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勇于开始，
才能找到成功的路
工具（限制酶、DNA连接酶、载体 ） 基因工程的工具酶：限制酶、DNA连接酶
1.限制酶： （1）主要来源：原核生物
a.限制酶在原核生物的作用是？切割外源DNA，从而达到保护自身的目的。
b.限制酶不破坏自身DNA的原因是什么？①细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列 ②甲基化酶对细胞自身具有的识别序列进行了修饰
（2）作用特点：专一识别特定的核苷酸序列，切割特定部位
（3）结果：产生黏性末端或平末端 （4）作用的化学键：磷酸二酯键
2.DNA连接酶：E.coliDNA连接酶只连接黏性末端；T4DNA连接酶连黏性末端和平末端
3.载体： 质粒（最常用）、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒
①质粒结构：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子②质粒作用：作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去、利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制
③作为载体必须具备的四个条件？
落实整理：基因工程工具——7分钟背熟
1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；
2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因
3、为避免目的基因和质粒的自身环化及目的基因与质粒的随意连接(反向连接)，可使用两种切割后能产生不同黏性末端的限制酶来切割目的基因和质粒，确保目的基因和质粒正向连接
4规律：---选择酶切位点的原则：
1. 基因工程的四个步骤 P76页第一段。2. 目的基因的筛选和获取：①目的基因的定义和类型----P76， 筛选目的基因的有效的方法？--P76最后一段； 通过什么工具进行筛选？P77第二自然段 获取目的基因的方法---P77第三段: 人工合成、PCR扩增、构建基因文库----P82
②PCR的名称，定义，原理，5个基本条件、扩增的仪器,DNA聚合酶的激活条件？引物的种类？引物的定义？---P77相关信息。
③扩增的过程P77及78页文字和图； DNA子链的延伸方式是从___端到___端，脱氧核苷酸添加到引物的___端？
④PCR完成后如何检测和鉴定PCR的产物？P78页最后自然段 ⑤用PCR可以扩增mRNA吗？P79旁栏思考；需要在体系中加入的酶？
3. 基因表达载体的构建： ①基因工程的核心步骤是？该步骤的作用是？--P80 ②基因表达载体的组成部分？每一部分的作用？启动子的类型？特性？ ③构建基因表达载体的过程？--P80页和图
同种限制酶或是能产生相同末端的限制酶切割基因表达载体和含目的基因的DNA片段，DNA连接酶连接。
4. 将目的基因导入受体细胞①导入植物细胞的方法有？P80-81花粉管通道法：P81农杆菌转化法：
导入动物细胞的方法有？P82 受体细胞一般为受精卵，全能性高---显微注射法
导入微生物细胞的方法有？P82---Ca2+处理大肠杆菌细胞……②转化的定义--P81页资料卡，③农杆菌转化法：T-DNA的定义和特点？农杆菌转化法的过程 5. 目的基因的检测与鉴定 ①分子水平的检测--如何检测染色体DNA上是否插入外源基因？②如何检测是否转录出了mRNA？
③如何检测是否翻译成了蛋白质？④个体水平如何检测？--P82 性状测定、抗性检测
6.基因工程的应用：获得乳腺生物反应器生产药物的过程？--P90 基因工程菌的定义---P91相关信息
7.蛋白质工程的定义---P93 基础是？通过什么手段？目的是？
基因工程只能生产出自然界已有的蛋白质,蛋白质工程对目的基因进行实质性的改造，从而改造现有蛋白质或制造新的蛋白质
蛋白质工程的基本思路---P94 第三段和图。
PCR获取和扩增目的基因P77
名称：聚合酶链式反应 原理：DNA半保留复制
仪器：P84 PCR仪 特点：体外，大量复制目的基因
条件：P77表3-1补充勾画
模板：DNA母链 原料：4种脱氧核苷酸 实际上是4种dNTP
酶：耐高温的DNA聚合酶（P16筛选；P84 TaqDNA聚合酶）
引物：P77相关信息 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，通常为20-30个核苷酸，需2种引物。
缓冲液（含Mg2+）:P77相关信息 真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2+激活。
变性（90℃以上）高温目的基因DNA受热变性，打开氢键解为单链
复性（50℃左右）引物与单链相应互补序列结合
延伸（72℃左右）以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端
P77，目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端，如此重复循环多次。每次循环分为：变性、复性、延伸三步。
结果：P78指数形式扩增（约为2n）；PCR扩增两引物之间的DNA片段
过程
1.将目的基因导入受体细胞的方法是什么？转化
2.何为转化？目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程
3.将目的基因导入双子叶植物细胞、导入动物细胞、导入微生物细胞分别用什么方法？
农杆菌转化法、显微注射技术、Ca2+处理法（或感受态细胞法）
4.采用农杆菌转化法导入目的基因时，为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上
由于Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上,而目的基因又插入到了T-DNA上,所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
5.目的基因插入染色体DNA上的目的是什么？
使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达
6.原核生物作为受体细胞的原因是什么？
繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少
7. 将目的基因导入大肠杆菌的转化过程是怎样的？
a.首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）
b.将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定温度下，促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化
8.若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是？
未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱
9.在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是？
农杆菌可感染植物，将目的基因转入到受体细胞中
背诵知识点——将目的基因导入受体细胞（熟记10分钟）
原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术、转基因技术。
操作环境：体外
基因工程最大的优势：定向改造生物的遗传性状
肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
DNA双螺旋结构模型，DNA的半保留复制，中心法则，
遗传密码破译
体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
DNA序列分析
DNA合成仪
农杆菌转化法
发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
细菌质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。
高通量测序技术
基因组编辑技术，实现对特定基因的定点插入、敲除或替换
一、基础理论和技术的发展催生了基因工程
形成氢键
磷酸二酯键
①DNA分子独特的双螺旋结构提供精确的模板
②碱基互补配对原则保证复制准确进行
与必修二的衔接
⑴解旋：在能量的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开。
