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(共33张PPT)
本节看点
1. 理解凝胶电泳与凝胶色谱技术的原理及应用
01.凝胶电泳与色谱
02.固定化技术
03.DNA粗提与鉴定
04.有效成分提取
DNA分子结构
蛋白质带电性质的特殊性
不同蛋白质带电不均匀
- 电荷
+ 电荷
羧基(COO- )
氨基(NH3+)
R基
SDS对蛋白质的影响
SDS(十二烷基硫酸钠)
SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物， SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小
凝胶电泳
不同DNA/蛋白质的形状 、大小 、带电性质和电量不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致其在电场中的运动方向和运动速度不同
琼脂糖凝胶
空隙较大，常用于分离DNA
对DNA而言，其相对分子质量越小受电场刺激在琼脂糖凝胶中运动速率越快
聚丙烯酰胺凝胶
空隙较小，常用于分离蛋白质
凝胶电泳
不同DNA/蛋白质的形状 、大小 、带电性质和电量不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致其在电场中的运动方向和运动速度不同
一列一样品，同行同物质
分子质量小，运动速率快
凝胶色谱
原理：不同大小的蛋白质通过凝胶颗粒时路程不同，所需时间不同
注意事项： 需要使用缓冲液
结果： 分离不同相对分子质量蛋白质，并保留其蛋白活性
交联葡聚糖凝胶（G-75）
”G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分
离范围。75表示凝胶的得水值，即每克
凝胶膨胀时吸水7.5克
凝胶颗粒
血红蛋白
血红蛋白结构： 包含两个α-肽链；两个β-肽链；四个血红素基团，每个肽链环绕—个血红素基团，血红蛋白 因含有血红素而呈红色。
功能： 此基团可携带—分子O2或—分子CO2
应用： 镰刀形细胞贫血症即因为β-肽链对应基因突变引起结构改变导致。
血红蛋白的提取与分离
血红蛋白结构： 包含两个α-肽链；两个β-肽链；四个血红素基团，每个肽链环绕—个血红素基团，血红蛋白 因含有血红素而呈红色。
功能： 此基团可携带—分子O2或—分子CO2
应用： 镰刀形细胞贫血症即因为β-肽链对应基因突变引起结构改变导致。
①样品处理：红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液。
②粗分离 （透析法） ：除去样品中相对分子质量较小的杂质。
③纯化： —般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。 （有活性）
④纯度鉴定： —般用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蛋白质的相对分子质量，即对血红蛋白进行纯度 鉴定。 （已变性失活）
血红蛋白的提取与分离
(1)红细胞的洗涤：
1. 目的：去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯 化，洗涤次数不可过少
2. 操作：
①采集血样，加入抗凝剂
②低速短时间离心 （速度越高和时间越长，会使白
细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）
③吸取血浆：除去上层透明的黄色血浆。
④盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤
⑤低速离心（低速短时间）
⑥重复4 、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色， 表明洗涤干净。
注意：
由于渗透压的维持，此时红细胞完整有活性
血小板
(约4%)
红细胞
(约41%)
血浆(约55%)
血红蛋白的提取与分离
(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40%体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂），细胞破裂释放出血红蛋白
(3)分离血红蛋白溶液：
1. 过程： 将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min
2. 试管中溶液层次：
第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）
第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）
第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）
第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）
用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置
③分离： 静置片刻后，分出下层的红色透明液体
有机溶剂(甲苯)
脂类物质
血红蛋白溶液
红细胞破碎物沉淀
血红蛋白的提取与分离
(4)透析：
1. 过程： 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0） ，透析12小时。
2. 目的：除去样品中分子量较小的杂质。
3. 原理： 透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。
