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PCR
小专题梳理
利用PCR获取和扩增目的基因
①原理：DNA复制（DNA半保留复制）。
②条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
③扩增过程
{69C7853C-536D-4A76-A0AE-DD22124D55A5} 过程
说明
图解

高温变性
温度超过90 ℃，双链DNA解聚为单链

低温复性
温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

中温延伸
温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链

模板、原料、能量、酶、1对引物
PCR
易错提醒
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成　　　　　的原料，又可为DNA的合成提供　　。
(2)引物既可以是DNA单链，也可以为　　　　　。细胞内的DNA进行复制时，也需要　　，一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　　　激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加　　　。
DNA子链
能量
RNA单链
引物
Mg2＋
Mg2＋
PCR技术和DNA复制的比较
关于引物
一、引物是什么?
引物是一小段单链的核酸,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3’端;可以是DNA也可以是RNA（依据目的基因两端序列，设计出的2种特异性的引物）
二、为什么要设计（加入）引物？
DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。
三、引物的作用？
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
1.引物的长度一般在15~30bp，否则会影响扩增的特异性。
太短则特异性不够强；太长则退火温度会比较高。（C-G）
2.设计两种引物时,二者之间的碱基序列不能互补配对。
两条引物之间不能有连续4个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链而得不到目的基因片段。
3.一条引物自身不能有较多自身互补序列（或反向重复序列）。
如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地阻止引物和模板之间的退火。
4.引物设计应具有特异性（针对核酸系列保守区内设计）
有必要在DNA数据库中进行检测，以确保引物中的序列只在所扩增的基因中出现，而与其他基因不具有互补性，避免产生过多非特异性片段
5.引物中GC含量以40%~60%为宜，太少扩增效果不佳；过多则易出现非特异性条带。4种碱基最好随机分布。
6.两条引物的退火温度相差不能大于5℃。如果相差太大，操作时一般选择较低的那个退火温度，那么另一条引物的非特异性结合就会增加。
四、引物设计的原则？
尽管有很多因素可影响PCR扩增反应的效率与特异性但最关键的因素是引物的设计。
引物设计的首要目标是其特异性，只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列退火（复性）形成稳定的结构时才能达到这个目的。
1、为了便于将扩增的DNA片段与运载体连接,可如何操作？
在引物的5’端 加上限制酶识别序列
2、在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列,主要目的是？
使目的基因定向（正确）插入载体并避免目的基因自身环化
3、为保证模板链与引物结合的效率，怎么做？
两种引物之间尽量避免存在互补序列
4、引物的3‘端和5‘端哪个能改造？
引物的3‘端为结合模板DNA的关键碱基,一般不能改造，5'端无严格限制,可用于添加限制酶切割位点等序列
五、关于引物的一些利用
一次成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段。若出现与预期不一致的结果，可尝试从以下几个方面进行分析：模板DNA的制备、引物的质量与特异性、酶的质量以及PCR循环的条件。
（1）未出现扩增条带可能的原因有：模板DNA含有杂蛋白或Tag DNA聚合酶的抑制剂（如蛋白酶K、苯酚、EDTA）；Tag DNA聚合酶失活；引物出现质量问题，浓度不合适；Mg2*浓度过低；变性温度低，变性时间短；目的序列变异；等等。
（2）出现非特异性扩增条带可能的原因有：模板DNA出现污染；Iag DNA聚合酶出现质量问题；引物特异性不强（如与非目的序列有同源性）或形成引物二聚体；Mg*浓度过高；退火温度（复性时的温度）过低；PCR循环次数过多；等等。
关于PCR
一、PCR
二、RT-PCR
三、荧光定量PCR
四、重叠延申PCR
五、巢式PCR
...
实现定点诱变、鉴定......
一、PCR
易错提醒
PCR扩增过程中的循环图示与规律
PCR技术（三轮得到目的基因）
一、PCR——定点诱变技术
4. 通过引物设计，运用PCR技术可以实现目的基因的
定点诱变，如图为基因工程中获取突变基因的过程，
其中引物1序列中含有一个碱基 T 不能与目的基因片段
配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中
引物1和引物2分别设计增加限制酶 a 和限制酶 b 的识别
位点。有关叙述正确的是( )
?
A.限制酶 a 和限制酶 b 的识别位点分别加在引物1和引物2的 3′ 端
B.PCR反应体系中需要加入4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、ATP
C.第2轮PCR中，引物1所在的①与图中②结合并形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占 1/4
?
D
一、PCR——定点诱变技术
二、RT-PCR / 三、荧光定量PCR
二、RT-PCR / 三、荧光定量PCR
四、重叠延申PCR
引物a、b
引物c、d
? [2021·江苏连云港模拟] 常用的PCR技术有实时荧光定量PCR、RT-PCR、重叠延伸PCR等,其中重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,
