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(共83张PPT)
重组DNA技术的基本工具
基因工程
一、DNA基本结构
磷酸
脱氧核糖
含氮碱基
A(腺嘌呤)
G(鸟嘌呤)
C(胞嘧啶 )
T(胸腺嘧啶)
1’
2’
3’
4’
含Ｎ碱基
脱氧
核糖
磷酸
5’
模型建构1:
组成DNA的基本单位是脱氧核苷酸，其化学组成包括磷酸、碱基和脱氧核糖
二、DNA双螺旋结构的主要特点
G
A
G
G
C
C
C
T
A
T
C
C
T
G
G
A
G
O
CH2
OH
H
碱基
3′
2′
H
H
1′
4′
5′
H
H
磷酸基团
5'
3'
5'
3'
DNA的一条单链具有两个末端，一端有一个游离的磷酸基团，称作5'－端，另一端有一个羟基(—OH)，称作3'－端，两条单链走向相反，一条单链从5′－端到3'－端，另一条单链从3'－端到5'－端。
DNA的两条单链按反向平行方式盘旋成双螺旋结构。
DNA中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在内侧。
两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对：A与T配对(3个)；G与C配对（2个）。
三、对基因工程概念的理解
概念：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
1.操作环境：体外
2.操作水平：DNA分子水平 操作对象：基因
3.目的：产生符合人们需要的新的生物类型和生物产品
4.原理：基因重组
5.其他名称：重组DNA技术、 转基因技术
6.基因工程最大的优势：定向改造生物的遗传性状
结合必修二思考：
①基因重组只发生在有性生殖过程中吗？
②基因拼接的原理：
③目的基因在受体细胞中表达的原理：
①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸②DNA分子都遵循碱基互补配对原则
③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码（相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质）。
肺炎双球菌的转化、基因工程
肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
DNA双螺旋结构模型，DNA的半保留复制，中心法则，
遗传密码破译
体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
DNA序列分析
DNA合成仪
农杆菌转化法
发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
细菌质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。
高通量测序技术
基因组编辑技术，实现对特定基因的定点插入、敲除或替换
四、基础理论和技术的发展催生了基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
1.工具：限制酶、DNA连接酶、载体
2.工具酶：限制酶、DNA连接酶
一、分子手术刀——限制酶（限制性内切核酸酶）
1.主要来源：原核生物
a.限制酶在原核生物中的作用是什么？
b.限制酶不破坏自身DNA的原因是什么？
2.作用特点（特异性）：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，
并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
3.识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
4.作用的化学键：磷酸二酯键
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。
所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者DNA分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开
①无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，这就是回文序列。
②能被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
思考
仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？
EcoRⅠ
……G-A-A-T-T-C……
……C-T-T-A-A-G……
HindⅢ
……A-A-G-C-T-T……
……T-T-C-G-A-A……
BamHⅠ
……G-G-A-T-C-C……
……C-C-T-A-G-G……
TaqⅠ
………T-C-G-A………
………A-G-C-T………
呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
6.限制酶所识别的序列的特点：
5.结果：产生黏性末端或平末端
当限制酶在它识别序列的___________将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是__________；
当限制酶在它识别序列的_________切开时，产生的是______；
中轴线两侧
黏性末端
中轴线处
平末端
实例1—EcoRⅠ限制酶：
识别序列为GAATTC，
切割部位为GA之间的磷酸二酯键。
形成黏性末端
黏性末端
黏性末端
实例2——SmaⅠ限制酶：
识别序列为CCCGGG
切割部位为CG之间的磷酸二酯键。
形成平末端
平末端
课堂练习：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ____ EcoRⅠ___
HindⅢ___ BglⅡ ___
GATC
AATT
AGCT
GATC
限制酶切割目的基因片段时需要切割几次？ 产生几个末端？
断开几个磷酸二酯键？ 共产生几个游离的磷酸基团？
2 4 4 4
思考：
1.用同一种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？
目的基因—目的基因、目的基因自身环化、质粒—质粒、质粒自身环化、
目的基因—质粒、目的基因—质粒反向连接
拓展1
思考：
1.获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了产生相同的黏性末端，便于连接
2.用同一种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？
3.用两种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？
目的基因—目的基因、目的基因自身环化、质粒—质粒、质粒自身环化、
目的基因—质粒、目的基因—质粒反向连接
目的基因—目的基因、质粒—质粒、目的基因—质粒
用不同的限制酶切割：可以防止目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒反向连接（或保证目的基因和质粒正确连接）
拓展1
质粒
拓展2
3.同尾酶切割形成的末端通过DNA连接酶连接后，该序列还能再被原来的酶识别和切割吗？
同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断;这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
1.不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端——同尾酶