透析装置和透析过程示意图
本节看点
1. 了解加酶洗衣粉的原理及效果
2. 理解固定化酶技术及固定化细胞技术
01.凝胶电泳与色谱
02.固定化技术
03.DNA粗提与鉴定
04.有效成分提取
酶的应用——果胶酶与加酶洗衣粉
种类 洗涤原理
洗涤实例
(碱性)蛋白酶 蛋白质——→小分子肽+氨基酸
血渍、奶渍及各种食品类的蛋白质污垢
(碱性)脂肪酶 脂肪——→甘油 +脂肪酸
油渍、人体皮脂、口红
淀粉酶 淀粉——→麦芽糖
来自面条、巧克力等的污垢
纤维素酶 使纤维的结构变得蓬松
使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触
纤维素酶不能分解纤维素，只是使纤维素变的蓬松，所以不用担心纤维素酶把棉质衣服洗烂 不可洗涤丝绸、羊毛类
固定化酶
固定化酶技术，即将酶固定在一定空间的技术（固定在不溶于水的载体上）
优点： 酶与反应物接触并分离，固定在载体上的酶可重复利用
缺点：专一性 （酶种类及功能单一）
固定化酶
利用物理或化学方法将细胞固定在一定空间的技术
细胞中含有一系列的酶，在细胞正常的生命活动过程中，通过代谢产生所需要的代谢产物
包埋法
物理吸附法
将酶或细胞吸附在载体表面
化学结合法
将酶或细胞相互连接
固定化细胞常用
固定化酶常用
包埋在细微网格中
每个网格中
只有一个酶或一个细胞
固定化细胞
活化：让处于休眠状态的微生物
重新恢复正常的生活状态
本质：加快新陈代谢
方法：加适量的温水
酵母细胞活化
固定化细胞
活化：让处于休眠状态的微生物
重新恢复正常的生活状态
本质：加快新陈代谢
方法：加适量的温水
酵母细胞活化
凝固剂配制
配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液
固定化细胞
活化：让处于休眠状态的微生物
重新恢复正常的生活状态
本质：加快新陈代谢
方法：加适量的温水
酵母细胞活化
凝固剂配制
称取0.7g海藻酸钠，放入50ml小烧杯中，加入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌
将海藻酸钠调成糊状，直至完全融化，用蒸馏水定容至10ml
注意：
①加热用小火，或间断加热，反复几次，直到 海藻酸钠融化为止
②如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠 ③如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包 埋的酵母细胞数目少，影响实验结果
包埋剂配制
常用不溶于水的包埋载体(包埋剂)包括：
明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺
固定化细胞
活化：让处于休眠状态的微生物
重新恢复正常的生活状态
本质：加快新陈代谢
方法：加适量的温水
酵母细胞活化
凝固剂配制
包埋剂配制
混合
将溶化好的海藻酸钠冷却至室温
加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌
混合均匀后再转移到注射器中
固定化细胞
活化：让处于休眠状态的微生物
重新恢复正常的生活状态
本质：加快新陈代谢
方法：加适量的温水
酵母细胞活化
凝固剂配制
包埋剂配制
混合
固定化酵母细胞
以恒定速度（保证大小 致）缓慢将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2 中 观察液滴在CaCl2 中形成凝胶珠的情形，再将这些凝胶珠在CaCl2 中溶液中浸泡30min。刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定结构
检测凝胶珠的质量：
①用镊子夹起一个凝胶珠用手挤压，凝胶珠应不易破裂，没有液体流出
②在实验桌上用力摔打凝胶珠，凝胶珠应很容易弹起
固定化细胞
活化：让处于休眠状态的微生物
重新恢复正常的生活状态
本质：加快新陈代谢
方法：加适量的温水
酵母细胞活化
凝固剂配制
包埋剂配制
混合
固定化酵母细胞
类型 优点
缺点
直接使用酶 催化效率高 低能耗、低污染
对环境条件非常敏感，容易失活 溶液中酶很难回收，不能再次利用 反应后酶混合在产物中，影响质量
固定化酶 酶既能与反应物接触又能与反应物分离 固定在载体上的酶还可以反复利用
一种酶只能催化一种或一类反应
生产实践中产物往往通过一系列酶促反应获得
固定化细胞 成本低，操作更容易
固定化后不容易接触反应物
可能导致反应速率下降
本节看点
1. 理解DNA粗提的机理
2. 掌握DNA的鉴定方式
01.凝胶电泳与色谱
02.固定化技术
03.DNA粗提与鉴定
04.有效成分提取
DNA的粗提与鉴定
步骤 操作
图示
1.提取鸡血细胞 的细胞核物质 将制备好的鸡血细胞液（已在课前配好） 5~10mL，注入到50ml烧杯中。 向烧杯中加入 蒸馏水 20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后， 用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL的烧杯中，取其滤液。
2.溶解细胞核内 的DNA 将物质的量浓度为2mol／L的NaCl溶液40 mL 加入到滤液中，并作玻璃棒沿一个方向搅拌1min， 使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。 0.14mol/L NaCl浓度
