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第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第一章 发酵工程
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第二节 纯净的目标微生物可通过
分离和纯化获得
第2课时
目 录
调整培养基配方和培养方式可有目的地培养某种微生物
能分解尿素的微生物的分离与计数
(1)有些微生物需要以现成的有机物为食，如大多数细菌、真菌和原生动物。
(2)有些能利用光能或无机物氧化释放的能量将CO2转变为有机物。
(3)有些微生物为需氧型，有些微生物则是厌氧型。
(4)有些微生物能固氮，而大多数微生物不能以N2作为氮源。
(5)有些菌株由于突变或经人工诱变后丧失了合成某种特定化合物的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖。
一、调整培养基配方和培养方式可有目的地培养某种微生物
1．不同自然环境中生活着的微生物代谢类型不尽相同
在培养光能自养型的蓝细菌或藻类时，只需水和无机盐提供，不需提供有机物，但必须提供光照。
异养生物
自养生物
自养型微生物(蓝细菌和藻类或者硝化细菌)
异养型微生物(大多数细菌、真菌和原生动物)
需氧型微生物(醋酸杆菌)；厌氧型微生物(乳酸菌)
兼性厌氧型微生物(酵母菌)
固氮菌(以氮气作为氮源)；
非固氮菌(大多数微生物不能以氮气作为氮源)
常规微生物与营养(某种氨基酸)依赖型微生物
举例
(1)某些异养型微生物在有有机物存在的情况下可同时将CO2转变为自身的物质，它们只是不以CO2为唯一碳源(主要的)
(2)自养型微生物也并非不能利用有机物生长。
2．许多微生物的代谢方式并不唯一
这种营养方式的可变性提高了微生物在环境中的生存能力。
紫色非硫细菌
光照,无氧条件：CO2作为碳源；黑暗,有氧：利用有机物生长
3．培养基中营养物质的浓度及比例都会影响微生物的生长
小思考：如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
【答案】用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
①蔗糖浓度
②C/N
③N/P
在利用微生物发酵生产谷氨酸时，培养基中的C/N 为4∶1时菌体大量繁殖，当比值降为3∶1时，菌体繁殖减缓。
选择培养基
4.选择培养基
在培养基中添加（或减去）某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其它微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。
添加青霉素的培养基(筛选抗青霉素的超级细菌)
无氮培养基(筛选固氮菌)
以淀粉为唯一碳源的培养基(筛选淀粉分解菌)
以尿素为唯一氮源的培养基？
(筛选尿素分解菌)
使用选择培养基能从混杂的微生物群体中快速筛选出所需要种类的目标微生物，也可以从已知种类的混杂的细胞群体中筛选出特定的细胞。
二、能分解尿素的微生物的分离与计数
1、实验原理
当培养基中只有尿素作为氮源时，只有能分泌脲酶的微生物才能在该培养基中生长。
尿素（脲）是蛋白质降解的产物
氮是所有生物的必须元素。
尿素（脲）
C
NH2
NH2
O
，会对环境造成污染。
植物无法直接吸收利用尿素
土壤中某些细菌能分泌脲酶，可以通过降解尿素作为其生长所需要的氮源。
二、能分解尿素的微生物的分离与计数
1、实验原理
当培养基中只有尿素作为氮源时，只有能分泌脲酶的微生物才能在该培养基中生长。
尿素
中性
碱性
氨
根据菌落（固体培养基）周围是否出现红色区域，进一步鉴定尿素分解菌。在相同培养条件下，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。
红色
黄色
能生长的只有尿素分解菌么？如何确定？
酚红指示剂
2、实验目的要求
尿素培养基(以尿素为唯一氮源的培养基)
3、实验材料用具
土壤样品，蛋白胨，酵母提取物，NaCl，琼脂，琼脂糖，葡萄糖，K2HPO4，酚红，蒸馏水，尿素溶液，三角瓶，烧杯，培养皿，有塞试管，试管架，移液器，G6玻璃砂漏斗，装有75%酒精的广口瓶，涂布器，酒精灯，火柴，高压灭菌锅，恒温培养箱等。
从有哺乳动物排泄物的地方取得土样
琼脂为混合物含氮，
琼脂糖为纯净物，不含氮
对尿素进行过滤灭菌
琼脂和琼脂糖
琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂糖和琼脂果胶，还含有少量的含氮化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是：
①其主要成分不能被微生物利用；
②可使培养基固化；
实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被以非尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。
①制备培养基
4、实验步骤
②灭菌
③倒平板
④制备土壤细菌悬液
⑤接种---涂布分离
⑥培养
⑦观察
4、实验方法步骤
（1）制备培养基
LB全营养培养基
蛋白胨：1g
酵母提取液0.48g
NaCl：1g
琼脂：2g
尿素培养基
葡萄糖： 0.1g
NaCl： 0.48g
K2HPO4： 0.48g
琼脂糖： 2g
酚红： 1mg
尿素： 40mL
对照组
实验组
尿素在制备培养基阶段先不加
置于250mL三角瓶，加水至100 mL，三角瓶加上封口膜待灭菌
①LB固体培养基
高压蒸汽灭菌（121℃，1kg/cm2,15min）
②尿素固体培养基
G6玻璃砂漏斗过滤除菌（尿素）
两种培养基能否均用高压蒸汽灭菌法？
培养基灭菌
高压蒸汽灭菌
（112℃，500g/cm2,30min）
（2）灭菌
培养基灭菌
器具灭菌
蒸馏水灭菌--制备无菌水稀释细菌悬液
高压蒸汽灭菌（121℃，1kg/cm2,15min）
操作环境灭菌
（2）灭菌
（3）倒平板
培养基冷却至60 ℃，超净工作台内向尿素固体培养基中加入已灭菌的尿素溶液，摇匀后分装至4个培养皿，冷却至凝固。
LB固体平板，尿素固体平板各4个。
酒精灯旁
2个9ml无菌水
1g土壤
10-3, 10-4...