⑵合成子链：DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的脱氧核苷酸为原料，按碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。
⑶重新螺旋：每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。
断开氢键
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1.简称：
限制酶
2.来源：
主要是从原核生物中分离纯化出来的。
3.作用：
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
4.作用部位：
特定部位的磷酸二酯键
A
T
C
G
T
A
G
C
5’
3’
5’
3’
磷酸二酯键
5.识别序列：
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
具有专一性
6.切割结果：切口有两种：黏性末端和平末端
①无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，这就是回文序列。
②能被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
当限制酶在它识别序列的___________将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是__________；
当限制酶在它识别序列的_________切开时，产生的是______；
中轴线两侧
黏性末端
中轴线处
平末端
黏性末端
黏性末端
2024/1/1
实例1—EcoRⅠ限制酶：
识别序列为GAATTC，
切割部位为GA之间的磷酸二酯键。
实例2——SmaⅠ限制酶：
识别序列为CCCGGG
切割部位为CG之间的磷酸二酯键。
形成黏性末端
平末端
形成平末端
课堂练习：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ____ EcoRⅠ__ HindⅢ___ BglⅡ ___
GATC
AATT
AGCT
GATC
限制酶切割目的基因片段时需要切割几次？产生几个末端？断开几个磷酸二酯键？
2 4 4
同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的黏性末端相同
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。
所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？
DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列或DNA分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开
4.结果：产生黏性末端或平末端
6.单酶切：容易出现反连和载体、目的基因的自连现象（即所谓环化）
双酶切：不同的酶作用于不同的碱基序列，得到不同的黏性末端，避免自身环化和反向连接
同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的粘性末端相同，可通过DNA连接酶连接，但一般不能再被原来的酶识别和切割
1和2为同尾酶，黏性末端均为GATC，1可以切割的位点，2都可以切割
1.三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种酶的识别序列与切割位点，你能画出他们的黏性末端吗？有什么特点？
2.用同一种限制酶切割后，目的基因的两侧会露出相同的黏性末端，有没有可能目的
基因的黏性末端自己连接？
五、限制酶
用同一种限制酶切割目的基因的两侧，会出现目的基因自身环化的情况
用两种不同限制酶切割，形成相同的黏性末端
(同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的黏性末端相同)
进一步思考：同尾酶切割形成的末端通过DNA连接酶连接后，该序列还能再被原来的酶识别和切割吗？
9..用同一种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？
10.用两种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？
【思考】用限制酶切割时需注意的事项
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
两
4
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
⑤两种同尾酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能再被原来的限制酶识别
④不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对连接
①目的基因—目的基因、 ②目的基因自身环化、 ③质粒—质粒、
④质粒自身环化、⑤目的基因—质粒、 ⑥目的基因—质粒反向连接
目的基因—目的基因、质粒—质粒、目的基因—质粒
11.用不同的限制酶切割：可以防止目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒反向连接（或保证目的基因和质粒正确连接）
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不同点 作用实质
作用结果
模板
相同点
催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键
催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子
催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
需要
不需要
①化学本质都是蛋白质②都是催化形成磷酸二酯键
DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较
2.分类：
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点
大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
恢复的都是磷酸二酯键
1.载体的种类： 质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒 2.载体的作用：将目的基因送入受体细胞
3.质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的的双链环状DNA分子
4.作为载体必须具备的条件：
5.真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。
①能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
②具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（目的基因）插入。
③具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选 ④对受体细胞无害。
三、载体
限制酶 DNA解旋酶
区别A 切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键 将DNA两条链的氢键打开形成两条单链
限制酶 DNA酶
区别B 切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段DNA 切割磷酸二酯键，形成单个脱氧核苷酸
实验——DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理：
1.DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，溶于2mol/L的NaCl溶液
3.鉴定原理：DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
二、过程：
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
动物细胞（鸡血细胞）/植物细胞 哺乳动物成熟的红细胞？
加体积相等、预冷酒精（体积分数95%）静置，得白色丝状物
