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(共33张PPT)
PCR微专题
1、RT-PCR
RT(reverse transcription)-PCR即反转录 ·聚合酶链反应，是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩
增 （PCR） 相结合的技术
RNA单链 DNA单链
RNA逆转录
SARS-CoV-2
RNA单链
逆转录酶
DNA单链 DNA单链
DNA聚合酶
DNA单链
cDNA扩增
2、实时(realtime)荧光定量PCR——rRTPCR
反向引物
R
正向引物
Q
反向引物
正向引物
Q
R
步骤3·探针被切断
步骤4·聚合完成
反向引物
报告(荧光)基团
淬灭基团
Q
R
正向引物
Q
R
步骤1·聚合
反向引物
正向引物
Q
R
步骤2·链取代
2019-nCoV 核酸检测
优点：早期诊断、灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据。
rRT-PCR可以分两部分来看，其中r代表实时（real-time），主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。 ；RT表示逆转录（reverse transcription）。在RT-PCR中，通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。
2、实时(realtime)荧光定量PCR——rRTPCR
“实时荧光定量RT—PCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在l~2h内即可得到检测结果。TaqMan探针是实时荧光定量RT—PCR技术中一种常用探针（如图1），其5末端连接荧光基团（R）,3末端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回答：
习题精练
（1）这种分子层面的荧光RT—PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的 、 有关。
（2）新冠病毒（nCoV-2019）是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，但nCoV-2019有部分特有序列，那么实时荧光定量RT—PCR中引物、 TaqMan探针中碱基序列的设计应主要依据 ，以避免假阳性的出现。
引物
TaqMan探针
nCoV-2019特有序列
习题精练
（3）在实时荧光定量RT—PCR过程中，通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图（如下图）。最初数个循环里，荧光信号变化不大，设置为基线;之后进入指数增长期，在这个时期设置一个荧光阈值线;CT值是PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，则CT值越小，起始模板量越 .
从而实现对起始模板的相对定量分析。若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度（Rn）主要与 、 有关。
指数扩增期
平台期
大
扩增次数
病毒RNA初始数量
习题精练
变式2　(2022·扬州考前模拟节选)新冠病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(见图甲)，通过实时荧光PCR检测新冠病毒感染时，检测到的荧光强度变化见图乙。
甲　　　　　　　　　　　乙
习题精练
(1)与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因有__________________________________________________________。
(2)Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就________。
(3)某新冠病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct＞40或无Ct值判定为阴性。图乙所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为________。
(4)阴性结果也不能排除新冠病毒感染。可能产生假阴性的因素有_______。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值
b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解
c．病毒发生变异
TaqDNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降　
越小　
阳性　
abc　
习题精练
(2022·扬州市高三期中)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是(　　)
习题精练(学案3.2第二课时）
A．做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒D．病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交
与新型冠状病毒相关的实验室检测技术，对新型冠状病毒的诊断与防控尤为重要。新型冠状病毒检测最常见的方法是荧光定量RT－PCR(逆转录聚合酶链式反应)，RT—PCR的具体过程如下图。回答下列问题。(1)过程Ⅰ和Ⅱ都需要加入缓冲液、原料、酶和引物等，其中加入的酶分别是　　、
　　　　　　　。(2)RT－PCR过程通过对　　　　　　　　的控制影响酶的活性和DNA分子结构，从而使得整个反应过程有序地进行。(3)过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要　　　　　　　　个引物B。(4)新型冠状病毒的检测方法还可采用病毒抗原检测、病毒抗体检测，这些检测方法的原理是________________________________。检测到新冠病毒感染者抗体的时间滞后于病毒核酸和抗原的理由是　　　　　　　　　　　，因此　　检测对传染性极高的新型冠状病毒疑似患者早期确诊意义不大。
习题精练(学案3.2第二课时）
3、反向PCR
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制性内切核酸酶剪切该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。
3、反向PCR
(2022·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图所示(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种_________________酶它通过识别特定的______________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成____________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得___________；Taq DNA聚合酶的作用是催化_____________________________________________。
习题精练
限制　
核苷酸序列　
磷酸二酯键　
以DNA为模板的DNA链的延伸　
DNA单链　
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
②④　
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′
②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′
③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′
④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′
习题精练
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是_____。
A．5′—AACTATGCG…AGCCCTT—3′
B．5′—AATTCCATG…CTGAATT—3′
C．5′—GCAATGCGT…TCGGGAA—3′
D．5′—TTGATACGC…CGAGTAC—3′
B　
习题精练
引物的选择或设计类问题的解决