2.同尾酶在基因工程操作中有什么意义？
二、分子缝合针—DNA连接酶
1.作用：
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
E.coliDNA连接酶：来源于大肠杆菌； 只能连接具有互补黏性末端的DNA片段
T4DNA连接酶： 来源于T4噬菌体； 既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链
DNA片段的平末端（但连接平末端的效率较低）
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不同点 作用对象
作用结果
模板
相同点
催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键
催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子
催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
需要
不需要
①化学本质都是蛋白质②都是催化形成磷酸二酯键
DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较
2.分类：
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点
大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
恢复的都是磷酸二酯键
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA水解酶
解旋酶
RNA聚合酶
与DNA分子相关的几种酶的比较
磷酸二酯键
DNA
形成具有黏性末端或平末端的DNA片段
磷酸二酯键
DNA片段
形成重组DNA分子
磷酸二酯键
脱氧核苷酸
以单链DNA为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端，形成子代DNA
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
碱基对之间的氢键
DNA
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
磷酸二酯键
核糖核苷酸
以单链DNA为模板，将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端，形成单链RNA
课堂归纳
根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
学以致用
1.载体的种类： 质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
载体的作用：①作为运载工具、将目的基因导入受体细胞中
②在受体细胞中对目的基因进行大量复制
三、分子运输车——载体
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
2.质粒
（1）结构：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的的双链环状DNA分子
（2）作为载体必须具备的条件：
①能在受体细胞中复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选
④对受体细胞无害，大小合适、方便操作。
（3）真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。
抗生素抗性基因：氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因
将外源基因送入受体细胞
拓展3—标记基因的筛选
目的基因—目的基因 目的基因自身环化
质粒—质粒 质粒自身环化
目的基因—质粒 目的基因—质粒反向连接
思考：仅仅用标记基因来鉴定受体细胞中是否含有目的基因，一定可靠吗？
选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来
1.在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应选择的限制酶为______
2.在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应选择的限制酶为______
①或②
①
注意：酶③也会切割酶②识别的序列，因此不能选择酶③
学以致用
下列操作中选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子最好？
（注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因）
HindⅢ和PstⅠ
EcoRI
EcoRI
四、实验——DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
1.DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，溶于2mol/L的NaCl溶液
3.鉴定原理：DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
二、过程：
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
动物细胞（鸡血细胞）/植物细胞 哺乳动物成熟的红细胞？
加体积相等、预冷酒精（体积分数95%）静置，得白色丝状物
提取方案：
①用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水
②离心将沉淀物晾干
方案：
①4℃冰箱静置后取上清液
②离心后取上清液
2mol/L的NaCl溶液，
2只试管
二苯胺
沸水浴加热
蓝色
动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，吸水胀破后，过滤收集滤液即可。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
研磨液：
洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；
食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
①低温放置几分钟的作用？
②搅拌时应轻缓、并沿一个方向的原因？
①抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
②减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
0
DNA溶解度
NaCl浓度
0.14mol/L
2mol/L
六、实验梳理
本实验中有三次过滤:
第一次过滤获得DNA的滤液
第二次过获得DNA粘稠物
第三次过滤获得DNA的滤液
本实验两次析出DNA：
第一次：用0.14 mol/L的NaCI溶液析出DNA，目的是除去溶液中的杂质。
第二次：用冷却的95％的酒精，获得含杂质较少的DNA丝状物
结果分析与评价
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
4.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开
进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质
（4）去除DNA中混有的蛋白质的方法？
盐析法、溶解法、酶解法、高温变性
基因工程的基本操作程序
基因工程