3.析出含DNA 的粘稠物 沿烧杯内壁缓缓加入 蒸馏水 ，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌， 这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越 多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。
DNA溶解度
DNA的粗提与鉴定
步骤 操作
图示
4.滤取含DNA 的粘稠物 用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000 mL的烧杯中。取纱布上的黏稠物。
5.将DNA的粘 稠物再溶解 取一个50 mL烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为 2mol／L的NaCl溶液 20 mL 。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl溶液中，用玻璃棒沿一个方 向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。
6.过滤含DNA 的氯化钠溶液 取一个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液 （DNA溶于滤液中）。
DNA的粗提与鉴定
步骤 操作
图示
7.提取含杂质较 少的DNA 在上述滤过的溶液中，加入 冷却的、体积分数为95％的酒精溶液 50 mL （加入时动作要慢），并作用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质 较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加 时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。
8、DNA的鉴定 取两支20 mL的试管，各加入物质的量浓度为0.015mol／L的NaCl溶液 5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后， 向两支试管中各加入4 mL的二苯胺 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中 加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。 在沸水浴条件下， DNA遇二苯胺冷却后会体现为蓝色
本节看点
1. 理解植物有效成分提取的不同方式
2. 正确选择植物有效成分的提取方式
3. 掌握纸层析法对胡萝卜素的鉴定的方式
01.凝胶电泳与色谱
02.固定化技术
03.DNA粗提与鉴定
04.有效成分提取
蒸馏法提取玫瑰精油
蒸馏法： 利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后混合物重新分开，形成油层和水层。根据蒸馏形式分为水气蒸馏法 （通气） 、水中蒸馏法 （煮純） 和水上蒸馏法 （包子）
优缺点：简便易行，但容易发生原料焦糊和有效成分水解
先通水后加热 先撤热源后停水
难溶于水
易溶于有机溶剂
随水蒸气一同蒸馏
鲜玫瑰花 + 清水
质量比1:4
温度不宜过高，时间不宜过短 温度太高时间太短，品质较差
水蒸气蒸馏
油水混合物
分离油层
除水
玫瑰精油
吸收去除水分
无水Na2SO4
利用水油分层
NaCl
过滤
压榨法提取橘皮精油
压榨法： 机械加压直接压榨
优缺点：成本低，易保留原料结构和功能，但分离困难，出油率低
破坏细胞结构
分解果胶
防止橘皮压榨时滑脱
（橘皮已干燥去水）
提高出油率
浸泡时间为10h以上
普通布袋过滤
滤去固体物和残渣
此时依然含有少量水+果蜡
为了使橘皮油易与水分离，还要加入相当于橘皮质量0.25%的NaHCO3和5%的Na2SO4 ，调节pH至7~8
石灰水浸泡
再次过滤
橘皮精油
漂洗
压榨
过滤
静置
5~10℃ , 7d
滤纸过滤
萃取法提取胡萝卜素
萃取法： 使芳香油溶解在有机溶剂中， 蒸发溶剂可获得芳香油
优缺点：出油率高，易分离。但有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量
胡萝卜素是橘黄色结晶，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂
工业提取天然β-胡萝卜素一般从植物、大面积养殖的岩藻或微生物发酵生产
萃取过程注意温度和时间
温度过高时间过长会导致胡萝卜素分解
有机溶剂分为水溶性和水不溶性
萃取胡萝卜素采用水不溶性溶剂 水浴加热，防止有机溶剂燃烧爆炸 注意应选择沸点较高的有机溶剂
胡萝卜中含β-胡萝卜素为主
一分子的β-胡萝卜素可以转化为两分子维生素A(治疗夜盲症)
萃取结果以纸层析法进行分析
常见萃取剂：
水溶性： 乙醇、丙酮等
脂溶性： 乙酸乙酯、乙醛、苯等
干燥利于与萃取剂 充分接触
粉碎
干燥
萃取
过滤
浓缩
胡萝卜素
胡萝卜
纸层析法进行胡萝卜素萃取实验的结果分析
不同色素在相同有机溶剂中溶解度不同，溶解度越大的色素，在层析纸上运动的速度越快
纸层析法进行胡萝卜素萃取实验的结果分析
不同色素在相同有机溶剂中溶解度不同，溶解度越大的色素，在层析纸上运动的速度越快
相同色素在相同有机溶剂中溶解度相同，层析相同时间，在层析纸上运动的距离应该 致
标样 萃取所得样品 标样
注意：
滤纸预先干燥处理，有利于层析液的扩散
点样快速细致，样点圆而细小，有利于形成规整的色素斑点 滤纸筒竖直边缘不能接触，防止层析液沿缝隙快速扩散
石油醚(层析液)易挥发，层析容器要密封
A B C D

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