提取方案：
①用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水
②离心将沉淀物晾干
方案：
①4℃冰箱静置后取上清液
②离心后取上清液
2mol/L的NaCl溶液，
2只试管
二苯胺
沸水浴加热
蓝色
动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，吸水胀破后，过滤收集滤液即可。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
研磨液：
洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；
食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
①低温放置几分钟的作用？
②搅拌时应轻缓、并沿一个方向的原因？
①抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
②减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
可能含有核蛋白、多糖等杂质
1.基因工程的基本操作程序？P76四步
3.2 基因工程的基本操作程序
1.目的基因的获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
植物细胞：农杆菌转化法(常用）、基因枪法、花粉管通道法
动物细胞（受精卵）：显微注射法
微生物细胞：感受态细胞法
检测方法：
1.分子水平：DNA分子杂交法、分子杂交法、抗原－抗体杂交法
2.个体水平：抗虫鉴定 抗病鉴定、活性鉴定等
Bt抗虫蛋白被分解为多肽，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。
①Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人畜的胃液呈酸性 ②人畜的肠道细胞没有特异性受体。
在基因工程的设计和操作中，用于_________________或_________________等的基因就是目的基因，根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指_____________；
改变受体细胞性状
获得预期表达产物
编码蛋白质的基因
（1）方法：
从相关的________和_________的基因中进行筛选
已知结构
功能清晰
1.何为目的基因？
76第二段
2.获取的方法？77整理
基因组文库、CDNA文库（只有外显子序列）
旁栏相关信息77：Bt抗虫基因杀死害虫的原理及是否对人核牲畜有害的原理
基因工程操作环境：体外；
操作水平：DNA分子水平； 原理：基因重组；
补充——基因文库的构建
构建方法：直接分离法、反转录法
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
1.反转录法
思考：
当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：
1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？
2.以上情况如何解决？
3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？
4.以上情况如何解决？
真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白
使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工
人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
若原核生物由mRNA逆转录形成的cDNA与原基因的结构相比有哪些不同？缺少启动子和终止子
若真核生物由mRNA逆转录形成的cDNA与原基因的结构相比有哪些不同？基因只包括了编码区中的外显子序列，而没有非编码区和内含子序列
（缺少启动子、终止子、内含子）
名称：聚合酶链式反应 原理：DNA半保留复制 仪器：PCR扩增仪（PCR 仪）
条件：
缓冲溶液中添加Mg2+的作用？真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2+激活。
过程：
①变性：温度上升到至90℃以上时，双链DNA解聚为单链
②复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
③延伸：温度上升到72℃左右时，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补
配对原则加到引物的3’端，合成新的DNA链。
可以在短时间内大量扩增目的基因
5.PCR：
为DNA的合成提供原料和能量
关于dNTP的思考：
1.ATP与RNA的关系？
2.PCR扩增中，加入dNTP的作用是什么？
ATP去掉两个磷酸基团后是腺嘌呤核糖核苷酸
ATP——腺苷三磷酸
dATP——脱氧腺苷三磷酸
名称：聚合酶链式反应 原理：DNA半保留复制 仪器：PCR扩增仪（PCR 仪）
条件：
缓冲溶液中添加Mg2+的作用？真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2+激活。
过程：
引物的作用：与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
引物的种类：需2种引物。 为何需要2种引物？
两种引物的要求
①变性：温度上升到至90℃以上时，双链DNA解聚为单链
②复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
③延伸：温度上升到72℃左右时，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补
配对原则加到引物的3’端，合成新的DNA链。
①模板：DNA母链 ②原料：4种脱氧核苷酸（dNTP）
③酶：耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）④2种 引物 ⑤缓冲溶液（含Mg2+）
DNA的两条反向平行链都做模板，其碱基序列不同，且DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
①引物自身不能环化
②两种引物之间不能互补配对
③引物长度不宜过短，防止引物随机结合
可以在短时间内大量扩增目的基因
5.PCR：
为DNA的合成提供原料和能量
(2)两种引物与模板链如何配对？ 。
引物的5′端与模板链3′端互补配对
(3)目的基因能被准确扩增的原因是
目的基因独特的双螺旋结构提供了精确的复制模板；碱基互补配对原则保证复制准确的进行
扩增n次需要多少个引物？ 至少需经过3次循环才能分离得到所需要的DNA区段
鉴定PCR产物的方法 琼脂糖凝胶电泳
用PCR可以扩增mRNA吗？不可以，需要逆转录成cDNA再进行扩增
假设复制培养n代，结果如下：
①n代后，DNA分子有_____个
②n代后，DNA链有_____条
③第____代出现完整的目的基因
④n代后，含引物的DNA分子有_____个
⑤n代后，共消耗_____个引物
⑥第n代复制，消耗了______个引物
⑦n代后，完整的目的基因有_____个
2n
2n+1
3
2n
2n+1-2
2n
2n-2n
1.如果引物中GC含量较高，可适当提高退火温度
2.退火温度过高，得不到产物或者导致目标产物的量减少的原因：引物不能稳定的与模板结合（引物与模板结合的稳定性遭到破坏）
例：进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中____的设定与引物有关，____的设定与扩增片段的长度有关。 ①变性温度 ②复性温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间答案：② ⑥
（15）目前在PCR反应中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_____________。答案：TaqDNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
（16）为方便构建重组质粒，设计引物时需要增加适当的_________位点。设计引物时需要避免引物之间形成_____________，而造成引物自连。(限制酶 碱基互补配对)
