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第3章 基因工程
第1节 重组 DNA 技术的基本工具
第2课时 重组 DNA 技术的基本工具（二）
若把两种异源DNA用同种限制酶来切割，会怎样？
会产生相同的黏性末端，可以进行碱基互补配对。
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
G
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G
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A
EcoRI
EcoRI
C
G
G
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T
A
A
A
A
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G
C
T
A
T
A
何酶能把这两缺口连接起来？
一、DNA连接酶——“分子缝合针”
1、作用：
连接互补配对的双链DNA片段，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
使之成为一个完整的DNA分子。
基因的针线：
DNA连接酶
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用EcoRI切割
DNA片段1
DNA片段2
重组DNA片段
一、DNA连接酶——“分子缝合针”
1、作用：
2、种类：
①E.coli DNA连接酶 ②T4 DNA连接酶
连接互补配对的双链DNA片段，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 只能连接____________ 可连接_________和________________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的____________ 从大肠杆菌中分离得到
从T4噬菌体中分离得到
黏性末端
黏性末端
平末端（效率低）
磷酸二酯键
使之成为一个完整的DNA分子。
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
3、DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
一、DNA连接酶——“分子缝合针”
4、DNA的连接酶、限制酶、聚合酶、解旋酶、水解酶的比较
项目 作用部位 作用对象 作用结果
连接酶
限制酶
聚合酶
解旋酶
水解酶
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
DNA片段
DNA
单个的脱氧核苷酸
DNA
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将两个DNA片段连接成完整DNA分子
切割双链DNA分子
将单个脱氧核苷酸连到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
一、DNA连接酶——“分子缝合针”
判断对错
（1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶连接起来。
（2）T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同。
（3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。
因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。
一、DNA连接酶——“分子缝合针”
讨论1：要让一个从甲生物细胞内取出来的外源基因怎样才能导入在乙生物体内(受体细胞)进行表达
能将外源基因送入细胞的工具就是运载体
讨论2：作为运载体，你认为该有的作用有哪些？
作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去。
利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。
二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
将外源基因（目的基因）转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
1、作用：
通常是用质粒、噬菌体、动植物病毒等可作载体。
2、种类：
病毒
二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有差别。
3、质粒——基因工程中常用的基因载体
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞核或原核细胞拟核DNA之外，具有自我复制能力的小型环状双链DNA分子。对宿主细胞没有影响，主要存在于细菌和酵母菌体内。其中最常用的是大肠杆菌质粒。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
质粒都可用作载体吗？
二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
4、运载体需具备的条件（同时具备）
①在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；
②具有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因（目的基因）插入其中；
③具有特殊的标记基因，便于筛选含有重组DNA分子的细胞；
④对受体细胞无害、易分离。
二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
重组DNA分子
请你根据图中的相关信息找到两条片段上EcoR I的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
若制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得
不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
重组DNA分子
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GCCGTATG…
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
重组DNA分子的模拟操作
EcoRⅠ
EcoRⅠ
EcoRⅠ
EcoRⅠ
EcoRⅠ
EcoRⅠ
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
GCCGTATG…
重组DNA分子的模拟操作
1、实验原理
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，可溶于2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
三、DNA的粗提取与鉴定
2、材料用具
新鲜洋葱（菜花、香蕉、菠菜、猪肝等，提取DNA的方法可能稍有不同）。
研磨液、体积分数为95％的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂（现配现用）和蒸馏水等。
哺乳动物的血液可以作为提取DNA的材料吗？
不可以。因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和线粒体等。
选用DNA含量相对较高的生物组织。
三、DNA的粗提取与鉴定
3、方法步骤
（1）研磨菜花
称取约30g切碎的菜花
加10mL研磨液充分研磨
研磨目的：破碎细胞，使核物质易溶在研磨液中
三、DNA的粗提取与鉴定
（2）过滤获取含DNA的上清液
在漏斗中垫上纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中
在4℃冰箱中放置几分钟后再取上清液。
低温放置的作用可抑制酶的活性以阻止DNA降解及运动，使之易形成沉淀析出。
也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
DNA会吸附在滤纸上，用纱布减少DNA的损失
三、DNA的粗提取与鉴定
（3）冷却酒精析出DNA
上清液加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA的降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
三、DNA的粗提取与鉴定
（3）冷却酒精析出DNA
上清液加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2~3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
防止将丝状DNA搅碎，不利于DNA絮状物的挑出
三、DNA的粗提取与鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。
然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
1号试管 2号试管
加入2mol/L NaCl 溶液 5mL 5mL
丝状物(DNA) 不加
用玻璃棒搅拌 无变化
加入二苯胺试剂 4mL 4mL
沸水浴 5min 5min
观察现象
不变蓝
变蓝
加入
丝状物溶解
（4）DNA的鉴定
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关
三、DNA的粗提取与鉴定
三、DNA的粗提取与鉴定
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
分析1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
分析2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
三、DNA的粗提取与鉴定
分析3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
实验结果不明显的可能原因：
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，
影响鉴定效果。
三、DNA的粗提取与鉴定
1、限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是( 　)
A.DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键
B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
B
2、下列关于质粒的叙述，正确的是（ ）
A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B.质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子
C.质粒只有在侵入宿主细胞后在宿主细胞内复制
D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行
B
课堂练习
3、质粒是基因工程最常用的载体，下列关于质粒的说法正确的是(　　)
A.质粒在宿主细胞内都要整合到染色体DNA上
B.质粒是独立于细菌拟核DNA之外的小型细胞器基因工程使用的质粒一定含有标记基因和复制原点
D.质粒上碱基数量之间存在A＋G＝U＋C
C
课堂练习
4、以下关于基因工程的说法，正确的是（　　）
A．限制酶可以切割DNA和RNA
B．T4 DNA连接酶只能“缝合”两个双链DNA片段间的黏性末端
C．载体的作用是将外源基因导入受体细胞，使之稳定存在并表达
D．切割质粒的限制酶均能特异性地识别6个核苷酸对
C
5、下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验原理的叙述正确的是（ ）
A.DNA在NaCl溶液中的溶解度，随NaCl溶液浓度的降低而减小
B.利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNA
C.DNA是大分子有机物，不溶于水而溶于所有有机溶剂
D.在沸水中，DNA遇二苯胺会出现紫色反应
B
课堂练习
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体、动植物病毒等
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
1、下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，不正确的是( )
A. DNA析出过程中，玻璃棒沿一个方向搅拌防止DNA断裂
B. 预冷的酒精溶液可用来粗提取DNA
C. 用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
D. 鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
D
2、作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件及理由是(　　)
A．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择
D．能在宿主细胞中稳定保存并复制，以便提供大量的目的基因
D
作业
3、在DNA析出与鉴定过程中，会出现白色丝状物，用玻璃棒搅拌时为什么要沿一个方向轻轻搅拌（ ）
A、为了省力
B、加快蛋白质的析出
C、为了加大DNA的溶解度
D、防止DNA结构被破坏
D
4、在DNA析出与鉴定过程中加入酒精的目的是（ ）
A、溶解DNA B、除去DNA中所有杂质
C、析出DNA D、稀释溶液降低浓度
课本74页1、2题
B
作业

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