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第一章 第2节 微生物的培养技术及应用
第2课时：微生物的选择培养和计数
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生 物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢?
1
选择培养基
2
微生物的选择培养
目 录
二、微生物的的选择培养和计算
3
微生物的数量测定
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
4
选择培养基
一
寻找耐高温的DNA聚合酶
科学实例
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
寻找耐高温的DNA聚合酶
科学实例
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）
美国黄石国家公园
寻找耐高温的DNA聚合酶
科学实例
筛选水生栖热菌的条件是什么？为什么该条件能让其“ 脱颖而出”?
你还知道哪些条件能影响微生物的生存？
因为热泉温度为70～80℃，淘汰了绝大多数微生物，只有水生栖热菌被筛选出来。
pH和氧气浓度等；
常用的消毒和灭菌方法——消毒
资料卡
在实验室中选择培养特定的微生物有什么启示?
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
选择培养基配方的设计
思考?讨论
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3
脲酶
尿素分子模型
选择培养基配方的设计
思考?讨论
1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖。
见P18页培养基配方
该培养基与普通培养基相比较，共同点是都以有机碳（如葡萄糖）作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。
过渡
通过以上事实分析，请你总结选择培养基的概念！
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
一、选择培养基
不加氮源
自养微生物
酵母菌和霉菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)
固氮微生物
加入青霉素
加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
石油是唯一碳源
能消除石油污染的微生物
不加碳源
过渡
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌,仅有选择培养基能实现吗？
微生物的选择培养
二
通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中的一部分。
如何把能分解尿素的细菌从众多细菌中挑选出来?可否直接制备土壤溶液，接种到选择培养基上进行培养?
不能。因为土壤中的微生物非常多,必须要经过稀释才能接种到培养基上。
二、微生物的选择培养
【自主探究】请结合教材17-18页，思考以下问题：
１.简述稀释凃布平板法的操作步骤?
２.与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可用于细菌计数？
任务一
二、微生物的选择培养
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
10g
（1）样品的稀释（梯度稀释菌液）
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
①铲取土壤，将样品装入纸袋中
1.稀释凃布平板法
在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
微量移液器
1.稀释凃布平板法
（2）稀释涂布平板法操作
待涂布的菌液被培养基吸收
将平板倒置
30～37℃恒温培养1～2d后进行计数
1.稀释凃布平板法
（2）稀释涂布平板法操作
平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
1.稀释凃布平板法
平板划线法
稀释涂布平板法
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体平板培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释
②涂布平板法操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保试验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
微生物的数量测定
三
稀释涂布平板法
显微镜进行直接计数
三、微生物的数量测定
１.稀释涂布平板法进行计数的原理是什么？为什么可以用于细菌的计数？
２.稀释涂布平板法进行计数有什么注意事项？
３.通过稀释涂布平板法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗 ？
４.用显微镜进行直接计数方法统计的细菌的数目与它的实的际数目相同吗?
任务二
【自主探究】请结合教材18页，思考以下问题：
1.间接计数法—稀释涂布平板法
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(1)原理：
稀释涂布平板法计数的原理是什么？为什么可用于细菌计数？
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
(2)计数原则:
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
稀释涂布平板法进行计数的原则是什么？
稀释106倍
1.间接计数法—稀释涂布平板法
统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或 多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
通过此方法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗 ？
(3)计数特点:
1.间接计数法—稀释涂布平板法
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
例2：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
(4)计算公式:
1.间接计数法—稀释涂布平板法
镜检计数
除上述的活菌计数外，利用显微镜进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板
显微镜直接计数
相关信息
细菌计数板和血细胞计数板的计数原理相同。血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
细菌计数板或血细胞计数板有什么区别
显微镜直接计数
相关信息
盖上盖玻片的示意图
1.血细胞计数板
计数室长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm3,即0.1μL。
显微镜直接计数
知识●回顾
大方格:
中方格
小方格
25（中格）×16（小格）
不管计数室是哪一种构造，其每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。
每个大方格的容积为0.1 mm3，即0.1 μL。
16（中格）×25（小格）
显微镜直接计数
知识●回顾
1.血细胞计数板
=
80
×400×104×稀释倍数
A1+A2+A3+A4+A5
1mL样品中酵母菌数=
A1+A2+A3+A4+A5
80
×400÷0.1mm3×稀释倍数
A1、A2、A3、A4、A5分别为五个中方格中的酵母菌数。
25×16型
A1
A2
A3
A4
A5
1mm3=10-3mL
显微镜直接计数
知识●回顾
2.计数公式：
=
100
×400×104×稀释倍数
A1+A2+A3+A4
16×25型
A1
A2
A4
A3
1mL样品中酵母菌数=
A1、A2、A3、A4分别为四个中方格中的酵母菌数。
A1+A2+A3+A4
100
×400÷0.1mm3×稀释倍数
1mm3=10-3mL
显微镜直接计数
知识●回顾
2.计数公式：
2.直接计数—计数板计数法
不能区分死菌与活菌，比实际值偏大
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
(1)原理：
(2)缺点：
利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
{7DF18680-E054-41AD-8BC1-D1AEF772440D}内容
直接计数法
间接计数法
主要用具
显微镜、细菌计数板或血细胞计数板
涂布器
计数依据
细菌个数
培养基上菌落数
优点
计数方便、操作简单
计数的是活菌
计算公式
每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数
每克样品中的菌株数:(C÷V)×M
　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数
缺点
不能区分死菌与活菌
当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
结果
比实际值偏大
比实际值偏小
微生物的计数方法比较
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
四
三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1. 小组合作，设计“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的探究方案。
2.阅读教材第19页中的3个资料，对设计的方案进行修订并总结实验流程。
任务三
【自主探究】请结合教材18页“探究·实践”，思考以下问题：
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
1.提出问题：
通过对土样进行充分稀释，再将菌液涂布到制备好的培养基上，即可得到能分解尿素的细菌的纯培养物。
土壤中有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？并研究1g土壤样品中含有多少这样的细菌？
2.纯化原理：
3.基础知识：
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
视频：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}葡萄糖
10.0g
尿素
1.0g
KH2PO4
1.4g
Na2HPO4
2.1g
MgSO4·7H2O
0.2g
琼脂
15.0g
蒸馏水
1000ml
①制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
提供无机盐；调节pH
②制备牛肉膏蛋白胨培养基
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
测细菌数：一般用104、105、106稀释液。
测放线菌：一般用103、104、105稀释液。
测真菌数：一般用102、103、104稀释液。
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
B
A
C
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
①每个浓度至少设置4个平板
选择培养基（平行重复）
牛肉膏蛋白胨培养基
②本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。
例：标记注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
接种：稀释液涂布平板法
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏蛋白胨培养基
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
判断选择培养基是否具有筛选作用
③设置两个空白对照：
以验证培养基中是否含有杂菌
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
通用型培养基上所有菌种都生长
选择培养基上部分菌种才能生长
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
①不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
②每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录
作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}稀释度
104
105
106
107
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
菌落数/平板
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数:
5.结果分析与评价
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}内容
现象
结论
有无杂菌污染的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
选择培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高
培养基中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作
得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
混合样品
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
6.进一步探究
在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究?实践
6.进一步探究
鉴别培养基
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
本节小结
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
√
√
√
教材课后习题·概念检测
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
教材课后习题·概念检测
1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。
①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养
②创造无氧环境进行培养
教材课后习题·拓展应用
2.请回答下列问题。
（2）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤
纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
可行，这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
（1）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
教材课后习题·拓展应用
谢
谢
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