基因工程的基本操作程序
4.为什么要有“目的基因的检测与鉴定”？
用于改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因，主要是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子
构建的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
含目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化
目的基因是否能够在受体细胞中稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道
1.为什么要有“目的基因的筛选与获取”？
2.为什么要有“基因表达载体的构建”？
3.为什么要有“将目的基因导入受体细胞”？
第一步——目的基因的筛选与获取
1.筛选目的基因的方法
2.获取目的基因的方法
构建基因文库的方法：直接分离法构建基因组文库、逆转录法构建cDNA文库
如用DNA合成仪，用化学方法合成
条件：基因较小，序列已知
（一）基因文库的构建
基因文库的构建
原核基因的结构
基因的结构
真核基因的结构
基因：有遗传效应的DNA片段
编码：转录/翻译
原核生物：缺少启动子、终止子 真核生物：缺少启动子、终止子、内含子
原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器,无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工(原核细胞缺乏加工修饰蛋白质的酶)
使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
思考：
1.若由mRNA逆转录到基因，那新形成的基因与原基因的结构相比有哪些不同？
2.某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是什么？
3.以上情况如何解决？
4.人的胰岛素基因在原核细胞中表达后，获得的胰岛素无活性，原因是什么？
5.以上情况如何解决？
人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
相似名词比较
比较项目 位置 功能
启动子 （其上有一个重要的位点：RNA聚合酶结合位点）
起始密码子
终止子
终止密码子
DNA
mRNA
DNA
mRNA
终止翻译
驱动翻译
终止转录
驱动转录
⑴解旋：
在ATP的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开。
⑵以母链为模板进行碱基配对：
游离的脱氧核苷酸按碱基互补配对原则随机地与两条母链的碱基配对，确定子链的脱氧核苷酸排列顺序。
⑶合成子链：
在DNA聚合酶的催化下从子链的5'端把子链的脱氧核苷酸聚合成脱氧核苷酸链。
⑷形成子代DNA分子：
每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。
重新螺旋
形成磷酸二酯键
断开氢键
形成氢键
1.名称：聚合酶链式反应 2.原理：DNA半保留复制 3.仪器：PCR扩增仪（P84）
4.条件：
①模板：DNA母链
②原料：4种脱氧核苷酸【实际上是4种dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）】
③酶：耐高温的DNA聚合酶（P16筛选；P84 TaqDNA聚合酶）
④引物：与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，通常为20-30个核苷酸，需2种引物。
⑤整个过程：需要在PCR缓冲液（含Mg2+）中进行-维持pH，保护TaqDNA聚合酶真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2+激活。
重点分析——利用PCR获取和扩增目的基因
ATP——腺苷三磷酸
dATP——脱氧腺苷三磷酸
关于dNTP的思考：
1.ATP与RNA的关系？
2.PCR扩增中，加入dNTP的作用是什么？
ATP去掉两个磷酸基团后是腺嘌呤核糖核苷酸
为DNA的合成提供原料和能量
5.过程：
①变性：温度上升到至90℃以上时，双链DNA解聚为单链
②复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
③延伸：温度上升到72℃左右时，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则加到引物的3’端，合成新的DNA链。
PCR技术和DNA复制的比较
思考：通过PCR技术扩增目的基因，与体内DNA复制相比，主要优点是什么？
不需解旋酶、可在短时间内大量扩增目的基因（高效快速）、易于操作
1.引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链(引物的5′端与模板链3′端互补配对)
2.需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此DNA的复制需要引物
3.设计两种引物的原因：基因的两条反向平行链都做模板，其碱基序列不同，且DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
4.需要大量引物的原因：子链是在引物的引导下合成的，引物随子链DNA数量的增多而被消耗
计算：若一个DNA扩增4次，至少需要几个引物？
5.PCR扩增的产物的特异性：由引物的特异性决定；引物是根据目的基因两端的核苷酸序列设计的
7.复制方向:是沿子链5’→3’，从引物的3’端延伸子链
9.在引物的5’端设计两种限制酶识别序列的原因：便于目的基因和载体的定向正确连接
10.设计引物时，引物自身不能有碱基互补配对的序列：避免引物自连，不能得到目的产物（见下图发夹结构）
11.设计引物时，两引物之间不能有碱基互补配对的序列：防止两引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率（见下图引物二聚体）
12.引物设计不能太短：防止引物随机结合，从而获得非目的基因的
13.变性温度过低会导致双链不能充分解开；
14.如果引物中GC含量较高，可适当提高复性温度
15.复性温度过高，得不到产物的原因：引物不能稳定的与模板结合（引物与模板结合的稳定性遭到破坏）导致目标产物的量减少；复性温度过低：非特异性强
16.延伸时间的设定与扩增片段的长度有关
17.PCR后期，反应速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP浓度降低、反应产物增多
引物、温度、时间拓展
P85预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
1.不能出现扩增产物：
（1）引物自身有碱基互补配对的序列，导致引物自连
（2）复性温度过高，引物不能稳定的与模板结合
（3）变性温度过低会导致双链不能充分解开、变性时间过短；
（4）热稳定DNA聚合酶的活性降低（或失活）
（5）Mg2+浓度过低
（6）模板DNA含有杂蛋白（抑制耐高温的DNA聚合酶活性的杂蛋白）
2.出现非目的序列产物：
（1）引物设计太短（或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性）
（2）两引物之间碱基互补配对（形成引物二聚体）
（3）复性温度过低
异常分析
在两种引物的5’端加上不同的限制酶识别序列→通过PCR，在目的基因两端加上不同限制酶的识别序列→目的：保证能用两种限制酶切割目的基因两端，从而保证目的基因与载体的正向拼接。
如果需要在引物上加限制酶的识别序列：需要在引物的5’加
