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第6课时
基因工程的基本工具和基本操作程序
1.基因工程的概念
别名 技术
操作环境 生物体外
操作对象 ______
操作水平 水平
结果 创造出更符合人们需要的新的 和__________
重组DNA
基因
DNA分子
生物类型
生物产品
一、重组DNA技术的基本工具
2.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
黏性末端
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
细菌的限制酶不切割自身DNA,原因是细菌细胞内自身的限制酶识别位点进行了修饰(如果DNA甲基化),或是不存在该酶的识别序列以避免被限制酶切割。
(2)DNA连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端
黏性末端
与DNA有关的几种酶的比较
归纳
提升
(3)载体
环状双链DNA分子
噬菌体
有一个至多个
自我复制
受体DNA
标记
注意 天然的质粒一般不完全具备上述条件,往往需要进行人工改造后才能用作基因工程载体。
2.质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是
A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B.在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点
C.携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随
后者的复制而复制
D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
√
p365
(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。
　用限制酶Ⅱ切割目的基因，用
限制酶Ⅰ切割质粒。
限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的
识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。
限制酶Ⅰ的识别序列和切点
限制酶Ⅱ的识别序列和切点
延伸
应用
图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
延伸
应用
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
不溶于
2 mol/L
二苯
胺
二、DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
(2)操作流程
95%
沸水
1.过滤时应选用纱布而不是滤纸,如果用滤纸可能会把DNA分子吸附在滤纸上。
2.低温操作能防止DNA酶降解DNA。
3.粗提取的DNA可能含有核蛋白、多糖等杂质。
2.PCR 和扩增目的基因
a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行 的技术。
b.PCR反应的条件：一定的 、DNA模板、2种 、4种______ 、 DNA聚合酶，以及能自动调控 的仪器。
获取
DNA半保留复制
组分
大量复制
缓冲溶液
引物
脱氧
核苷酸
耐高温的
温度
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR缓冲溶液中一般要添加Mg2+。
c.PCR扩增的过程
90
单链
50
引物
72
由图可知,理论上通过三次循环可以得到目的基因。
PCR的结果
(1)合成DNA的数量:a×2n(a:初始数量;n:循环的次数)。
(2)合成目的基因的数量:a×(2n-2n)。
思考　PCR可以扩增mRNA吗
mRNA不可以直接扩增,需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
（3）PCR产物的鉴定：常采用 来鉴定。
琼脂糖凝胶电泳
知识拓展 引物的选择原则
1.引物长度适宜、适量的CG含量(保证有较高的复性温度)、引物自身及引物之间不存在互补配对、引物的3'端必须和DNA模板严格互补配对,5'端不需要与DNA模板严格互补配对,5'端可以修饰。
5'端修饰方法 作用
加入限制酶酶切位点 可以利用限制酶切割产生末端,方便基因重组
放射性同位素、生物素、荧光素等标记物 方便扩增产物的检测
增添、缺失或替换部分碱基 可以产生定点突变
3.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了 原理。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。
DNA的热变性
相反
大小和构象
(2)PCR实验操作步骤
微量移液器
底部
离心管
(3)DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为______的紫外灯下被检测出来。
300 nm
针对训练
6.(2022山东,13)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。 (　 )
7.(2022湖北,5)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。(　 )
8.(2022辽宁,12)PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。 (　 )
9.(2019江苏,10)用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热。 (　 )
10.(2022全国乙,38)(1)检测病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是　　　　　 ,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。
(2)为了确保病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据病毒RNA中的　　　　　　　 　　 来进行。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步是　　　。
√


√
逆转录酶
特异性核苷酸序列
复性
11.(2020山东,25)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响,科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经　　　 过程获得总cD-NA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA,原因是　　　　　　 　　　　　　　　 。
逆转录
引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或:引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)
12.(2019全国Ⅰ,38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是　　　 。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是　　　　　 。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的　　　 。
(2)目前在PCR中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　 。
解旋酶
加热至90~95 ℃
氢键
Taq DNA聚合酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
13.(2018江苏,32)(1)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的　　　 端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中　　　 的设定与引物有关,　　　 的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度　②复性温度　③延伸温度　
④变性时间　⑤复性时间　⑥延伸时间
　使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连
5'
②　
⑥

15.如图为RBD基因结构和引物位置示意图,若利用PCR扩增含有限制酶酶切位点的RBD基因时,应选择的引物为　　　　 。

14.如图,应选择引物　　　 扩增目的基因。
甲和丙
引物4和引物5
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用 和序列比对工具进行筛选。
性状
表达产物
结构和功能清晰
序列数据库
三、基因工程的基本操作程序
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代
启动子
标记基因
知识归纳
1.有时为了满足需要,会在载体中人工构建诱导型启动子,当诱导物存在时,可以激活或抑制目的基因的表达。
2.构建乳腺生物反应器的表达载体时,重组表达载体中需含有在乳腺中特异性表达的启动子,以便目的基因在乳腺中特异性表达,从而可在动物的乳汁中获得目的蛋白。
易混易错 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
位置 DNA DNA mRNA mRNA
目的基因上游 目的基因下游 编码序列首端三个碱基 编码序列尾端三
个碱基
作用 RNA聚合酶识别
和结合的部位,起
始基因的转录 使转录停止 翻译的起始信号(编码氨基酸:甲硫氨酸) 翻译的结束信号
(不编码氨基酸)
构建过程

疑难探究
思考 构建基因表达载体时,常使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒,该过程不使用同一
种限制酶的原因是什么
提示 防止目的基因自身环化和质粒自身环化,保证目的基因与质粒正确连接。因为同种限制酶酶
切产生的末端相同,会产生正连和反连(反连时,目的基因的转录从下游到上游,导致密码子改变,不
能翻译出正确的蛋白质)的情况,增大筛选正确重组载体的工作量。 正连和反连图示如下:

方法技巧

图乙
结合图甲、图乙可知:最宜选用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。
注:若用Ti质粒,目的基因必须插入T-DNA序列。
图甲
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法、____________ 显微注射法 处理法
受体细胞 ________________ _______ 原核细胞
花粉管通道法
体细胞或受精卵
受精卵
Ca2＋
转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
4.目的基因的检测与鉴定
17.(2022湖北,24)改造过的用农杆菌侵染品系甲叶片外植体,其目的是　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　 。
18.(2021辽宁,24)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使其处于
　　　　　　　　　　　　　 的生理状态,以提高转化效率。
针对训练
16.(2022全国乙,38)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗,可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　 。
获得目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→
目的基因的检测与鉴定
通过农杆菌的转化作用,使目的基因进入植物细胞
一种能吸收周围环境中DNA分子
19.(2020北京,17)C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接,克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma Ⅰ和BamH Ⅰ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图中酶切位点1和2所对应的酶分别是
　　　　　　　　　　　
BamH Ⅰ、Sma Ⅰ

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