得10-2的菌悬液
99ml无菌水
（4）制备土壤细菌悬液
取土样1g
Q1:取得土样后需要灭菌（ ）
×
Q2:欲获得土壤中微生物，需要将土样放入水中震荡，使微生物分布在水中。此处所用的水要用（ ）
A、自来水
B、蒸馏水
C、无菌水
D、都可以
C
（4）制备土壤细菌悬液
取土样1g
10-2土壤稀释液
＋99ml 无菌水
震荡10 min
10-3土壤稀释液
取0.5ml
＋4.5ml 无菌水
10-4土壤稀释液
取0.5ml
＋4.5ml 无菌水
10-5土壤稀释液
梯度稀释
注意：取样时，尽量只取悬液。
（4）制备土壤细菌悬液
(5)接种
①标记（班级、姓名、日期、接种稀释度、 LB或尿素）
②手、超净工作台消毒
③涂布：用移液器按照稀释度由大到小的顺序依次取土壤稀
释液0.1ml，并在酒精灯火焰旁分别加入对应标记的培养皿
中用涂布器将稀释液均匀地涂布在培养基表面。
不按照稀释度由大到小的顺序依次操作会影响实验结果。如果先取用稀释度小的溶液，微生物浓度大，再用同一移液器吸取稀释度大的菌液，就会提高后者的细菌数目，从而导致较大的统计误差。
涂布器使用前如何灭菌？
保存在75%酒精中，酒精灯外火焰燃烧除酒精。
微量移液器的使用
第一档
第二档
严禁超越两端极限量程
使用结束后，将刻度调回最大量程
微量移液器的使用
（6）培养
倒置，37℃，24-48h
5.实验结果：
LB培养基
尿素培养基
在估算土壤中能分泌脲酶的微生物的数量时，应统计哪个稀释度的培养皿 为什么
应统计稀释度为10-3的3个培养皿中的菌落数后取平均值。因为这个浓度的培养皿中菌落数比较适中，计数的结果误差较小。
为什么同一稀释度下，LB培养基上的菌落数比尿素培养基上多？
为什么某一稀释度下，尿素培养基上只有部分菌出现红色圈？
能分解尿素的微生物的分离与计数
能分解尿素的微生物的分离与计数
1.不按照稀释度由大到小的顺序依次操作会影响实验结果。如果先取用稀释度小的溶液，微生物浓度大，再用同一移液器吸取稀释度大的菌液，就会提高后者的细菌数目，从而导致较大的统计误差。
2.应统计稀释度为10-3的3个培养皿中的菌落数后取平均值。因为这个浓度的培养皿中菌落数比较适中，计数的结果误差较小。
3. 这些微生物能够合成脲酶而将尿素分解成氨。氨可使培养基的碱性增强，培养基pH升高，含酚红指示剂的培养基变成红色。而且，红色环带与菌落面积之比越大，说明该菌落分解尿素的作用越强。
讨论（P21）
4.意见①：合理，因为自生固氮微生物能在固氮酶的作用下，将N2转化为可利用的氮源，故可在没有氮源的培养基上生长。
意见②：不合理，因为F培养皿中微生物总数相对少于E培养皿，所以如果延长培养时间，培养基仍有可能改变颜色。
意见③：不合理，这些可能是能直接吸收尿素并作为氮源的微生物。可以挑取培养基未变色区域的菌落，清洗除去细胞表面的培养基后接种在无氮源的培养基上，观察其生长情况，从而证明其是否为能固氮的微生物。
能分解尿素的微生物的分离与计数
讨论（P21）
(1)尿素固体培养基既是选择培养基也是鉴别培养基
(4)尿素遇高温会分解，所以需进行过滤除菌，然后加入经高压蒸汽灭菌的培养基中
(2)土样必须用无菌水进行稀释，否则无法判断最后菌种来源于未灭菌的水还是土壤
(3)每次稀释前，试管需进行充分振荡处理，目的是使菌体分布均匀
注意事项
（5）设置LB固体培养基的目的是说明土壤中存在大量微生物，但能分解尿素的微生物比例低
1.若培养基中出现5个带有红色区域的菌落，能不能说明都是同一种微生物？
思考：
可能是5种微生物，但都能合成脲酶，分解尿素
2.尿素固体培养基中若形成菌落，是不是说明活动成功？
因为有些固氮菌能直接利用空气中的氮气进行繁殖，最后形成菌落，所以还需观察菌落周围是否出现红色区域

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