1.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。以下叙述错误的是
A．利用了DNA半保留复制的原理，每一次循环后目的基因的量增加一倍。变性过程中断裂的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．退火时引物A必须与引物B碱基互补配对
C．由原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物A或引物B
D．利用该技术扩增人的某DNA片段时，可以提取人的某种特定DNA聚合酶作为催化剂
PCR技术——例题1
BD
2.某科研小组采用转基因技术将猪生长激素基因导入大肠杆菌，大量获取猪生长激素。回答下列问题：
（1) 从猪垂体中提取出猪生长激素相关mRNA,通过逆转录酶的作用获取 用于PCR扩增，扩增时同时需要设计___种引物，原因是 。在构建猪的cDNA文库时，需要将反转录产生的多种cDNA片段 (填处理）后储存在一个受体菌群中。
（2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是_____ ；PCR技术中利用 （填条件）对猪生长激素基因进行解旋。
（3）目前在PCR反应中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是___________________。
（1）cDNA 两 DNA是两条反向平行的双链结构，DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增 与载体连接
（2）解旋酶 高温或90℃以上的温度
（3）TaqDNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
PCR技术——例题2
例1：为方便构建重组质粒，设计引物时需要增加适当的___位点．设计引物时需要避免引物之间形成___，而造成引物自连．
例2：为便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的___端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是___。
5， 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连
PCR技术——例题
设计扩增目的基因的引物时,需要考虑表达载体的序列
限制酶 碱基互补配对
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理；
DNA半保留复制
2.DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
*因此，离加样孔远的DNA片段____，近的DNA片段____
小
大
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
凝胶电泳原理示意图
一般使用的缓冲液的pH=8，在其中的DNA分子带负电，向正极泳动
二、材料用具
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一次性
吸液枪头
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。(离心管)
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
二、材料用具
DNA片段的扩增及电泳鉴定
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合
三、方法步骤
DNA片段的扩增
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR技术
移液
离心
扩增
DNA片段的电泳鉴定
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
三、方法步骤
DNA片段的扩增及电泳鉴定
配制
琼脂糖溶液
制备
琼脂糖凝胶
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
DNA片段的电泳鉴定
三、方法步骤
DNA片段的扩增及电泳鉴定
加样
电泳
观察
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
特别注意
DNA片段的扩增及电泳鉴定
四、结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
第二步——基因表达载体的构建（核心）
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成：目的基因 ＋ 启动子 ＋ 终止子 ＋ 标记基因 + 复制原点
（1）目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因
（2）标记基因：用于重组DNA分子的筛选
（3）启动子：①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段 ②位置：基因的上游，紧挨转录的起始位点
③作用：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
什么是诱导型启动子？（诱导型启动子----激活或抑制基因的表达）
（4）终止子：①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段 ②位置：位于基因的下游
③作用：转录终止的信号
（5）复制原点：DNA复制开始的地方
3.构建过程：需要限制酶和DNA连接酶的参与 P80倒数第二段(3条)+图
注意：1.载体与基因表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。基因表达载体在载体基础上增加了启动子、目的基因、终止子
2.目的基因不能单独进入受体细胞，必须以表达载体的方式携带进去。
选择限制酶的原则：
①选目的基因两端和载体都有限制酶的切割位点；可用同种限制酶或者产生相同末端的限制酶（同尾酶），同时切割载体和含有目的基因的DNA片段，
②所选酶切位点不能破坏目的基因、标记基因（至少有一个完整）、复制原点、启动子、终止子
③为避免目的基因和质粒的自身环化及目的基因与质粒的反向连接，可使用两种切割后能产生不同黏性末端的限制酶来切割目的基因和质粒，确保目的基因和质粒正向连接。目的基因应插入启动子和终止子之间。
思考1——构建基因表达载体前的限制酶选择问题
思考：
限制酶1识别GGATCC序列，切点在G与G之间
限制酶2识别CCGG序列，切点在C与G之间
若要构建基因表达载体，你会选择哪种限制酶？
限制酶1
若选酶2，会使目的基因插入到启动子的上游，导致目的基因无法转录
若同时选择酶1和酶2两种酶，会导致基因表达载体没有启动子，使目的基因不能表达
再思考：
1.构建基本表达载体时，若目的基因插入到启动子的上游，则转基因动物无法产生相应的外源蛋白，原因是？
2.经检测,抗旱基因已经导入到烟草细胞,但未检测出抗旱基因转录出的mRNA,从构建基因表达载体的角度推测,最可能的原因是？
1.目的基因不能转录
2.基因表达载体上目的基因首端未加入启动子
思考2—构建基因表达载体后的筛选问题（为何要筛选？如何筛选？结果如何？）
质粒和目的基因用酶1切割，加入DNA连接酶连接，用得到的混合物转化大肠杆菌,
大肠杆菌有的未被转化：即大肠杆菌中没有进入DNA
有的被转化：分别是含有环状目的基因、含有质粒、含有重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
①若用含有抗生素B的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，