(1)一定要知道的原则：引物延伸的方向是不变的，子链一定从5′端向3′端延伸。
(2)具体操作：
①沿着引物的方向确定模板DNA；
②确定引物延伸得到的目标DNA；
③找到引物与模板DNA的结合位置；
④引物一定是模板链的互补链，且方向一定是从5′端→3′端。
审 答 指 导
4、点突变技术——重叠延伸PCR
4、点突变技术——重叠延伸PCR
该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
4、点突变技术——重叠延伸PCR
(1)已知t-PA蛋白第84位半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点表示突变部位的碱基，引物b中该部位的碱基是 ，引物C该部位的碱基是 。 PCR中需要引物的原因是 。
（2）重叠延伸PCR中，PCR1和PCR2分别进行，产物混合后再进行PCR3。 PCR1和PCR2需要分别进行的原因是 。
G
C
DNA聚合酶只能从3‘端延伸DNA链
引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效
习题精练
人体内的t-PA蛋白蛋白能高效降解血栓,但大剂量使用会诱发颅内出血。如果将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显地能显著降低出血副作用。下图是通过重叠延伸PCR技术获取t-PA改良基因的过程。（图中重叠延伸PCR过程中，引物a、b用来扩增含有突变位点的上游DNA序列，引物c、d用来扩增含突变位点的下游DNA序列)。请回答：
（3）构建重组质粒时，选用的限制酶是 。重组质粒中的新霉素抗性基因的作用是 。
（4）在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，需选择呈 色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t-PA蛋白的工程菌株。上述生产改良t-PA蛋白的技术属于 工程。
XmaⅠ和BglⅡ
便于将导入质粒的大肠杆菌筛选出来
蛋白质
白
习题精练
7、利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析正确的是（多选）(　　)A．PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果B．引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基C．①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却至50 ℃左右D．②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD
习题精练(学案3.2第二课时）
ABC　
5、点突变技术——大引物PCR
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。
5、点突变技术——大引物PCR
IKK激酶由IKKα、 IKKβ、 IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKKB基因编码区第1183位碱基T突变为C，导致IKKBβ上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠，主要过程如下图所示，分析回答：
习题精练
（1）在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物：
引物A：5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3'（下划线字母为突变碱基）
引物B：5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'（下划线部分为限制酶Hind Ⅲ识别序列）
引物C：5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'（下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列）
则PCR1中使用的引物有__________________，PCR2中使用的引物有_____________和图中大引物的_______（①/②）链。
（2）在PCR反应体系中，需要加入引物和IKKB基因外，
还需要加入 等。PCR中尽可能提高退火温度以减少 。
引物A和引物C
引物B
②
Taq聚合酶、4种脱氧核苷酸
非目标基因的获得
习题精练
(4)科学家运用大引物 PCR 定点突变技术对胰岛素第 28 位氨基酸实现了替换，获得了速效胰岛素类似物产品。相关原理如图所示：
①第一次 PCR 至少需要 个循环才能获得相应的大引物模板，第二次 PCR 应选用大引物两条链中的 （填“A”或“B”），若第二次 PCR 计划循环 n次，至少需要大引物 个。
习题精练(周测)
2
B
2n-1
习题精讲
树突状细胞是功能最强的专职抗原呈递细胞，能有效激活初始T细胞。S靶向蛋白是一种非天然蛋白，能向树突状细胞的FcγRI受体，从面高效启动免疫应答。科研人员设计并合成了S靶向蛋白基因，经过转导，构建CHO K1工程细胞以大量生产S靶向蛋白。接着将S靶向蛋白与具有多表位的肿瘤抗原相交联，制成靶向树突状细胞的结肠癌肿瘤疫苗。该技术预期可大幅提高疫苗的效价。过程如下图所示：
回答下列问题：(1)图中①②③④⑤所示的步骤属于 工程的主要环节。(2)②过程为避免目的基因的反向连接，对限制酶的使用要求是 。③过程导入重组表达载体通常采用的方法是 。⑤过程需要控制的条件有 。（写出两点即可）
蛋白质
用两种能产生不同黏性末端的限制酶切割目的基因
显微注射法
适宜的温度和pH
习题精讲
树突状细胞是功能最强的专职抗原呈递细胞，能有效激活初始T细胞。S靶向蛋白是一种非天然蛋白，能向树突状细胞的FcγRI受体，从面高效启动免疫应答。科研人员设计并合成了S靶向蛋白基因，经过转导，构建CHO K1工程细胞以大量生产S靶向蛋白。接着将S靶向蛋白与具有多表位的肿瘤抗原相交联，制成靶向树突状细胞的结肠癌肿瘤疫苗。该技术预期可大幅提高疫苗的效价。过程如下图所示：
(3)④过程需要一定数量的S靶向蛋白基因探针，该探针可用PCR技术生产。在PCR体系中，S靶向蛋白基因的数量为b个，上游引物数∶下游引物数=1∶50。该体系扩增进行5轮循环后，上游引物刚好耗尽，则上游引物的数量等于 条。在此基础上，若再进行30轮循环扩增，此过程可生产出具有下游引物序列的单链探针数量是 条。
6、DNA单链（探针）的扩增——不对称PCR
（节选）(3)④过程需要一定数量的S靶向蛋白基因探针，该探针可用PCR技术生产。在PCR体系中，S靶向蛋白基因的数量为b个，上游引物数∶下游引物数=1∶50。该体系扩增进行5轮循环后，上游引物刚好耗尽，则上游引物的数量等于 条。在此基础上，若再进行30轮循环扩增，此过程可生产出具有下游引物序列的单链探针数量是 条。
31b
960b
习题精讲
树突状细胞是功能最强的专职抗原呈递细胞，能有效激活初始T细胞。S靶向蛋白是一种非天然蛋白，能向树突状细胞的FcγRI受体，从面高效启动免疫应答。科研人员设计并合成了S靶向蛋白基因，经过转导，构建CHO K1工程细胞以大量生产S靶向蛋白。接着将S靶向蛋白与具有多表位的肿瘤抗原相交联，制成靶向树突状细胞的结肠癌肿瘤疫苗。该技术预期可大幅提高疫苗的效价。过程如下图所示：
(4)给结肠癌小鼠注射疫苗后，预期⑥过程后续的免疫应答反应是 ，
以高效杀伤癌细胞。该技术给我们的启示是靶向蛋白还可应用于 。
初始T细胞迅速增殖分化产生大量效
应T细胞（或产生更强烈的细胞免疫）
制备“生物导弹”治疗癌症等疾病、开发其他抗肿瘤疫苗
不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1：50～1：100，在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板DNA，最初10个循环扩增产生双链DNA，后20个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物 __________ 个，需要非限制性引物 ____________________ 个。因为双链DNA和单链DNA的 ______________________________ 不同，可通过电泳方法将其分离。
（210-1）a
（ 21 210-1）a
相对分子质量（碱基数量）
6、DNA单链（探针）的扩增——不对称PCR

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