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(共56张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
从基因文库中寻找
聚合酶链式反应（PCR）扩增
目的基因的核苷酸序列未知
目的基因的核苷酸序列已知
（一）目的基因的筛选与获取
PCR原料
PCR过程
PCR过程引物：一小段可以和目的基因互补配对的脱氧核苷酸链模板DNA:含有目的基因的一段DNA片段原料:四种脱氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）Taq酶：具有热稳定性的DNA聚合酶过程：分变性、复性、延伸三步骤 PCR引物设计原则
⑤
PCR引物设计原则
使用的两种引物的序列不相同
两种引物都结合在DNA模板链的_____端
引物长度要适宜
引物GC含量要适宜
引物自身不应存在互补序列
两条引物之间不应存在互补序列
引物5'端可以修饰，3'端不可修饰
退火温度要适宜
需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点
3’
针对训练-1
针对训练-1
PCR过程
一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：
①子代DNA分子中等长链DNA分子数为：______个
②子代DNA分子中不等长链DNA分子数为：_______个
③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：_______个
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个
⑤复制过程中共需引物________个
⑥第n次复制需要引物_________个
2n-2n
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
PCR扩增DNA规律
PCR产物检测
PCR技术与DNA复制的比较
DNA复制 PCR技术
场所
原理
条件
解旋方式
酶
特点
结果
碱基互补配对原则
碱基互补配对原则
四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP
四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化解旋
半保留复制、边解旋边复制
半保留复制、全解旋再复制
体外复制
主要在细胞核内
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等
思考：用PCR可以扩增mRNA吗？
课后练习
课本，P83，概念检测-2
课本，P83，拓展-2
（二）基因工程的核心:基因表达载体的构建
①单酶切
单酶切缺点:
质粒重新环化
目的基因自身环化
质粒与目的基因反向连接(后果)
a
b
a
b
②双酶切的优点:
防止质粒重新环化
防止质粒与目的基因反向连接
防止目的基因自身环化
思考
目的基因为什么要插在启动子的下游？
转化的方法：
（三）将目的基因导入受体细胞
（1）导入植物：农杆菌转化法，花粉管通道法
（2）导入动物细胞：显微注射技术
（3）导入微生物细胞：Ca2+处理法
农杆菌转化法
感染对象：感染双子叶植物和裸子植物
转化原理：
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
导入
植物细胞
插入
植物细胞染色DNA
表达
新性状
转入
农杆菌
目的基因插入到Ti质粒的T—DNA上
农杆菌转化法中有两次拼接和两次导入:
第一次拼接: 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位；
第二次拼接(非人工操作): 指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
第一次导入: 是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作):是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
花粉管通道法
将目的基因导入动物细胞：显微注射法
目的基因表达载体提纯
取卵(受精卵)
显微注射法
胚胎早期培养
胚胎移植
转基因动物
（四）目的基因的检测与鉴定
DNA杂交的原理
抗原和抗体杂交
个体水平检测
典例-1
针对训练-3
典例-2
典例-2
针对训练-1
针对训练-2
针对训练-3
针对训练-4
针对训练-5
针对训练-6
重点模型-1：双标记法筛选阳性菌落
【检测】某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切后,与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌．回答下列问题：
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_________________________
(答出两点即可)。而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。
能自我复制、具有标记基因
【检测】某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切后,与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_______________________________
______________________________________；
二者均不含有氨苄青霉素抗
性基因，在该培养基上均不生长。
【检测】某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切后,与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:
并且________________和_________________
的细胞也是不能区分的，其原因是：_______________________________________
_______________________________________；
含有质粒载体
含有重组质粒
二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。
【检测】某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切后,与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有__________的固体培养基．
四环素
如何筛选出插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落？
在含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，产生一些菌落，然后将这些菌落按照原来的位置转移到含有四环素的培养基上进行培养，一段时间后，某些菌落将会出现停止增殖的现象，
这些菌落的位置在含氨苄青霉素的培养基中对应的位置的菌落即为插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落。
针对训练-1
针对训练-1
重点模型-1：蓝白斑法法筛选阳性菌落
选三课本，98页，第一题。
DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
1.实验原理
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
温故知新提问
1.基因工程的概念？又名？原理？操作水平？优点？
2.重组DNA技术的基本工具？工具酶？
3.限制酶的来源？本质？ 作用？作用的化学键？结果？
4.DNA连接酶的本质？作用？作用的化学键？种类？
各种类的不同（来源，作用）？
5.一个基因从DNA分子上切下来，需要切 处，产生 个黏性末端，
断 个磷酸二酯键，需要 个水。
6.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：相同点？不同点（模板，作用过程）？
7.载体的本质？种类？作为载体需要的条件？
8.什么是质粒？
9.DNA粗提取的原理？鉴定的原理？方法步骤
1.基因工程的操作步骤？核心？
2.目的基因？筛选目的基因有效的方法之一？
3.获取目的基因的方法？常用的方法？
4.PCR的全称？概念？原理？条件？过程（具体）？引物的作用
5.基因表达载体构建的目的？过程？
6.基因表达载体的组成包括？
启动子的本质、位置、功能？终止子的本质、位置、功能？
7.转化的概念？目的基因导入动物 细胞，方法是？
目的基因导入微生物细胞时，如何处理细胞？目的？
目的基因导入植物细胞常用的方法？
8.农杆菌转化法的原理？目的基因的插入位置？农杆菌转化法的过程？
9.目的基因检测与鉴定：哪两个水平？分子水平要检测什么，各用方法？
基础知识提问
原核基因与真核基因

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