（17）为便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的_______端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是___________________________。（5' 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连）
相似名词比较
比较项目 位置 功能
启动子 （其上有一个重要的位点：RNA聚合酶结合位点）
起始密码子
终止子
终止密码子
DNA
mRNA
DNA
mRNA
终止翻译
驱动翻译
终止转录
驱动转录
1.启动子≠起始密码；终止子≠终止密码，密码子是mRNA上的，参与翻译过程
2.生物体内所有细胞（除哺乳动物成熟红细胞外）均具有相同的基因，但是有的基因在所有细胞中都表达（如呼吸酶基因），但是有的基因只在特定细胞中选择性表达（如胰岛素基因在所有体细胞中均存在，所以所有细胞中的DNA均可与胰岛素基因探针形成杂交带。但是其仅在胰岛B细胞中表达，所以只在胰岛B细胞中能转录出相应的mRNA，因此只有胰岛B细胞中的mRNA与胰岛素基因探针形成杂交带。）
1.引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链
2.需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此DNA的复制需要引物
3.设计两种引物的原因：基因的两条反向平行链都做模板，其碱基序列不同，且DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
4.需要大量引物的原因：子链是在引物的引导下合成的，引物随子链DNA数量的增多而被消耗
5.PCR扩增的产物的特异性：由引物的特异性决定；引物是根据目的基因两端的核苷酸序列设计的
6.两引物间固定长度(等长)的DNA序列在PCR扩增3次后首先出现
7.复制方向:是沿子链5’→3’，从引物的3’端延伸子链
8.如果需要在引物上加限制酶的识别序列：需要在引物的5’加
9.在引物的5’端设计两种限制酶识别序列的原因：便于目的基因和载体的定向正确连接
10.如果引物中GC含量较高，可适当提高退火温度
11.设计引物时，引物自身不能有碱基互补配对的序列：避免引物自连，不能得到目的产物。
12.设计引物时，两引物之间不能有碱基互补配对的序列：防止两引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率
13.引物设计不能太短：防止非目的基因的获得
14.退火温度过高，得不到产物或者导致目标产物的量减少的原因：引物不能稳定的与模板结合（引物与模板结合的稳定性遭到破坏）
15.PCR后期，反应速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP浓度降低、反应产物增多
16.变性温度过低会导致双链不能充分解开；
补充--引物的设计
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
7.（威海期末）PCR可以特异性地快速扩增目的基因，成功的扩增应该产生与目的基因大小一致的扩增产物，不严谨的操作会导致无扩增产物或出现非目的基因扩增产物。下列说法正确的是（　　）
A. 若PCR反应缓冲溶液中未加入Mg2+，则结果可能不会出现扩增产物
B. 若模板DNA中含有抑制耐高温的DNA聚合酶活性的杂蛋白，则结果可能不会出现扩增产物
C. 若引物与非目的序列发生碱基互补配对，则结果可能会出现非目的序列扩增产物
D. 若引物间发生碱基互补配对，则结果可能会出现非目的序列扩增产物
PCR反应体系的成分(PCR的条件)
DNA模板：从样本或细胞中提取的微量总DNA
原料∶ 脱氧核苷酸
酶∶ TaqDNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶）
引物∶与目的DNA片段两条母链各自的3’端序列互补
PCR缓冲液∶维持pH，保护TaqDNA聚合酶
Mg2+：激活DNA聚合酶的活性
ABC
1.不能出现扩增产物：
（1）引物自身有碱基互补配对的序列，导致引物自连
（2）两引物之间碱基互补配对
（3）复性温度过高，引物不能稳定的与模板结合
（4）变性温度过低会导致双链不能充分解开；
（5）酶的活性降低
（6）Mg2+浓度过低
（7）模板DNA含有杂蛋白（抑制耐高温的DNA聚合酶活性的杂蛋白）
2.出现非目的序列产物：
引物设计太短
人工合成法：
①逆转录法：即以 作为模板，在 酶的作用下合成 ，若要运用该方法获得人的胰岛素基因，则只能从人的 细胞中提取到胰岛素的mRNA进行逆转录获取胰岛素基因；原因是 。上述方法获得的胰岛素基因（cDNA）在基因结构的特点是 。
mRNA
逆转录
cDNA
胰岛B
胰岛素基因只会在胰岛B细胞中表达，其他细胞中不表达
基因只包括了编码区中的外显子序列，而没有非编码区和内含子序列
思考：胰岛素基因存在于哪些细胞？
（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。DNA聚合酶只能特异地复制处于　　 之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。
两个引物
从子链的5′端向3′端延伸
5
(2n+1-2)=62
1.将真核生物基因导入大肠杆菌若无法获得该蛋白，原因可能是什么？
2..若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？
3.以上情况如何解决？
真核生物的基因有内含子，原核生物初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对蛋白质进行正确的加工
人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞
第二步——基因表达载体的构建（核心）80
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时能够表达和发挥作用。
2.组成：目的基因 ＋ 启动子 ＋ 终止子 ＋ 标记基因 + 复制原点
（1）标记基因：便于重组DNA分子的筛选
（2）启动子：DNA片段，基因上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因 转录出mRNA （诱导型启动子----激活或抑制基因的表达）
（3）终止子：是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的下游，转录终止的信号
（4）复制原点：DNA复制开始的地方
3.构建过程：需要限制酶和DNA连接酶的参与
载体与基因表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。
基因表达载体在载体基础上增加了启动子、目的基因、终止子
选择限制酶的原则：
①选目的基因两端和载体都有限制酶的切割位点；可用同种限制酶或者产生相同末端的限制酶（同尾酶），同时切割载体和含有目的基因的DNA片段，
②所选酶切位点不能破坏目的基因、标记基因（至少有一个完整）、复制原点、启动子、终止子
③为避免目的基因和质粒的自身环化及目的基因与质粒的反向连接，可使用两种切割后能产生不同黏性末端的限制酶来切割目的基因和质粒，确保目的基因和质粒正向连接。目的基因应插入启动子和终止子之间。
①用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是 。
②构建重组质粒时，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。
SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因
确保目的基因与质粒的定向连接
用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是
　 （从“EcoRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是： 。
BamHⅠ/HindⅢ
若选EcoRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点
三、将目的基因导入受体细胞
1.转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
2.农杆菌转化法： p101
受体细胞：
受精卵
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
这种细胞称为感受态细胞
思考：
