
pH=4~8
Fe(ssal)-2 橙红色
pH=8~11.5
Fe(ssal) 3 3- 黄色
显色时间和温度
由实验得出
溶剂
一般选择水作溶剂
(2) 显色溶液的pH值
测定不同pH值下，显色溶液的吸光度A，以A为纵坐标，pH为横坐标，制图。
选择曲线平坦处pH
四、显色反应和显色条件的选择
(3) 共存离子的干扰
可能存在的几种情况：
本身有颜色
与显色剂反应生成有色物
消除的方法：
* 加掩蔽剂
（掩蔽剂不与被测离子反应，本身及反应产物不影响测定）
* 选择合适的显色反应条件
* 分离干扰离子
与显色剂
与被测物
生成更稳定的有色物
共存离子
四、显色反应和显色条件的选择
显色剂的种类 :
无机显色剂
过氧化氢
钼酸铵
硫氰酸盐等
有机显色剂
生色基团：偶氮基、硫羰基、亚硝基等
助色基团：含胺基、羟基等
四、显色反应和显色条件的选择
1. 入射光波长的选择
2. 参比溶液的选择
3. 读数范围的选择
五. 测量条件的选择
1. 入射光波长的选择 :
一般选择最大吸收波长λmax
若有干扰按实际情况而定
波长选择适当，可提高灵敏度和准确性
原则： 吸收最大，干扰最小
五. 测量条件的选择
2.参比溶液的选择
（在测定波长处）
溶剂空白
试样空白
试剂空白
试样+掩蔽剂
+显色剂
无色
无色
无色
有色
无色
无色
无色
略有
略有
试样
显色剂
其他试剂
参比溶液
有色
有色
其他组
分有色
五. 测量条件的选择
选择的原则
选择的意义：扣除非待测组分的吸收，可获得被测定溶液真实的吸光度。
3. 读数范围的选择
选择的原因 :
因为吸光度（透光度）刻度时的误差
（A的标尺是对数标尺，刻度不均匀）。
÷（εbc）
浓度相对误差
透光度读数绝对误差
五. 测量条件的选择
结论 ：
T%=10%~70%
（A=1.0~0.15）
不同透光度的相对误差（ ΔT=1％）
T% T% T%
95 20.8 60 3.3 20 3.2
90 10.7 50 2.9 10 4.3
80 5.6 40 2.7 5 6.7
70 4.0 30 2.8 1 22.0
∴透光度T（A）的读数范围为：
ΔT=1％
由读数引起的浓度相对误差最小
Tmin= 36.8%
Amin=0.434
T与浓度读数误差的关系曲线 ：
36.8%
五. 测量条件的选择
1. 单组分含量测定
3. 高含量的组分测定—示差法
六. 具体应用
2. 多组分含量测定
1、单组分含量的测定
A
c/mol·L-1
Ax
cx
步骤:
注意 :
标准溶液和样品的配制方法，工作曲线的制作和样品测定时，所使用的仪器、条件必须一致。
c1
λ
A
λ测量
六. 具体应用
1）选择显色反应
2）选择显色剂
3）优化显色反应条件
4）选择检测波长
5）选择合适的浓度
6）选择参比溶液
7）建立标准曲线
8）样品测定
吸收曲线
标准曲线
2、 多组分含量的测定
多组分样品的吸收曲线有三种情况
I. 各组分吸收曲线的λmax互不干扰
在各自的λmax处,按单组分的测定方法进行测定
Aλ1=ελ1 b ca
Aλ2=ελ2 b cb
六. 具体应用
II. a组分的λ1处，b组分无干扰，但 b组 分的测量λ2处，a组分有吸收
Aλ1=ελ1bca
Aλ2= ελ2bca+ελ2bcb
III. 各组分吸收曲线的λmax互有干扰
Aλ1=ελ1bca +ελ1bcb
Aλ2=ελ2bca +ελ2bcb
六. 具体应用

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