未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________；
__________和___________的细胞也是不能区分的，其原因是_____________。
②若用含有抗生素A的培养基进行筛选， 的细胞在抗生素A的培养基上能存活
①二者均不含抗生素B抗性基因，在该培养基上都不能生长
含有质粒 含有重组质粒
二者都含抗生素B抗性基因，在该培养基上均能生长
②含有质粒
第三步——将目的基因导入受体细胞
1.转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
（或感受态细胞法）
（感受态细胞）
（1）花粉管通道法：
1.将目的基因导入植物细胞
①用___________将___________________直接注入____中；
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
②在植物受粉后的一定时间内，剪去____，将________滴加在________上，使目的基因借助___________进入_____；
柱头
DNA溶液
花柱切面
花粉管通道
胚囊
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
受体细胞：
受精卵
三、将目的基因导入受体细胞
思考：
1.在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，
农杆菌的作用是什么？
2.原理？
3.采用农杆菌转化法导入目的基因时，
为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上
4.目的基因插入染色体DNA上的目的是什么？
5.两次拼接、两次导入
6.转基因的植物细胞如何获得最终的新品种？
植物组织培养
农杆菌能侵染双子叶植物和裸子植物，将目的基因转入到受体细胞中
原理:农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，因此只要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。P81
由于Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了 T-DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上
转化的目的：
使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达
植物组织培养
（2）
7.转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后_____________，并__________；
受体细胞为_______
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将____直接浸没在________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；
受体细胞为_______
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
三、将目的基因导入受体细胞
思考
按前面三个步骤进行了操作，
1.是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？
2.是否可以确定目的基因一定能够进行表达？
3.是否可以确定得到了新的性状？
不一定！
如何判断？
1.分子水平检测
2.个体生物学水平鉴定
一、检测与鉴定的目的：
二、检测与鉴定的方法：
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
PCR技术、核酸分子杂交
抗原-抗体杂交
PCR技术、核酸分子杂交
第四步——目的基因的检测与鉴定
检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
抗性及抗性程度的鉴定
原理：抗原抗体特异性结合
具体操作：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已翻译
①抗虫棉：采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫
②耐盐水稻：用一定浓度的盐水浇灌水稻
③抗除草剂植物：喷洒除草剂
④抗病毒（菌）植物：病毒（菌）接种实验
⑤转基因产品：提取转基因产品与天然产品的功能进行活性比较
PCR技术检测
基本原理：根据目的基因特点设计特定引物，然后进行PCR，看是否扩增出目的基因。
①若有扩增产物,表明转入目的基因 ②若没有,表明没有成功转入目的基因
特别说明：mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA在进行扩增
核酸分子杂交技术
①用放射性同位素标记（或荧光标记）的目的基因作探针与受体细胞的染色体DNA进行杂交，如果显示出杂交带，表明目的基因已插入染色体DNA中
②用放射性同位素标记（或荧光标记）的目的基因作探针与受体细胞的mRNA杂交， 如果显示出杂交带，表明目的基因已转录
注意：
（1)在将目的基因导入受体细胞之前，都必领进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。
(2)对植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性而且容易表现。
(3)对动物来说受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，分化的动物体细胞的全能性受到抑制。（早期胚胎培养、胚胎移植）
(4)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌原核生物，而酵母菌为真核生物（具有多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。(发酵工程)
(5)外源DNA并不一定整合到受体细胞的DNA上才能发挥作用。根据质粒（载体）的特点，质拉能在细胞中自我复制，或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制，可判断外源基因也可以在受体细胞的细胞质中发挥作用
到社会中去
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
到社会中去
（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。
到社会中去
这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。
（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
到社会中去
某科研小组采用转基因技术将猪生长激素基因导入大肠杆菌，大量获取猪生长激素。回答下列问题：
（1) 从猪垂体中提取出猪生长激素相关mRNA,通过逆转录酶的作用获取___用于PCR扩增，扩增时同时需要设计___种引物，原因是_______________________________________________________________。在构建猪的cDNA文库时，需要将反转录产生的多种cDNA片段 (填处理）后储存在一个受体菌群中。
（2) 可通过PCR技术扩增猪生长激素基因，其前提是
，以便合成引物。PCR技术中利用 （填条件）对猪生长激素基因进行解旋。相比细胞内的DNA 聚合酶，在PCR 反应中使用的 Taq 酶的主要特点是 .