1.在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，
农杆菌的作用是什么？
2.原理？
3.采用农杆菌转化法导入目的基因时，
为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上
4.目的基因插入染色体DNA上的目的是什么？
5.两次拼接、两次导入
6.转基因的植物细胞如何获得最终的新品种？
植物组织培养
农杆菌能侵染双子叶植物和裸子植物，将目的基因转入到受体细胞中
原理:农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，因此只要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。P81
由于Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了 T-DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上
转化的目的：
使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达
植物组织培养
1.分子水平检测
一、检测与鉴定的目的：
二、检测与鉴定的方法：
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：PCR技术 核酸分子杂交
方法：PCR技术 核酸分子杂交
目的基因的检测与鉴定
检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
原理：抗原抗体特异性结合
具体操作：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已翻译
抗原-抗体杂交
核酸分子杂交技术
①用放射性同位素标记（或荧光标记）的目的基因作探针与受体细胞的染色体DNA进行杂交，如果显示出杂交带，表明目的基因已插入染色体DNA中
②用放射性同位素标记（或荧光标记）的目的基因作探针与受体细胞的mRNA杂交， 如果显示出杂交带，表明目的基因已转录
2.个体生物学水平鉴定
①抗虫棉：采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫
②耐盐水稻：用一定浓度的盐水浇灌水稻
③抗除草剂植物：喷洒除草剂
④抗病毒（菌）植物：病毒（菌）接种实验
⑤转基因产品：提取转基因产品与天然产品的功能进行活性比较
是否具有抗性及抗性程度
注意对照原则：
对照组为非转基因植物;
实验组为转基因植物，其他条件一致
(1)为了避免抗虫基因通过花粉传播给其他植物，应将该目的基因导入 （细胞核/细胞质）中理由是 。
细胞质
细胞质基因具有母系遗传的特点
(2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的_____中是利用_的特点。
(3)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为________。
(4)目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是______________________，这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是________。
T－DNA可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上
转化　
目的基因是否插入了受体生物细胞的染色体DNA上
DNA分子杂交技术/PCR
(5)不同种生物之间的基因移植成功，其结构基础是 ，也说明了不同种生物共用一套 。
都是双螺旋结构，均由四种脱氧核苷酸组成
遗传密码
T－DNA
(6)要确定抗虫基因导入后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，则在个体水平上的鉴定过程可简述为 。
让害虫吞食转基因棉花的叶片，观察害虫的存活情况，以确定其是否具有抗虫性状　　
标记基因AmpR基因：可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长
由于LacZ基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒（没有连接目的基因的质粒）的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。
双重筛选
实验小组用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割目的基因和质粒，若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有 和 ．
氨苄青霉素
X﹣gal
要筛选含有重组质粒的Z细胞，应选择 的培养基。
含卡那霉素但不含亮氨酸的培养基
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的______原理
热变性
②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理；
DNA半保留复制
2.DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
*因此，离加样孔远的DNA片段____，近的DNA片段____
小
大
*因此，离加样孔远的DNA片段____，近的DNA片段____
小
大
一般使用的缓冲液的pH=8，在其中的DNA分子带负电，向正极泳动
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
DNA片段的扩增
1、移液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
2、离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
3、反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
DNA片段的电泳鉴定
1、配制琼脂糖溶液根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
2、制备凝胶①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
3、加样:将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
4、电泳接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
5、观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内
注意
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
该过程中有几种缓冲液？
1.电泳缓冲液（TAE或TBE）
*为DNA分子带上电荷提供一定的pH
2.凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）
*指示剂前沿迁移到凝胶边缘时，停止电泳
3.扩增缓冲液（内含Mg2+）
*为PCR提供一定的液体环境和pH等条件
四、结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
1.不能出现扩增产物：
（1）引物自身有碱基互补配对的序列，导致引物自连
（2）复性温度过高，引物不能稳定的与模板结合
（3）变性温度过低会导致双链不能充分解开、变性时间过短；
（4）热稳定DNA聚合酶的活性降低（或失活）
（5）Mg2+浓度过低
（6）模板DNA含有杂蛋白（抑制耐高温的DNA聚合酶活性的杂蛋白）
2.出现非目的序列产物：
（1）引物设计太短（或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性）
（2）两引物之间碱基互补配对（形成引物二聚体）
（3）复性温度过低
（4）Mg2+浓度过高、DNA模板出现污染
注意：
（1)在将目的基因导入受体细胞之前，都必领进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。
(2)对植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性而且容易表现。
(3)对动物来说受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，分化的动物体细胞的全能性受到抑制。（早期胚胎培养、胚胎移植）
