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高考生物 PCR 的过程及应用考点归纳总结
一、基础考点
1.名称：多聚酶链式反应
2.原理：DNA 双链复制（DNA 的半保留复制）、DNA 的热变性原理
3.前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列
4.过程：PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：会解释三个步骤
①变性：当温度上升到 90℃以上时，双链 DNA 解聚为单链
②复性：当温度下降到 50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合；
③延伸：当温度上升到 72℃左右时，溶液中的 4 种脱氧核苷酸再耐高温的 DNA
聚合酶的作用下，根据碱基互补配原则合成新的 DNA 链
④重复：第一轮循环的产物作为第二轮的模板：重复循环变性—复性--延伸三过
程。
5.PCR 反应体系的成分及作用
DNA 模板：从样本或细胞中提取的微量总 DNA
原料∶ dNTP（dATP、dGTP、dCTP、TTP），提供原料和能量
酶∶ Taq 聚合酶（热稳定 DNA 聚合酶，从嗜热菌中分离得到）
引物∶一小段能与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
（注意：引物与目的 DNA 片段两条母链各自的 3’端序列互补）
Mg2+：维持酶活性所必需
PCR 缓冲液∶维持 pH，保护 Taq 酶
6.DNA 在体内复制的条件
模板∶DNA 分子的每条链
酶∶ 解旋酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶
原料、能量∶dATP、dGTP、dCTP、dTTP
引物∶RNA 引物，温和的反应条件
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7.总结：PCR 与体内 DNA 分子复制的不同点：
PCR DNA 复制
复制起点 无 有
复制叉 无 有
场所及条件 体外； 体内细胞核、线粒体、叶绿体；
控制 3 个不同温度 温和条件
步骤 变性、退火、延伸 起始、延伸、终止
酶 Taq 酶 解旋酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶
引物 2种，一小段与 DNA 母链的 多种 RNA 做引物；自行合成
一段碱基序列互补配对的
短单链 DNA；人工合成
引物是否去除 否 是
变性的条件 90℃以上的高温 解旋酶
结果 短时间内快速扩增目的基 复制完整的 DNA 分子
因片段
特点
半保留复制 半保留复制
两条链连续合成 半不连续复制
8. PCR 技术在基因工程中的应用：
（1）特异性、快速扩增目的基因获取目的基因
（2）目的基因的检测与鉴定
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9. 用 PCR 技术可以扩增 mRNA 吗？
不可以；在逆转录酶的作用下，需以 mRNA 为模板按照碱基互补配对的原则合成
cDNA 再进行扩增
10. 提取 mRNA 扩增目的基因的过程：
第一步：逆转录酶以 RNA 为模板合成一条与 RNA 互补的 DNA 链，形成 RNA-DNA 杂
交分子
第二步：核酸酶 H降解 RNA-DNA 杂交分子中的 RNA 链，使之变成单链 DNA；
第三步：以单链 DNA 为模板，在 DNA 聚合酶的作用下合成另一条互补的 DNA 链，
形成双链 DNA 分子
第四步：以双链 DNA 分子为模板，经过③变性、④复性、⑤延伸，循环扩增形成
目的基因产物
11. cDNA 中缺少真核生物基因的哪些结构：
启动子、内含子、终止子
12.目前在 PCR 反应中使用 Taq 酶而不使用大肠杆菌 DNA 聚合酶的主要原因是：
Taq 酶热稳定性高，而大肠杆菌 DNA 聚合酶在高温下会失活
13. PCR 产物的影响因素：模板 DNA 的量、脱氧核苷酸的量、引物的量、酶的数
2+
量和活性、循环次数、Mg 的浓度
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14.PCR 后期，反应速率下降的原因：酶的活性降低、引物和 dNTP 浓度降低、反
应产物增多
15.变性温度过低会导致双链不能充分解开；
16：PCR 扩增中预变性的目的：
预变性破坏 DNA 中可能存在的较难破坏的二级结构。使 DNA 充分变性解旋为单链,有利
于引物与模板的正确结合
17.PCR 反应体系实际操作时，加入的是 4 种脱氧核苷三磷酸（dATP dGTP dCTP
dTTP）,每掺入一个核苷酸，伴随着两个特殊化学键（高能磷酸键）的断裂，由
此释放的能量满足核苷酸聚合反应的需求
18.内参蛋白的作用：排出细胞取样、实验操作等对实验结果的影响
（内参蛋白是用来确保蛋白上样量一致性，量化目的蛋白的表达情况，是对实验
结果定量分析或定性比较的重要标尺）
19.内参蛋白的选择：细胞内稳定存在和高表达的蛋白质
二、有关引物的考点总结：影响 PCR 的各种因素中，引物的设计最为重要
1.引物的作用：使 DNA 聚合酶能够从引物的 3′端开始延伸 DNA 链
2.需要引物的原因：DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，而只能从 3’端延伸 DNA
链，因此 DNA 的复制需要引物
3.设计两种引物的原因：基因的两条反向平行链都做模板，其碱基序列不同，且
DNA 聚合酶只能从 3’端延伸子链，用 2 种引物才能确保 DNA 两条链同时被扩增
4.需要大量引物的原因：子链是在引物的引导下合成的，引物随子链 DNA 数量的
增多而被消耗
n
5.需要引物的数量：（2 -1)×2
若扩增 4 次，共产生 16个 DNA 时，消耗 30 个引物。
6.PCR 扩增的产物的特异性：由引物的特异性决定；引物是根据目的基因两端的
核苷酸序列设计的
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例： PCR 技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是有一段已知干扰素
基因的核苷酸序列。
例：（2020山东高考）通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，
原因是________________________________________。
答案：引物是根据 Wx基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与 Wx基因的
cDNA 特异性结合）