（3）DNA疫苗所利用的DNA编码序列通常只是单一的一段病原体基因，而非整个基因组，这样做的优点是___。
cDNA
两 DNA是两条反向平行的双链结构，DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
与载体连接
要有一段已知的猪生长激素基因的核苷酸序列 高温（或90~95℃的温度）
热稳定性较高
比较安全，能够产生相应的抗原刺激免疫系统，又不会产生完整的病原体造成危害
上节所学检查
3.3 基因工程的应用 P87--91
本页不用背，了解即可
1.方案—课本P88，将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，培育抗除草剂的作物品种
2.防止基因污染：
应用1——转基因抗除草剂植物
课后练习题P92—拓展应用1
（1）抗除草剂基因导入玉米受体细胞的叶绿体基因组中
原因：叶绿体基因组不会随花粉遗传给下一代
（2）抗除草剂基因导入雄性不育系中
原因：防止抗除草剂基因通过花粉传播，进入近缘作物，造成基因污染
（3）P102 将玉米α-淀粉酶基因 与目的基因 一起转入植物
原因： α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，防止转基因花粉传播
基因漂移：是指一种生物的基因向附近野生近缘种自发转移，导致其基因发生变化的现象
思考：玉米为异花传粉，花粉飘散的距离很远，容易造成基因漂移，有的同学提出将抗除草剂基因整合到玉米受体细胞的叶绿体基因组中，你是否同意该观点，并给出你的理由
同意，叶绿体基因组不能随花粉遗传给下一代
应用2：用基因工程菌生产药物：（如细胞因子、抗体、疫苗、激素等）
1.工程菌：
2.用大肠杆菌生产人胰岛素的流程：
用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类称为基因工程菌 P91
①人胰岛素基因的筛选和获取：用RT-PCR（逆转录PCR）获取人胰岛素基因（cDNA）
②人胰岛素基因表达载体的建构：用限制酶和DNA连接酶将人胰岛素基因（要添加启动子、终止子）与质粒拼接，构建基因表达载体；
③将人胰岛素基因导入大肠杆菌细胞：用Ca+处理大肠杆菌，将重组质粒导入大肠杆菌；
④人胰岛素基因的检测与鉴定：检测筛选出成功转化的大肠杆菌
⑤进行发酵培养（菌种扩大培养、配置培养基、灭菌、接种、发酵、产物的分离和提纯）
思考：目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素，还可以用酵母菌来生产人胰岛素，请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑，二者生产的人胰岛素有何不同？
大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，无法对合成的胰岛素肽链进行加工，没有生物活性
酵母菌是真核生物，有内质网和高尔基体，可以对合成的胰岛素肽链进行一定的加工和修饰，有生物活性。
与乳腺中特异表达 的基因的启动子等调控元件 重组在一起
应用3：转基因哺乳动物批量生产药物：乳腺生物反应器或乳房生物反应器
1.为什么要将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？ 让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达
2.利用乳腺生物反应器生产蛋白质，有什么局限性？
受性别和发育时期的限制
3.如何改进？
将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组，
制备膀胱生物反应器，从尿液中提取
4.乳腺生物反应器指整个转基因动物，而不是转基因动物的乳腺
5.乳腺生物反应器经有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗？
不一定；
①目的基因在受体细胞中不是成对存在的，相当于杂合子，配子中可能不含该基因，则有性生殖产生的后代中可能不含目的基因
②有性生殖产生的后代可能为雄性，不能分泌乳汁
泌乳期
早期胚胎培养
胚胎移植
胚胎移植前，应取样滋养层，做DNA分析，
鉴定性别，
保留雌性
★
转基因技术中会形成新物种吗？
不会，转基因技术一般不会导致生殖隔离
应用4：培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官
1.为什么可以用猪的器官解决人类器官移植的来源问题？
①猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似
②与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒要少得多
2. 利用转基因技术对猪的器官进行改造，培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，采用什么方法？
①在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达
②设法除去抗原决定基因
然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
其他应用
1.相比从天然产物中提取的酶，构建基因工程菌，然后用发酵技术生产酶，优势？P91最后一段
纯度更高、生产成本显著降低、生产效率较高。
2.用基因工程培育可以降解多种污染物的超级细菌，处理环境污染。
★
九、基因工程的应用