从而获得目的基因的方法。该技术在扩增
较长片段的DNA、不同来源的DNA片段
拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的
应用前景。利用重叠延伸PCR技术进行
定点突变可以实现对纤维素酶基因进行
合理改造,其过程如图所示。回答下列问题:
重叠延伸PCR技术
(2)在第一阶段为获得产物AB和产物CD,必须将引物a、b和引物c、d置于不同反应系统中,这是因为
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
引物b和引物c对应的碱基之间多数可以配对,在一个反应系统中配对后失效
命题角度例析
[解析]引物是一段DNA,引物b和引物c对应的碱基之间多数可以配对,在一个反应系统中配对后失效。
(3)新冠肺炎病毒常用“荧光RT-PCR技术”进行检测。
①“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。?
逆(反)转录酶、热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)
命题角度例析
[解析]新冠肺炎病毒是RNA病毒,因此在进行RT-PCR时,需要先进行逆转录合成DNA,然后再进行PCR,因此需要逆转录酶,RT-PCR过程中除原料、模板、能量外,还需要Taq酶以合成子链DNA。
②用　　　　　　　向微量离心管中依次加入各组分,进行　　　　,使反应液集中在微量离心管底部,将微量离心管放入PCR仪设计好PCR仪的循环程序,进行PCR反应。?
命题角度例析
用微量移液器
离心
[解析]向微量离心管中加入成分时需要用微量移液器;加入微量离心管后使反应液集中到微量离心管底部的方法是离心。
(4)在检测过程中,随着PCR的进行,反应产物不断累积,
“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加。可通过
荧光强度的变化监测产物量的变化从而得到一条
荧光扩增曲线图。
①“平台期”出现的最可能的原因是_____________________________________
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。?
试剂盒中的原料、引物和探针数量一定,超出一定的循环数后,荧光标记的“杂交双链”不再增加
命题角度例析
[解析]平台期是由于随着循环次数增加,试剂盒中的原料、引物和探针被消耗完,超出一定的循环数后,荧光标记的“杂交双链”不再增加。
②理论上,在检测过程中有荧光标记的“杂交双链”出现,
则说明检测结果呈　　　(填“阴”或“阳”)性,但为了保
证检测结果的准确性,一般要达到或超过阈值时才确诊。
现有两个待检样本,检测时都出现了上述形态的曲线,但
甲的a点比乙的a点明显左移。请给这种结果做出科学合理的解释(试剂盒合格且正常,操作过程规范且准确):
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。?
阳
命题角度例析
甲样本中的新冠肺炎病毒含量更高,达到阈值所需的循环数更少
[解析] 检测过程中有杂交双链,说明样本中有与病毒核酸相同的核酸序列,因此结果为阳性;两个样本中,甲的a点是阈值对应的点,甲的a点比乙的a点明显左移即需要的循环数少,说明甲样本中的新冠肺炎病毒含量更高,达到阈值所需的循环数更少。
8.[2021·江苏南通模拟] 家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。巢式PCR扩增反应在两次PCR反应中使用两组不同引物，先使用外引物对目标区域DNA片段进行第一次PCR扩增，产生中间产物，然后使用内引物对中间产物进行第二次PCR扩增，产生目标产物。图是巢式PCR工作原理示意图，请回答：
五、巢式PCR
(1) 巢式PCR反应体系中需要加入模板、_________________、________、引物、 Mg2+ 、缓冲液等。
?
TaqDNA 聚合酶
?
dNTP
?
注意： PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，
模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火复性、引物的延伸
PCR反应体系包括5种基本成分：
引物、DNA聚合酶、 dNTP (原料)、模板DNA、 Mg2+
?
五、巢式PCR
(2) 相比于常规PCR获得的产物而言，巢式PCR获得的产物特异性_______，原因是如果利用外引物扩增产生了错误片段，再利用内引物扩增时，在错误片段上进行引物配对并扩增的概率_______。
更强
极低
五、巢式PCR
(3) 巢式PCR通常在一个试管中进行第一阶段反应，然后将中间产物转移到第二个试管中进行第二阶段反应，不在同一试管内完成整个过程的主要原因是_________________________________________________。
防止引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染
注意：巢式PCR两次扩增所用的引物是不同的，因此两个阶段的反应不在同一试管内完成的主要原因是防止引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。
五、巢式PCR
关于PCR-电泳
还是要从电泳后于的
胶中分离的......
胶纯化
是用来在琼脂糖凝胶中回收电泳分离的DNA片段的标准步骤。将胶溶解后，让它通过一种特殊的滤膜，这一步骤使得DNA与其他杂质，如盐，游离核苷酸，酶等分离开，从而可以进行下游的应用操作。
原理
从琼脂糖凝胶中回收DNA的基本原理涉及到一系列的结合，清洗和洗脱步骤。当胶完全溶解在溶解缓冲液中后，上样到一个“离心柱”上，它通过离心可使DNA分子特异性的结合到硅胶膜上，而其他的杂质则通过柱子到了收集管。由于凝胶溶解缓冲液中的高盐浓度，使得DNA可以结合到硅胶上。该缓冲液会破坏膜周围的水合结构，在强阴性的膜和阴性的DNA之间建立一个阳离子盐桥。剩余的杂质则被乙醇清洗去掉。水或低盐缓冲液加到柱子上，被认为会打断阳离子盐桥而将DNA洗脱下来。这样DNA就从胶中被纯化出来。

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