(4)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌原核生物，而酵母菌为真核生物（具有多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。(发酵工程)
(5)外源DNA并不一定整合到受体细胞的DNA上才能发挥作用。根据质粒（载体）的特点，质拉能在细胞中自我复制，或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制，可判断外源基因也可以在受体细胞的细胞质中发挥作用
3.3 基因工程的应用 P87--91
能否稳定遗传？
抗病毒转基因植物通常为杂合子，后代会出现性状分离，不能稳定遗传。
（1）随着转基因抗虫棉在世界范围内广泛种植，科研人员推测棉铃虫存在对抗虫蛋白产生抗性的可能，请尝试提出应对的种植措施，并说明原理
（2）我国新疆棉区大规模种植抗虫棉的农场都种植了非抗虫棉作为棉铃虫庇护所，从生物进化角度分析这样做有何作用
(1)措施：与其他作物轮作或套种（或在转基因棉田周围种植一定比例的非转基因棉花）；原理：为棉铃虫提供正常的取食环境，始终保持一定的敏感棉铃虫种群，即使部分棉铃虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但因其与敏感棉铃虫交配，后代抗性基因会发生分离，具备抗性的棉铃虫种群不会迅速增加
延缓害虫抗性的产生和发展
乳腺（房）生物反应器
器官移植
生长
应用2：用基因工程菌生产药物：（如细胞因子、抗体、疫苗、激素等）
1.工程菌：
2.用大肠杆菌生产人胰岛素的流程：
用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类称为基因工程菌 P91
①人胰岛素基因的筛选和获取：用RT-PCR（逆转录PCR）获取人胰岛素基因（cDNA）
②人胰岛素基因表达载体的建构：用限制酶和DNA连接酶将人胰岛素基因（要添加启动子、终止子）与质粒拼接，构建基因表达载体；
③将人胰岛素基因导入大肠杆菌细胞：用Ca+处理大肠杆菌，将重组质粒导入大肠杆菌；
④人胰岛素基因的检测与鉴定：检测筛选出成功转化的大肠杆菌
⑤进行发酵培养（菌种扩大培养、配置培养基、灭菌、接种、发酵、产物的分离和提纯）
思考：目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素，还可以用酵母菌来生产人胰岛素，请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑，二者生产的人胰岛素有何不同？
大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，无法对合成的胰岛素肽链进行加工，没有生物活性
酵母菌是真核生物，有内质网和高尔基体，可以对合成的胰岛素肽链进行一定的加工和修饰，有生物活性。
思考：
1.干扰素的化学本质是什么？
2.干扰素的作用机理是怎样的？
3.干扰素用于哪些疾病的治疗？
4.传统生产干扰素的方法是什么
5.目前大量生产干扰素的方法是什么？
6.我国批准生产的第一个基因工程药物的名称叫什么？用于治疗哪些疾病？
糖蛋白
干扰病毒复制
病毒感染性疾病、乳腺癌、淋巴癌、多发骨髓瘤和某些白血病等
从人血液中的白细胞内提取
用基因工程方法从大肠杆菌及酵母菌细胞内获得
重组人干扰素α-1b
主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎等
根据前面学过的基因工程的操作程序，说出通过基因工程方法用酵母菌生产乙肝疫苗的过程是怎样的？
（提示：乙肝病毒抗原蛋白基因）
①用PCR扩增乙肝病毒抗原蛋白基因 ②将乙肝病毒抗原蛋白基因插入质粒，构建基因表达载体；
③将该基因表达载体导入酵母菌(该过程也是将酵母菌制备成感受态细胞，但是并不是用Ca2+处理，而是用醋酸锂处理）； ④检测并鉴定，筛选出成功转化的酵母菌，进行发酵培养，分离并提纯产物，获得乙肝病毒抗原蛋白。
与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起
应用3：转基因哺乳动物批量生产药物：乳腺生物反应器或乳房生物反应器
泌乳期
早期胚胎培养
胚胎移植
胚胎移植前，应取样 滋养层，做DNA分析，
鉴定性别，
保留雌性
★
思考：
1.注意：乳腺生物反应器指的就是这个转基因生物
2.为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？
3.药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？
4.生物反应器除了用乳腺，还可以用什么器官？
5.膀胱生物反应器哪些方面优于乳腺生物反应器？
6.研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因**？
7.用生物反应器生产药物的优点？
8.转基因技术中会形成新物种吗？
9.乳腺生物反应器经过有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗？
让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达
几乎所有细胞
膀胱
不局限于性别与发育时期（乳腺生物反应器必须是雌性且泌乳期才分泌）
将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组
产物容易提取
不会，转基因技术一般不会导致生殖隔离
不一定；①目的基因在受体细胞中不是成对存在的，相当于杂合子，配子中可能不含该基因，则有性生殖产生的后代中可能不含目的基因②有性生殖产生的后代可能为雄性，不能分泌乳汁
（基因表达的时空特异性可由启动子决定）
比较项目 乳腺（房）生物反应器 基因工程菌生产药物
基因结构
基因产物
受体细胞
导入方式
生产条件
产物提取
哺乳动物基因的结构与人类结构基本相同
细菌或酵母菌等生物的基因结构与人类基因结构有较大差异
与天然蛋白质完全相同
细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性
哺乳动物的受精卵
微生物细胞
显微注射法
Ca2+处理法（感受态细胞法）
不需要严格的灭菌，温度等外界条件对其影响不大
需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
从动物乳汁中提取，相对简单
（一般经过工业发酵后）从微生物细胞（或发酵液）中提取，相对复杂
乳腺（房）生物反应器与基因工程菌生产药物
用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。
发酵工程
应用4：培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官
1.为什么可以用猪的器官解决人类器官移植的来源问题？
①猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似
②与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒要少得多
2. 利用转基因技术对猪的器官进行改造，培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，采用什么方法？
a.在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达；
b.设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
其他应用
1.相比从天然产物中提取的酶，构建基因工程菌，然后用发酵技术生产酶，优势？P91最后一段
纯度更高、生产成本显著降低、生产效率较高。
2.用基因工程培育可以降解多种污染物的超级细菌，处理环境污染。
★
基因敲除
目的基因
三、转基因抗除草剂植物 p88
1.方案—课本P88，将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，培育抗除草剂的作物品种
2.课后练习题P92——拓展应用1
3.基因污染问题：
基因漂移：是指一种生物的基因向附近野生近缘种自发转移，导致其基因发生变化的现象
思考：玉米为异花传粉，花粉飘散的距离很远，容易造成基因漂移，有的同学提出将抗除草剂基因整合到玉米受体细胞的叶绿体基因组中，你是否同意该观点，并给出你的理由
同意，叶绿体基因组不能随花粉遗传给下一代，叶绿体属细胞质遗传（或母系遗传或位于细胞质中），可随卵细胞进入受精卵及种子中，叶绿体转基因技术不能阻止外源基因通过种子传播。