7.两引物间固定长度(等长)的 DNA 序列在 PCR 扩增 3次后首先出现
8.复制方向:是沿子链 5’→3’，从引物的 3’端延伸子链
9.）如果需要在引物上加限制酶的识别序列： 需要在引物的 5’加
10.在引物的 5’端设计两种限时酶识别序列的原因：便于目的基因和载体的定向
正确连接
注：
（1）引物的 5'端可以修饰，引物的 5' 端决定着 PCR 产物的长度，它对扩增特
异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5'端修饰包括：
加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子
序列等。
（2）引物的 3'端不可修饰；引物的延伸是从 3'端开始的，不能进行任何修饰。
11.设计引物时，引物自身不能有碱基互补配对的序列：避免引物自连，不能得
到目的产物
12.设计引物时，两引物之间不能有碱基互补配对的序列：防止两引物之间结合
形成双链，降低引物与 DNA 模板链结合的效率
13.引物设计不能太短：防止非目的基因的获得
例：为方便构建重组质粒，设计引物时需要增加适当的_________位点。设计引
物时需要避免引物之间形成_______________________，而造成引物自连。
(答案：限制酶 碱基互补配对)
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例：为便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的_______端加上限制性
酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是
_____________________________________________。
，
（答案：5 使 DNA 片段能定向插入表达载体，减少自连）
14.复性的温度取决于：引物的长度、碱基组成、浓度及靶基因序列的长度。如
果引物中 GC含量较高，可适当提高退火温度
15.复性温度过高，得不到产物的原因：引物不能稳定的与模板结合
16.延伸温度过高不利于引物与模板链的结合；
17.延伸的时间根据待扩增片段长度而定，延伸时间过长会导致非特异性扩增。
例：进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中____
的设定与引物有关，____的设定与扩增片段的长度有关。
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度
④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间
答案：② ⑥
18.退火温度过高会导致引物不能充分与模板链结合，导致目标产物的量减少
三、PCR 技术与电泳技术结合的相关考点总结：选择性必修三 P84
1.方法：琼脂糖凝胶电泳—鉴定并分离 DNA
2.原理：DNA 具有可解离的基团，在一定的 PH 下，这些基团可以带上正电荷或负
电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动
3.迁移速率的影响因素：凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象
（1）凝胶浓度：凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越
小，DNA 迁移受到的阻力越大，速率越慢，离点样孔越近；根据分离 DNA 片段的
大小，用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液，浓度 0.8%-1.2%（琼脂糖溶液加热融化、
冷却后加核酸染料）。
（2）DNA 分子的大小：DNA 的分子量越大，迁移速率越慢，离点样孔越近
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（3）DNA 分子的构象：
具有三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序：环形超螺旋>线形>开环；
环形超螺旋（DNA 两条链都是完整的质粒，就是超螺旋），结构紧致，受到的阻力
小，迁移速率最快；完全断裂的线性 DNA，迁移速率次之；环形松弛（DNA 双链
断了一条，质粒 DNA 就失去超螺旋，成为松弛的环），迁移速率最慢
4.仪器：PCR 仪、微量离心管、微量可调移液器、电泳装置（电泳仪、水
平电泳槽等）
试剂：购买的 PCR 试剂盒、配方参考教材或试剂盒说明书
电泳试剂：电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖、核酸染料等
5.步骤及注意事项：
★步骤：
1.用微量移液器按照右栏中的配方活 PCR 试剂盒的说明书，在微量离心管中依次
加入各种组分。
PCR 反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液 5μL
20mmol/L 的 4 种脱氧核苷酸的等量混合液 1μL
20mmol/L 引物Ⅰ 2.5μL
20mmol/L 引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28~33μL
1~5U/μL 的 TaqDNA 聚合酶 1~2U
模板 DNA 5~10μL
总体积 50μL
注：模板 DNA 的用量为 1pg~1μg
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2.待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机，离心约
10s，使反应液几种在管的底部
3.按照下表的参数，设置好 PCR 仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入
PCR 仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min / /
30 次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后 1 次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
4.根据待分离的 DNA 片段的大小，用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液，一般配置质量
体积比为 0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍
冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
