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第2课时
第3章 基因工程
基因工程的基本操作程序（二）
人教版选择性必修3
1.能阐明将目的基因导入受体细胞的方法
2.能阐明目的基因的检测与鉴定的方法
3.了解PCR和电泳鉴定的基本原理，尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR产物
阐明将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定的方法
任务1：阅读教材P81“资料卡”及P82最后两段，回答以下问题，归纳总结将目的基因导入不同细胞的方法。
目标
一
（1）什么是转化？（2）农杆菌具有哪些适合介导转化的特点？（3）农杆菌转化法的过程是怎样的？（4）如何将目的基因导入大肠杆菌细胞？（5）培育乳腺生物反应器，应将目的基因导入动物的什么细胞？最常用的方法是什么？
阐明将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定的方法
任务1：阅读教材P81“资料卡”及P82最后两段，回答以下问题，归纳总结将目的基因导入不同细胞的方法。
目标
一
种类项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化过程
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞
受精卵
原核细胞
目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA中→表达
目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
三、将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入植物细胞
（1）农杆菌转化法
①农杆菌的特点：农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；农杆菌细胞内含有的 Ti 质粒上的 T - DNA 可转移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞染色体 DNA 上。
②转化过程：
（2）基因枪法
单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。将目的基因吸附在微小的金粒或钨粒表面，然后将微粒用基因枪高速射入受体细胞或组织。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
（3）花粉管通道法
将目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：显微注射技术
（2）常用受体细胞：受精卵
（3）基本操作程序：
将含有目的基因的表达载体提纯
获得受精卵
取卵
早期胚胎培养
胚胎移植
发育成为具有新性状的动物
显微注射
将目的基因导入微生物细胞
（1）原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。
（2）操作过程：对受体细胞的常用处理方法是氯化钙法。首先用Ca2+处理大肠杆菌细胞→感受态细胞→将重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态
细胞吸收DNA分子。
注意说明
①将基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌的常用方法是 Ca2+处理法。 Ca2+（或 CaCl2 溶液）对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。
②目的基因能否在植物细胞内稳定保存并表达的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体 DNA 上（原理是基因重组）。
③不同种类的受体细胞：对于植物来说，受体细胞可以是受精卵和体细胞；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，受精卵具有体积大、易操作、经培养可直接表达性状的优点。
【思考与讨论】
下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：
【提示】原因是农杆菌中的Ti质粒上的T DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。
（1）在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上的原因是什么？
【思考与讨论】
下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：
【提示】基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。
（2）将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
任务2：阅读教材82页，列表归纳目的基因的检测与鉴定方法
检测水平 操作对象 检测方法 检测目的
分子水平 检测目的基因是否稳定维持
检测目的基因是否成功转录
检测目的基因是否成功表达
个体水平 检测个体是否获得相应性状
受体细胞的染色体DNA
PCR技术
PCR技术
mRNA
提取蛋白质
抗原-抗体杂交
转基因的个体
抗虫、抗病接种实验
四、目的基因的检测与鉴定
（1）分子水平的检测
a.PCR等技术
在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。
检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
检测目的基因是否转录出了mRNA
b.抗原—抗体杂交技术
检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
（2）个体生物学水平的检测
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
【知识总结】
1.目的基因的检测与鉴定：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
实验原理
（1）DNA 片段的扩增
①利用 PCR 可以在体外进行 DNA 片段的扩增。
② PCR 利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制 DNA双链的解聚与结合。
③PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次 PCR一般要经历30次循环。
（2）DNA 片段的电泳鉴定
① DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
② PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中 DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、 DNA 分子的大小和构象等有关。凝胶中的 DNA 分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来。
材料用具
（1）仪器
（2）用具
PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
PCR仪
微量离心管
微量移液器
电泳装置
方法步骤
（1）DNA片段的扩增
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5 min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后1次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
10倍浓缩的扩增缓冲液 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1μL
20 μmol/L的引物I 2.5μL
20 μmol/L的引物II 2.5μL
H2O 28-33μL
1~5U/μL 的 Taq DNA 聚合酶 1~2U
模板DNA 5~10μL
总体积 50μL
（2）DNA片段的电泳鉴定
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
加样
电泳
观察记录
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，（一般配制质量体积比0.8%～1.2%）。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相，并与核酸分子量标准参照物比较被扩增产物的大小
注意说明
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
结果分析与评价1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。

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