利用转基因技术显著抑制番茄中乙烯形成酶的活性和乙烯的生成量，从而育成了转基因耐储藏番茄。（四）T5、下页幻灯片
建立某些人类疾病的转基因动物模型,模拟疾病的发生和发展过程，为研究该疾病的致病机制和开发治疗药物提供依据，如转基因小鼠1型糖尿病模型、转基因小鼠原发性高血压模型等。
用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类称为基因工程菌
1.糖蛋白
2.干扰病毒复制
3.从人血液中的白细胞内提取
ACC合成酶是乙烯合成过程中的关键酶，由ACC合成酶基因(简称A基因)控制合成。将A基因反向连接在启动子和终止子间可构成反义ACC合成酶基因(A1基因)，转A1基因番茄的后熟过程变慢，利于番茄的储藏和运输。请回答：
（1）从番茄的果肉细胞中提取RNA， 利用RT-PCR获取A基因，即利用RNA和PCR技术获取目的基因。利用RT- PCR获取A基因所需要的酶主要有___________________。在A基因扩增过程中需要特定的引物，该引物的作用是_____________________________________________。
（2）S1和S2为A基因和A1基因的特异性启动子，S2在番茄果肉细胞内起作用，S1在除果肉细胞外的其他细胞内起作用。在构建转A1基因表达载体时，启动子应选择________。A1基因的表达元件包括启动子、终止子以及反向连接在两者之间的A基因，若用农杆菌转化法将此元件整合到番茄细胞的染色体DNA上，则应将此元件应构建在___________中。
（3）在检测番茄细胞的染色体DNA上是否插入了A1基因时， __________(填“能”或“不能”)用放射性物质标记的A基因做探针进行检测，理由是____________________________。
（4）检测表明，与非转基因番茄相比，转A1基因番茄的果肉细胞内乙烯含量下降，机理是___________。
（1）逆转录酶、TaqDNA聚合酶
定位A基因的位置，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
（2）S2 Ti质粒的T-DNA
（3）不能 番茄细胞内含有A基因，无论是否插了A1基因都能与探针杂交形成杂交带
（4）转基因番茄细胞中有A基因与A1基因，二者转录产生的 mRN能杂交形成双链，进行碱基互补配对，形成了双链RNA，从而阻断了A基因表达的翻译过程 导致ACC合成酶的合成受阻，从而使乙烯的合成量降低
典型题目——转基因耐储藏番茄
1.蛋白质工程的概念、定位
在具体操作的过程中，直接操作的对象是？具体对他进行了怎样的操作？基因修饰或基因合成
2.蛋白质工程操作程序与基因工程有什么不同？
3.为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？
4.降低人对小鼠单克隆抗体的免疫反应的思路
蛋白质工程的原理和应用
是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。——第二代基因工程
小鼠单克隆抗体--了解
鼠源性抗体
杂交瘤单克隆抗体制备技术的基本原理是利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞在体外进行融合，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养(克隆化)，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能不断繁殖的杂交瘤细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。由于单抗的应用是从体外诊断向体内肿瘤定位和治疗方向发展，故鼠源性单抗出现了难以克服的缺点，特别是在体内应用时，存在主要组织相容性抗原(MHC)和超敏反应问题。随着鼠源单克隆抗体在临床治疗中越来越广泛的应用，降低抗体免疫原性的要求也变得越来越迫切。为了克服这一问题科学家利用基因工程方法使小鼠的抗体人源化。通过构建人一鼠嵌合抗体，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体。
人鼠嵌合抗体----蛋白质工程
为了克服鼠源性单克隆抗体存在的问题，科学家利用基因工程方法使小鼠的抗体人源化。通过构建人一鼠嵌合抗体，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体。嵌合抗体指的是鼠单克隆抗体的恒定区基因被人抗体的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码并在合适的宿主细胞中表达而产生的单克隆抗体。基本原理:抗体分子的特异性识别、抗原结合由轻链和重链可变区决定的，而异源蛋白产生的人抗鼠抗体反应的主要是抗体恒定区。将小鼠单抗恒定区用人源化恒定区代替而拼接成嵌合抗体，使其重链和轻链的可变区来自小鼠，恒定区来自人类。简言之嵌合抗体既具有抗原结合特异性，又大大地降低了鼠单抗的异源性。嵌合抗体是基因工程抗体最早研究出来的一种抗体，在肿瘤治疗和诊断方法已被广泛的应用。虽然嵌合抗体在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应，但仍存在一少部分鼠源成分。这直接导致抗体被迅速清除，从而降低治疗效果。
项目 蛋白质工程 基因工程
操作对象
操作起点
操作水平
操作流程
结果
实质
联系
基因
基因
DNA分子水平
DNA分子水平
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质
