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第1课时
第3章 基因工程
重组DNA技术的基本工具
人教版选择性必修3
1.能概述基因工程的概念
2.能阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用
3.能阐明DNA粗提取的原理和方法
能概述基因工程的概念
任务：阅读下面情境资料，提出你的看法并依据你所学的遗传学知识阐明理由。
目标
一
【情境资料】
我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身能抵抗棉铃虫的棉花就能解决这个问题，棉花本身不具有“杀虫基因”而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。【提问】能否将苏云金杆菌的“杀虫基因”导入棉花细胞，使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？
【提示】能，因为①绝大多数生物的遗传物质都是DNA，不同生物的DNA分子的结构基本相同；②不同生物的基因在表达时都遵循“中心法则”，在受体细胞内定向表达；③所有生物共同一套遗传密码。
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
基因工程：
体外环境
操作环境：
原理：
基因重组
操作对象：
基因
操作水平：
分子水平
结果：
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
意义：
“分子手术刀”准确切割DNA分子“分子缝合针”“分子运输车”将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞任务1：阅读教材P71-72，梳理总结限制酶和DNA连接酶的相关知识。
能阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用
目标
二
1.限制性内切核酸酶有什么作用？限制酶的识别序列有什么特点？2.什么是粘性末端？什么是平末端？3.DNA连接酶的作用是什么 常用的DNA连接酶主要有哪两类 两者有何区别？
1.作用：能识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
黏性末端
黏性末端
5'
3'
5'
3'
T
A
G
G
T
A
T
C
C
A
磷酸二酯键
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
2.识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamHⅠ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
TaqⅠ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
3.切割结果
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；
当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端；
EcoR Ⅰ
中轴线
粘性末端
平末端
Sam Ⅰ
现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________ EcoRⅠ________
HindⅢ________ BglⅡ ________
GATC
AATT
AGCT
GATC
*思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
注意说明
（1）限制酶是一类酶而不是一种酶。
（2）限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不是氢键。
（3）限制酶具有特异性，任何一种限制酶都只能识别和切断特定核苷酸序列，这是由酶的专一性所决定的。
（4）限制酶主要存在于微生物中，尤其是原核生物中
（5）限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列
（1）作用：
（2）常用种类及作用
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
作用
相同点 大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
恢复的都是磷酸二酯键
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
拓展延伸
DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
比较项目 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
任务2：制作如下图的三个纸条，注意碱基稍微写大点，字母之间要留点空隙，便于裁剪，准备剪刀和胶带。根据限制酶和DNA连接酶的相关知识，完成下列任务
……ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC……
……TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG……
①绿色纸条
……TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC……
……AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG……
②红色纸条
……ATAGGATCCTATCCATGAATTCGGCATAC……
……TATCCTAGGATAGGTACTTAAGCCGTATG……
③橙色纸条
（1）用EcoRI酶来处理①②纸条的DNA分子，会得到怎样的黏性末端？
处理①得到
【提示】
片段2
片段1
处理②得到
片段3
2.再让用DNA连接酶把它们连接起来，会有哪些情况？（多个分子连接时只考虑两两连接的情况）
考虑以下几种情况：
片段1与片段1能否连接？如何连接？
片段2与片段2能否连接？如何连接？
片段1与片段2能否连接？如何连接？
单个片段3自身能否连接？如何连接？
片段3与片段3怎样连接？
总结：用一种限制酶切割DNA分子形成的两个DNA片段1与2，用DNA连接酶连接可出现以下几种情况：
①片段1可与片段2连接
②片段1反向后可与另一片段1连接
③片段2反向后可与另一片段2连接
【提示】
CTCGGTATG
GAGCCATAC
总结：
一个DNA分子两端都有同一个限制酶的识别序列，被限制酶切割后，可出现自身连接成环（环化）的现象
【提示】
（1）载体的作用：
一是作为运载工具，与外源基因（即目的基因）的 DNA 片段结合，将目的基因转移到受体细胞中；
二是在受体细胞内对目的基因进行大量的复制。
（2）常用的载体：
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（3）载体必须具备的条件：
(1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。
(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，而且每种酶的切割位点最好只有一个。
(3)具有标记基因：具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
(4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。大肠杆菌及质粒结构模式图（4）最常用的载体——质粒:质粒的来源：质粒存在于细菌和酵母菌等生物细胞中，最常用的是大肠杆菌质粒。质粒的本质：环状 DNA 分子，其基因属于细胞质基因。DNA的粗提取与鉴定
实验原理
（1）实验思路：
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
（2）实验原理：
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
方法步骤
（1）通过研磨释放 DNA
称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。
加入洗涤剂的目的是溶解细胞膜、核膜，释放出细胞内含物。加入食盐的目的是使构成染色体的核蛋白加速解聚，游离出 DNA 分子，并使 DNA 分子充分溶解于浓 NaCI 溶液中。
研磨液的成分一洗涤剂和食盐
（2）用预冷的酒精溶液提取 DNA
①在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。
②在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min ，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的 DNA 。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。
注意说明
（1）加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的 DNA 量就会减少。
（2）粗提取的 DNA 中可能含有少量的蛋白质等。
（3）析出 DNA 时必须用“冷酒精”。预冷的酒精具有以下优点：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制 DNA 降解；②抑制分子运动，使 DNA 易形成沉淀析出；③低温有利于增加 DNA 分子的柔韧性，减少其断裂。
（4）实验中出现的丝状物的主要成分是 DNA ，实际上每一根“丝”都是由许多 DNA 分子聚集在一起形成的，应用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，避免破坏 DNA 。
（5）为减少 DNA 的损失，过滤过程一般使用纱布。
（3）二苯氨鉴定DNA
试管编号 A（对照组） B（实验组）
步骤1 2 mol/L的NaCl溶液5mL 2 mol/L的NaCl溶液5mL
步骤2 不进行任何处理 加丝状物或沉淀物
步骤3 加入4mL二苯胺试剂，混匀 加入4mL二苯胺试剂，混匀
步骤4 沸水浴5 min 沸水浴5 min
实验现象 溶液不变蓝色 溶液逐渐变为蓝色
实验结论 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色 DNA的鉴定
DNA鉴定的结果
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。结果分析与评价
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用：把两条双链DNA片段拼接起来

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