p102 我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播。
实时荧光RT-PCR技术（RT-qPCR）利用荧光标记探针对扩增产物量进行实时跟踪，再根据扩增曲线计算出起始模板量，即样本病毒载量。下图是利用RT-qPCR进行新冠肺炎病毒（SARS-CoV-2）载量测定的主要过程。请据图回答：
(1)过程①中，RNA提取裂解液可同时灭活病毒，原因是_____________。采集到的样本要迅速进行病毒灭活处理，其目的是_________________。RNA酶抑制剂的作用是_______________。(2)过程②中，加入的酶N是___________。根据图示，保证病毒核酸检测准确的关键是___________。(3)在进行新冠病毒核酸检测时，通常以病毒的ORF1ab基因为检测的目标基因，是因为ORF1ab基因具有_________的特点。检测试剂中还加有“阳性对照”和“阴性对照”，阴性对照的主要作用是_____。
(1) 蛋白酶K能催化病毒蛋白质水解
提高样本转运和检测阶段的安全性
防止样本RNA水解，影响检测结果的准确性(2) 逆转录酶
设计引物和探针的特异性
(3) 特异性强、基因结构相对稳定（变异小）
排除因检测过程、试剂等因素引起的假阳性
针对性训练2：P45-T7
CRISPR/Cas系统是细菌在进化中形成的一种防御机制。Cas蛋白能截取噬菌体的DNA片段，并将其插入到细菌自身的CRISPR基因中，整合有噬菌体DNA片段的CRISPR基因经转录产生RNA，此RNA与Cas蛋白共同构成CRISPR/Cas复合物，在此引导下，该复合物能定点切割对应的噬菌体DNA片段。科学家通过改造此系统，产生了CRISPR/Cas9基因编辑技术，可以实现对DNA的定点切割，其工作原理如下图所示。2019年上海科研团队通过基因编辑技术切除猕猴受精卵中的生物节律核心基因BMAL1，再利用体细胞克隆技术，获得了5只BMAL1基因敲除的克隆猴。这是国际上首次成功构建出的一批遗传背景一致的生物节律紊乱的猕猴模型。请回答下列问题:
(3)在个体水平鉴定BMAL1基因敲除成功的方法是观察猕猴是否表现为 。
(4)该团队利用一只BMAL1缺失的成年猕猴体细胞克隆出5只后代的实验中，涉及的生物技术有 (答出两项即可)。
(5)基因编辑后通过体细胞克隆得到的数只BMAL1缺失猕猴(A组)，与仅通过基因编辑多个受精卵得到的数只BMAL1缺失猕猴(B组)比较， （填A组”或B组”)更适合做人类疾病研究模型动物，理由是 。
体细胞克隆可以得到大量遗传背景相似或相同的实验动物，这样的实验动物用于医学研究的好处是______。
实验组和对照组的比较更具有说服力
与克隆小鼠相比，克隆猴更有利于对人类疾病的致病机制进行研究，原因是______。 课本P66
猴与人的亲缘关系更近，可最大限度排除由基因差异造成的结构和机理方面的不同
(1)CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白合成的场所是 ，该系统需要对特定的DNA序列识别并切割，其功能类似于基因工程工具酶中的 ，作用的化学键为 。推测该系统在细菌体内的生理意义是 。
(2)由于Cas9蛋白没有特异性，用CRISPR/Cas9系统切割BMAL1基因，向导RNA的识别序列应具有的特点是能与 通过基互补配对结合。
核糖体
限制酶
磷酸二酯键
切割外源 DNA，
保护自身
BMAL1 基因特定序列
生物节律紊乱
动物体细胞核移植、
动物细胞培养、
胚胎移植
A组
A组遗传背景一致(生物节律紊乱程度
一致)，提高了科学研究的可靠性和可比性
12
1.蛋白质工程基本思路？
2.确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
3.蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要原因？
4.为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？
5.降低人对小鼠单抗了抗体的免疫反应的思路：
1.概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
2.地位： 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程
3.崛起的缘由：基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要P93
4.目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造 P94
5.为什么直接操作对象是基因？①基因决定蛋白质； ②改造基因可以遗传，且可产生大量蛋白质
6.基本思路P94：
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需蛋白质
3.4 蛋白质工程 P93—95
①基础:
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
②操作方法及操作对象:
改造或合成基因
③结果
改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，满足人类生产和生活的需求
操作水平：DNA分子水平
9.为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？
10.降低人对小鼠单抗了抗体的免疫反应的思路：
①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大
②蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质
③基因可以遗传，蛋白质无法遗传
7.确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？P94讨论2
确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因，
或应用基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等进而改造基因
8.蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要原因？P95最后
难度很大，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构十分复杂
项目 蛋白质工程 基因工程
操作对象
操作起点
操作水平
操作流程
结果
实质
联系
基因
基因
DNA分子水平
DNA分子水平
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质
目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
可生产自然界没有的蛋白质
可生产自然界已有的蛋白质
通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；
②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程基本操作；
预期蛋白质功能
目的基因
蛋白质工程与基因工程的比较
安全与伦理问题
基因工程
[归纳提升]
争论焦点 反对者观点 赞成者观点
食物安全 ①担心出现滞后效应,担心出现新的过敏原,担心营养成分改变; ②担心会引发宗教信仰类争论 ①多环节、严谨的安全性评价,可以保证转基因食物的安全;
②尚未发现因食用转基因食物而影响人体健康的实例
转基因产品引发的安全性争论
生物安全 ①可能成为“入侵的外来物种”; ②可能重组出有害病原体; ③有可能使杂草成为除不掉的“超级杂草” ①转基因农作物生命力有限,扩散到种植区外,会很快死亡;
②要表现出被赋予的新性状,必须具有一定的条件和种植技术;
③由于生殖隔离,难以与其他植物杂交;
④花粉传播距离有限,存活时间有限
环境安全 ①打破物种原有界限,改变生态系统中能量流动和物质循环; ②重组的微生物可能造成二次污染; ③有毒蛋白或过敏蛋白可能通过食物链进入其他动物和人体内 ①转基因并不会改变生物原有的分类地位,不会破坏生态系统的稳定性;
②转基因抗虫作物的种植可减少农药的使用;
③抗除草剂作物的种植,可保护农田土壤环境
破坏生物的多样性
破坏生态系统内的生态平衡。
“沉默基因"
对生殖性克隆人研究的两种态度
观点 支持生殖性克隆人 反对生殖性克隆人
论据 ①是一项科学研究，有它自己内在的发展规律，社会应该允许科学家研究； ②虽然现在人们的伦理道德观念还不能接受这一切，但是人的观念是可以改变的； ①生殖性克隆人“有违人类尊严”；