目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
可生产自然界没有的蛋白质
可生产自然界已有的蛋白质
通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；
②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程基本操作；
预期蛋白质功能
目的基因
蛋白质工程与基因工程的比较
安全与伦理问题
基因工程
举例：转基因耐储藏番茄
利用转基因技术显著抑制番茄中乙烯形成酶的活性和乙烯的生成量，从而育成了转基因耐储藏番茄。
（1）将生长激素基因、促生长激素释放激素基因等转入动物体内,培育了生长迅速、营养品质优良的转基因家禽、家畜。
（2）建立某些人类疾病的转基因动物模型,模拟疾病的发生和发展过程，为研究该疾病的致病机制和开发治疗药物提供依据，如转基因小鼠1型糖尿病模型、转基因小鼠原发性高血压模型等。
获取胰岛素、干扰素、白细胞介素、溶血栓剂等药物
判断：转基因生物和转基因食品对人类没有危害,全部安全？
[归纳提升]
争论焦点 反对者观点 赞成者观点
食物安全 ①担心出现滞后效应,担心出现新的过敏原,担心营养成分改变; ②担心会引发宗教信仰类争论 ①多环节、严谨的安全性评价,可以保证转基因食物的安全;
②尚未发现因食用转基因食物而影响人体健康的实例
转基因产品引发的安全性争论
生物安全 ①可能成为“入侵的外来物种”; ②可能重组出有害病原体; ③有可能使杂草成为除不掉的“超级杂草” ①转基因农作物生命力有限,扩散到种植区外,会很快死亡;
②要表现出被赋予的新性状,必须具有一定的条件和种植技术;
③由于生殖隔离,难以与其他植物杂交;
④花粉传播距离有限,存活时间有限
环境安全 ①打破物种原有界限,改变生态系统中能量流动和物质循环; ②重组的微生物可能造成二次污染; ③有毒蛋白或过敏蛋白可能通过食物链进入其他动物和人体内 ①转基因并不会改变生物原有的分类地位,不会破坏生态系统的稳定性;
②转基因抗虫作物的种植可减少农药的使用;
③抗除草剂作物的种植,可保护农田土壤环境
破坏生物的多样性
破坏生态系统内的生态平衡。
“沉默基因"
对生殖性克隆人研究的两种态度
观点 支持生殖性克隆人 反对生殖性克隆人
论据 ①是一项科学研究，有它自己内在的发展规律，社会应该允许科学家研究； ②虽然现在人们的伦理道德观念还不能接受这一切，但是人的观念是可以改变的； ①生殖性克隆人“有违人类尊严”；
②生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，严重地违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用；
③克隆技术还不成熟，生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题，与人类传统伦理道德是背道而驰的
2.中国政府对生殖性克隆人实验的四不原则
不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆实验。
生殖性克隆人破坏了人类基因多样性的天然属性,不利于人类的生存和进化。
试管动物
区别：在胚胎移植前进行特定基因的检测。
联系：二者都是体外受精,体外早期胚胎发育,再进行胚胎移植,从生殖方式上应为有性生殖。
进行基因编辑（基因的敲除或插入），有目的地改造特定基因，胚胎移植前需进行遗传诊断
设计完美婴儿
世界范围内应全面禁止生物武器
三、禁止生物武器
ACC合成酶是乙烯合成过程中的关键酶，由ACC合成酶基因(简称A基因)控制合成。将A基因反向连接在启动子和终止子间可构成反义ACC合成酶基因(A1基因)，转A1基因番茄的后熟过程变慢，利于番茄的储藏和运输。请回答：
（1）从番茄的果肉细胞中提取RNA， 利用RT-PCR获取A基因，即利用RNA和PCR技术获取目的基因。利用RT- PCR获取A基因所需要的酶主要有___________________。在A基因扩增过程中需要特定的引物，该引物的作用是_____________________________________________。
（2）S1和S2为A基因和A1基因的特异性启动子，S2在番茄果肉细胞内起作用，S1在除果肉细胞外的其他细胞内起作用。在构建转A1基因表达载体时，启动子应选择________。A1基因的表达元件包括启动子、终止子以及反向连接在两者之间的A基因，若用农杆菌转化法将此元件整合到番茄细胞的染色体DNA上，则应将此元件应构建在___________________中。
（3）在检测番茄细胞的染色体DNA上是否插入了A1基因时， __________(填“能”或“不能”)用放射性物质标记的A基因做探针进行检测，理由是____________________________。
（4）检测表明，与非转基因番茄相比，转A1基因番茄的果肉细胞内乙烯含量下降，机理是___________。
转基因番茄细胞中有A基因与A1基因，二者转录产生的 mRNA能杂交形成双链，导致ACC合成酶的合成受阻，从而使乙烯的合成量降低
逆转录酶、TaqDNA聚合酶
定位A基因的位置，与模板链结合并为子链的延伸提供起点（使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链）
S2 Ti质粒的T-DNA
不能 番茄细胞内含有A基因，无论是否插了A1基因都能与探针杂交形成杂交带

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