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(共22张PPT)
第2课时
第3章 基因工程
基因工程的基本操作程序（一）
人教版选择性必修3
1.能概述PCR的原理、条件及过程
2.能能阐明基因表达载体的组成及构建过程
从社会中来
转基因抗虫棉（使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）
1997年,我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年,我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤
转基因抗虫棉的机制是抗虫基因（Bt基因）来源于苏云金杆菌，Bt基因表达的蛋白质具有杀虫活性。当害虫食用转基因抗虫棉花的时候，同时摄入Bt基因表达产生的蛋白质，这种蛋白质在害虫肠道内被激活，造成肠道穿孔，导致害虫死亡。
培育转基因抗虫棉的步骤有：
目的基因的筛选与获取、
基因表达载体的构建、
将目的基因导入受体细胞、
目的基因的检测与鉴定。
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
前提
核心
关键
保证
1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
目的基因
“杀虫基因”:
Bt抗虫蛋白基因
根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因。也可以是一些具有调控作用的因子。
一、目的基因的筛选和获取
（4）利用PCR技术扩增目的基因
（3）化学方法直接人工合成
（2）从基因文库中获取目的基因
（1）从生物组织中直接获取
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
2.目的基因获取的方法
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。①基因组文库：含有一种生物的全部基因。提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接基因表达载体导入受体菌中储存基因组文库②部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA反（逆）转录酶单链互补DNADNA聚合酶双链DNA片段与载体连接基因表达载体导入受体菌中储存cDNA文库构建基因文库来获取目的基因：人工合成目的基因
a反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下：
目的基因的mRNA
双链DNA（目的基因）
b化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：
蛋白质的氨基酸序列
反转录
mRNA的核苷酸序列
推测
目的基因的核苷酸序列
推测
目的基因
化学
合成
能简述PCR的原理、条件及过程
任务1：阅读教材77-79页结合PCR过程示意图，推测PCR反应的原理及所需的基本条件并列表比较PCR与细胞内DNA复制的异同。
目标
一
（1）变性（温度超过90 ℃）
（2）复性（温度下降到 50 ℃左右）
（3）延伸（温度上升到72 ℃左右）
模板、4种脱氧核苷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶
1.PCR的原理：
2.PCR反应所需的基本条件：
3.PCR反应的过程
DNA半保留复制
PCR扩增的过程
条件
能简述PCR的原理、条件及过程
任务1：阅读教材77-79页结合PCR过程示意图，推测PCR反应的原理及所需的基本条件并列表比较PCR与细胞内DNA复制的异同。
目标
一
项目 体内DNA复制 PCR扩增技术
解旋方式
场所
酶
温度条件
结果
相同点 解旋酶催化
DNA在高温作用下变性解旋
细胞内(主要在细胞核内)
PCR扩增仪内
解旋酶、DNA聚合酶
耐高温的DNA聚合酶
细胞内温和条件
需控制温度，在较高温度下进行
DNA分子
DNA片段或目的基因
(1)模板：均需要DNA的两条单链作为模板；
(2)原料：均为4种脱氧核苷酸；
(3)酶：均需DNA聚合酶
任务2：如图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
【思考与讨论】
1．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。
【提示】　第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。
第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
任务2：如图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
2．图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
【提示】第3轮；共需消耗2n－1对引物。
【知识总结】
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
能简述基因表达载体的组成及构建过程
任务：画出基因表达载体的结构模式图，标注各组成部分的名称和功能，运用“分子工具”,设计构建培育转基因抗虫棉所需的基因表达载体的流程
目标
二
【提示】基因表达载体的构建过程：
(1)首先用一定的限制酶切割载体。
(2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处(如图所示)
二、基因表达载体的构建
一个基因表达载体的组成，除了有目的基因外，还必须有启动子、终止子、标记基因等。
（1）目的基因：指外源DNA分子的有效片段
基因表达载体的组成
（4）标记基因的作用：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为标记基因。
（2）启动子：启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类所需的蛋白质。
（3）终止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段，是转录过程终止的信号。
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割
基因表达载体的构建过程
【思考与讨论】
1．构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
【提示】不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
【思考与讨论】
2．与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
【提示】可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。
【知识总结】
图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。

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