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第3章 基因工程
第1节 重组 DNA 技术的基本工具
第1课时 重组 DNA 技术的基本工具（一）
胰岛素基因从人体细胞内提取出来
胰岛素基因与载体DNA连接
胰岛素基因导入大肠杆菌
培育能产生人胰岛素的大肠杆菌
大肠杆菌细胞
　　指按照人们的愿望, 通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
一、基因工程
1、概念：
一、基因工程
　　指按照人们的愿望, 通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
甲生物
取出优秀基因
“剪切”
“拼接”　
乙生物
表达　
新类型
新的生物产品　
一、基因工程
1、概念：
别名
操作环境
操作对象
操作水平
基本过程
操作工具
结果
原 理
优 点
基因拼接技术或DNA重组技术
生物体外
基因
剪切→拼接→导入→表达
人类需要的新的生物类型和生物产品
2、对基因工程概念的理解
基因重组
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状
分子运输车、分子手术刀、分子缝合针
DNA分子水平
一、基因工程
3、基因工程发展历程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
一、基因工程
（1）不同生物的基因为什么能拼接？
（2）外源基因为什么能在受体细胞中表达？
①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
②都遵循碱基互补配对原则。
③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
①基因是控制生物性状的独立遗传单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码。
相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质。
4、基因工程的理论基础
一、基因工程
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
从社会中来
非转基因番木瓜
转基因番木瓜
胰岛素基因从人体细胞内提取出来
胰岛素基因与载体DNA连接
胰岛素基因导入受体细胞（大肠杆菌）
培育能产生人胰岛素的大肠杆菌
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
基因工程的基本工具
二、DNA重组技术的基本工具
二、DNA重组技术的基本工具
“分子手术刀”—— 限制性内切核酸酶
“分子缝合针”—— DNA连接酶
“分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体
三、限制性内切核酸酶
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶（又称基因剪刀）。
——“分子手术刀”
限制酶名字的由来：
限制酶的命名是根据细菌种类而定：用生物属名的头一个字母(大写)与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。必要时加上菌株的标志字母，如EcoRⅠ的R。最后，若由此菌株可以得到的限制性核酸酶不止一种，则按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ编号。
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；
SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
三、限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
1、来源：
主要从原核生物中分离纯化来的
3、作用：
2、种类：
数千种
①识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
②使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
三、限制性内切核酸酶
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶（又称基因剪刀）。
——“分子手术刀”
氢键
磷酸
二酯键
分析DNA结构图，指出磷酸二酯键和氢键的位置和切割位点在哪？
作用部位：
特定切点上的磷酸二酯键
限制酶识别序列的长度多数为6个核苷酸（如EcoRⅠ、SmaⅠ），也有少数为4个或8个或其他数量。
识别序列长度：
三、限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
识别序列：
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
三、限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
1、来源：
主要从原核生物中分离纯化来的
3、作用：
4、特点：
特异性
5、结果：
形成黏性末端、平末端
2、种类：
数千种
①识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
②使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
三、限制性内切核酸酶
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶（又称基因剪刀）。
——“分子手术刀”
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
6、黏性末端和平末端的形成
中心轴线
（1）当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
黏性末端
EcoRⅠ
酶的切割位置
5’
5’
3’
3’
只能识别GAATTC序列，并在G与A之间切割
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端
三、限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
C C C G G G
G G G C C C
C C C
G G G
G G G
C C C
6、黏性末端和平末端的形成
中心轴线
酶的切割位置
（2）当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
SmaⅠ
5’
5’
3’
3’
只能识别CCCGGG序列，并在G与C之间切割
平末端
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口是平整的，这样的切口叫平末端
三、限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
思考1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
思考2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
思考3.限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子
会产生相同的黏性末端
三、限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
思考4.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
①原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原体的侵害。
②限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中起到切割外源DNA、使之失效的作用，从而达到保护自身的目的。
③因为限制酶识别DNA的特定核苷酸序列，所以不会伤害到自身的遗传物质。
三、限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
三、限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
思考5.原核生物的限制酶会切割自身的DNA吗？为什么？
不会。
通过长期进化的细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
三、限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
课堂练习
1、在基因工程操作中限制性内切核酸酶是不可缺少的工具。下列关于限制性内切核酸酶的叙述，错误的是（　　）
A．不同限制酶切割后，只能产生相同的黏性末端
B．限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取
C．限制性内切核酸酶的活性受温度和pH等因素的影响
D．一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列
A
2、如图所示，下列有关工具酶功能的叙述，错误的是(　　)
A．限制性内切核酸酶可以切断a处
B．DNA聚合酶可以连接a处
C．解旋酶可以使b处解开
D．DNA连接酶可以连接c处
D
课堂练习
3、下列四条DNA分子，彼此间能够“粘连”起来形成新的DNA分子的是（　）
A．①② B．②③
C．③④ D．②④
① ②
③ ④
课堂练习
D
1、关于基因工程中载体的叙述，错误的是(　　)
A．载体与目的基因结合的过程发生在细胞内
B．载体须具有一至多个限制酶切点，以便与外源基因连接
C．基因工程常用的载体有质粒、λ噬菌体和动植物病毒等
D．载体须具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择
A
作业
2、下列有关基因工程的叙述，正确的是(　　)
A．基因工程是细胞水平上的生物工程
B．基因工程的产物对人类都是有益的
C．基因工程育种的优点之一是目的性强
D．基因工程产生的变异属于人工诱变
C
3、下列关于限制性内切核酸酶的叙述错误的是（　　）
A．绝大多数的限制酶由原核细胞中获取
B．每一种限制性内切核酸酶只能识别特定的核苷酸序列
C．限制酶的作用位点是相邻核苷酸之间的氢键
D．同一种限制酶切割不同的DNA分子可产生碱基互补配对的粘性末端
C
作业
4、下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C．CTGCAG D．CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D

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