5.将温热的琼脂糖溶液迅速导入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
6.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
7.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶 1mm 为宜。
8.将扩增得到的 PCR 产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液
器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参
照物。
9.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一半 1～5V/cm。待
指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
10.观察电泳鉴定结果：取出凝胶至于波长为 300_nm 的紫外灯下观察并照相。
★注意事项：
1.为避免外源 DNA 等因素的污染，PCR 实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等
在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃
储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
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3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必
须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
★结果分析：
一次性成功的 DNA 片段扩增应该产生与预期大小一致的 DNA 片段。若出现与预期
不一致的结果，可尝试从以下几个方面进行分析：模板 DNA 的制备、引物的质量
与特异性、酶的质量以及 PCR 循环的条件。
1.未出现扩增条带的原因：
（1）模板：模板 DNA 含有杂蛋白或 Taq 酶的抑制剂、模板 DNA 污染。
若反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Taq 酶以前，将反应体系 95 ℃
加热 5~10 分钟。
（2）酶：Taq 酶失活或在反应体系中未加入酶。
（3）引物：引物特异性不强，浓度不合适。检查引物特异性或重新设计引物；
引物浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
（4）变性温度是否准确：过高酶在前几个循环就迅速失活；变性温度低，变性
时间短则模板变性不彻底。
（5）Mg2+浓度过低，扩增的产物过少；
（6）4种 dNTP 浓度过低，扩增的产物过少；
（7）目的序列变异
2.扩增产物出现多条带（杂带）的原因：
（1）模板：模板 DNA 污染。确保操作的洁净。
（2）酶：酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
（3）引物：引物用量偏大，引物的特异性不高，或形成引物二聚体，特别是引
物的 3′短互补，易形成引物二聚体，产生非特异性扩增条带；
（4）复性温度偏低，复性及延伸时间偏长：应提高复性温度，减少变性与延伸
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时间
（5）Mg2+浓度过高，反应特异性降低，会引发非特异性扩增
（6）4 种 dNTP 浓度不相等：任意一种浓度过高或过低，都会引发错配，扩增的
产物过少；
（7）循环次数过多
（8）延伸时间过长会导致非特异性扩增
★对照的作用：
阳性对照：用于检测PCR体系是否正确及扩增效率，确保不是 DNA 凝胶和 PCR 程
序的问题
阴性对照：用于检测是否存在含有目的序列的 DNA 污染
阴性对照出现条带：试剂，枪头，工作台污染。
四、DNA 片段的扩增及电泳鉴定实验的问题串
1.PCR 扩增的原理：
2．DNA 分子带电的原因：
3. DNA 在电场中的移动方向：
4.PCR 产物鉴定方法：
5.凝胶中 DNA 分子迁移速率的影响因素：
6.凝胶中 DNA 用什么染色：
7.凝胶中 DNA 的检测：
8.实验器材、试剂：
9.PCR 反应体系的配方：
加入的顺序：
10.各种组分加入什么器材中？操作时应注意什么？
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11．依据什么配置琼脂糖溶液？用什么配置琼脂糖溶液？体积比一半为多少？
12.配置好的琼脂糖如何操作？能否加热后直接加入核酸染料？
13.向模具中倒琼脂糖的注意事项？如何制作加样孔？
14.什么时候拔出梳子？凝胶制备成功后放入什么溶液中？
15．电泳槽中的液体是什么？深度如何？
16.加样孔中加什么？用什么仪器加入？注意什么？能否将所有的加样孔都加
满？
17.标准参照物是什么：
18.根据什么设定电压？一般为多少？什么时候停止电泳？
19．取出凝胶后如何观察：
20．PCR 使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等如何处理？目的是什么？
21.缓冲液和酶应该如何储存？使用前如何操作？
22.向离心管中添加组分时，移液器的枪头是否需要更换？是否吸取一次后就更
换？
23.操作时，手部如何处理？
五、判断
1.在溶有 DNA 的 NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色( )
2.DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精( )
3.进行 DNA 片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在
20 ℃储存( )
4.在凝胶中 DNA 分子的迁移速率只与 DNA 分子的大小相关( )
5.为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换( )
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6.PCR 所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化（ ）
7.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动（ ）
答案：×√×××××
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