②生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，严重地违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用；
③克隆技术还不成熟，生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题，与人类传统伦理道德是背道而驰的
2.中国政府对生殖性克隆人实验的四不原则
不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆实验。
生殖性克隆人破坏了人类基因多样性的天然属性,不利于人类的生存和进化。
试管动物
区别：在胚胎移植前进行特定基因的检测。
联系：二者都是体外受精,体外早期胚胎发育,再进行胚胎移植,从生殖方式上应为有性生殖。
进行基因编辑（基因的敲除或插入），有目的地改造特定基因，胚胎移植前需进行遗传诊断
设计完美婴儿
世界范围内应全面禁止生物武器
三、禁止生物武器
ACC合成酶是乙烯合成过程中的关键酶，由ACC合成酶基因(简称A基因)控制合成。将A基因反向连接在启动子和终止子间可构成反义ACC合成酶基因(A1基因)，转A1基因番茄的后熟过程变慢，利于番茄的储藏和运输。请回答：
（1）从番茄的果肉细胞中提取RNA， 利用RT-PCR获取A基因，即利用RNA和PCR技术获取目的基因。利用RT- PCR获取A基因所需要的酶主要有___________________。在A基因扩增过程中需要特定的引物，该引物的作用是_____________________________________________。
（2）S1和S2为A基因和A1基因的特异性启动子，S2在番茄果肉细胞内起作用，S1在除果肉细胞外的其他细胞内起作用。在构建转A1基因表达载体时，启动子应选择________。A1基因的表达元件包括启动子、终止子以及反向连接在两者之间的A基因，若用农杆菌转化法将此元件整合到番茄细胞的染色体DNA上，则应将此元件应构建在___________________中。
（3）在检测番茄细胞的染色体DNA上是否插入了A1基因时， __________(填“能”或“不能”)用放射性物质标记的A基因做探针进行检测，理由是____________________________。
（4）检测表明，与非转基因番茄相比，转A1基因番茄的果肉细胞内乙烯含量下降，机理是___________。
转基因番茄细胞中有A基因与A1基因，二者转录产生的 mRNA能杂交形成双链，导致ACC合成酶的合成受阻，从而使乙烯的合成量降低
逆转录酶、TaqDNA聚合酶
定位A基因的位置，与模板链结合并为子链的延伸提供起点（使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链）
S2 Ti质粒的T-DNA
不能 番茄细胞内含有A基因，无论是否插了A1基因都能与探针杂交形成杂交带
(2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是___________________________________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，
据此结果可推测， BCL11A蛋白结合位点位于___________________，理由是__________________________________________________________________
SalⅠ
EcoRⅠ
6
F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
F1～ F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
引物F4与F5在调控序
解析：据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhoⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhoⅠ所识别，故应该选用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，由图中可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ切割，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用TaqDNA聚合酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是TaqDNA聚合酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶。
解析：受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。
解析：向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白的结合位点在引物F4与引物R之间的序列上；含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
第二步、基因表达载体的构建
1.目的？
2.组成？
（1）什么是目的基因？ （2）标记基因的作用？
（3）启动子：①本质？②位置？③作用？诱导型启动子？
（4）终止子：①本质？②位置？③作用？
（5）复制原点的作用？
3.构建过程？ P80倒数第二段(3条)
4. 两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒，优势？
第三步、将目的基因（基因表达载体）导入受体细胞
1.转化的概念？
2.将目的基因导入受体细胞的方法、受体细胞？
常用原核生物做受体细胞的优点？
3.农杆菌转化法
（1）过程？（注意两次拼接、两次导入）（2）原理？
（3）目的基因插入染色体DNA上的目的是什么？
第四步、目的基因的检测与鉴定
一、检测与鉴定的目的？
二、分子水平检测什么？检测方法有哪些？
个体生物学水平的鉴定方法？
1.基因工程的基本操作程序？P76四步
2.基因工程操作环境？ 操作水平？ 原理？P67
3.不同生物DNA能够拼接的原理？
4.目的基因在受体细胞中表达出相同蛋白质的原理？
第一步、目的基因的筛选与获取
1.何为目的基因？P76
2.目的基因的获取方法？
3.cDNA是怎样形成的？
4.Bt基因表达出的Bt抗虫蛋白：杀死害虫的原理？不会对人畜有害的原理？P77右上角
5.PCR：名称、原理、仪器、条件、过程？
缓冲溶液中添加Mg2+的作用？
引物的作用？ DNA复制的方向？ 引物是什么？ 引物的种类？ 为何需要2种引物？
扩增n次需要多少个引物？
至少需经过几次循环才能分离得到所需要的DNA区段
鉴定PCR产物的方法 用PCR可以扩增mRNA吗？
3.2 基因工程的基本操作程序 P76-82
达标验收
1.概念？ ①基础？ ②操作方法及操作对象？ 操作水平？ ③结果？
2.地位？ 3.崛起的缘由？ 4.目标？ 5.为什么直接操作对象是基因？
6.蛋白质工程的基本思路P94？ 7. 蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要原因？P95最后
1.什么是基因工程菌？P91
2.将真核生物的基因导入原核生物的细胞，无法获得相应的蛋白质，原因？ 解决思路？
3. 乳腺生物反应器：
（1）怎样制备？P90最后一段
（2）为什么要将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？
（3）利用乳腺生物反应器生产蛋白质，有什么局限性？ （4）如何改进？
（5）乳腺生物反应器经有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗？
4.培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官：
（1）为什么可以用猪的器官解决人类器官移植的来源问题？
（2）利用转基因技术对猪的器官进行改造，培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，采用什么方法？
5.相比从天然产物中提取的酶，构建基因工程菌，然后用发酵技术生产酶，优势？P91最后一段
3.4 蛋白质工程 P93—95
达标验收
3.3 基因工程的应用 P87--91
达标验收

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